Diskret model

Væksten af en mikrobiel koloni, der forbruger et diffunderende næringsstof, repræsenteres ved hjælp af den gitterbaserede model, der blev introduceret af Matsuura23, og hvis detaljer er beskrevet i afsnit 3. Kort fortalt betragter vi et rektangulært gitter med L x- og L y-steder i henholdsvis x- og y-retningen. Antallet af besatte celler betegnes ν med den tilsvarende celletæthed ρ = ν/(L x L y ). Hvert element i det rektangulære gitter kan højst rumme én celle, men kan indeholde et vilkårligt ikke-negativt helt tal af næringsstofpartikler, uanset om der også er en celle på det pågældende sted. Ved hvert tidstrin kan gærcellerne absorbere en næringsstofpartikel, der befinder sig på samme sted, og producere en enkelt dattercelle på et tilstødende sted i en kardinal retning, mens næringsstofpartiklerne kan tage s trin, igen i de kardinalretninger. Som en indledende betingelse udsås cellerne i gitteret i et foreskrevet mønster, mens et antal næringsstofpartikler placeres jævnt tilfældigt inden for området for at give en bestemt gennemsnitlig indledende koncentration c0. Domænets grænser behandles som faste vægge, hvilket afspejler den eksperimentelle adfærd i en petriskål. Det er vigtigt, at de mønstre, der produceres af denne model, udelukkende er resultatet af interaktionen mellem cellerne og næringsstoffet, således at eventuelle uensartede morfologier, der produceres af modellen, udelukkende kan tilskrives DLG.

Karakteristiske DLG-morfologier

Matsushita & Fujikawa12 brugte en koloni af B. subtilis-celler til at illustrere tre nøglefænomener, der opstår som følge af DLG: (I) “screening” af kortere grene af længere grene; (II) afstødning mellem nabokolonier; og (III) vækst rettet mod en næringsstofkilde (Fig. 2). Det er tidligere blevet vist, at disse træk opstår som følge af DLG alene ved hjælp af en gitterbaseret model for kolonivækst, der ligner den model, der er anvendt her30. Vi bekræfter først, at den ovenfor beskrevne diskrete model kan reproducere denne adfærd, før vi bruger denne model til at kvantificere de fremkomne mønstre.

Eksperimentelle resultater af Matsushita & Fujikawa12 (øverste række) med tilsvarende modelsimuleringer (nederste række). Vist er (a) større grene, der skærmer mindre grene fra næringsstoffet (fænomen I), (b) to kolonier, der er sået tæt på hinanden, og som ser ud til at frastøde hinanden (fænomen II), og (c) en enkelt koloni, der vokser mod næringsstofkilden i højre side af petriskålen (fænomen III). Simuleringer af (d) afskærmningsgrene, (e) to kolonier tæt på hinanden og (f) vækst med næringsstoffet i højre side er beregnet ved hjælp af den gitterbaserede model. Frøcellerne er markeret med en rød prik. Simuleringerne blev beregnet på gitter med dimensionerne L x = L y = 200 med parametrene s = 3 og c0 = 1, hvilket resulterer i en værdi af Δ af samme størrelsesorden som i eksperimenterne. Figur 2(a), 2(b) og 2(c) er gengivet fra Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 168, Mitsugu Matsushita and Hiroshi Fujikawa, Diffusion-limited growth in bacterial colony formation, 498-506, 1990, med tilladelse fra Elsevier.

Interaktionen mellem cellerne og næringsstoffet kan kvantificeres bredt ved at sammenligne den relative spredningshastighed af disse to størrelser. Koloniens vækst måles ved at beregne den gennemsnitlige ændringshastighed i koloniarealet Δ m set fra oven, som har samme enheder som en diffusivitet. Denne størrelse kan let beregnes ud fra et eksperimentelt billede eller ud fra simulerede data, som f.eks. dem, der fremkommer ved hjælp af den diskrete model. Spredningen af næringsstoffet Δ n antages at være diffusiviteten af glukose, da dette almindeligvis anvendes som næringsstofkilde, og der er ringe forskel på diffusiviteten af forskellige næringsstoffer. Glukosens diffusivitet i vand er kendt for at være ca. \({D}_{0}=4,03\ gange {10}^{-2}\)mm2 min-1, baseret på eksperimentelle observationer36. For glukose i en agargel med lav densitet er diffusiviteten givet ved

hvor w er vægtprocenten af agar37. Hvis man antager, at w = 0,3 %, er diffusiviteten 4,01×10-2 mm2 min-2, hvilket er den værdi, der er anvendt i resten af denne undersøgelse. Diffusiviteten ændrer sig kun lidt med mængden af agar, og derfor har w en ubetydelig indvirkning på resultaterne. Ud fra disse mængder beregner vi forholdet

som giver et dimensionsløst mål for de relative spredningshastigheder. Ved små værdier af Δ diffunderer næringsstoffet på en hurtigere tidsskala end cellevæksten, hvilket betyder, at eventuelle lokale variationer i næringsstofkoncentrationen vil forsvinde uden at påvirke koloniens morfologi. En Δ-værdi på 1 eller derover angiver, at cellevæksten sker med en hastighed, der er mindst lige så stor som næringsstofdiffusionen, og at lokale variationer i næringsstofkoncentrationen kan have indflydelse på koloniens morfologi. Af de tre eksperimentelle billeder er det kun billedet af den rettede vækst, der indeholder tilstrækkelige oplysninger om både skala og tid, der er nødvendige for at beregne Δ. Ud fra dette billede finder vi, at Δ ≈ 0,23. Indstilling af s = 3 og c0 = 1 i modellen giver løsninger med værdier for Δ på mellem 0,3 og 0,5, hvilket er af samme størrelsesorden som de eksperimentelle resultater og dermed giver en passende sammenligning. Disse parameterværdier anvendes i resten af dette underafsnit. Adfærden i hvert af de tre tilfælde kvantificeres yderligere ved hjælp af rumlige indekser, som beskrives nedenfor, i lighed med Binder et al.38 . Hver simulering anvender et gitter med dimensionerne L x = L y = 200, som er stort nok til at frembringe træk med tilstrækkelig opløsning, samtidig med at det er beregningseffektivt.

For at undersøge grenafskærmning (fænomen I), sås næringsstof ensartet tilfældigt ud over domænet, og en enkelt celle placeres i midten af gitteret. Simuleringen køres, indtil den samlede celletæthed når 0,2, hvilket illustreres af den repræsentative koloni, der er vist i fig. 2. Denne koloni har store grene, der udgår fra den oprindelige centrale celle, med kortere grene imellem, som er blevet afskærmet fra næringsstoffer af de større grene, og den viser en betydelig uensartet vækst. Dette svarer til den adfærd, der er observeret af Matsushita & Fujikawa12. Morfologien kan kvantificeres ved først at tælle vinklerne til hver celle målt mod uret fra en vis referencevinkel med oprindelsen placeret ved massecentret. Tællingerne skaleres med de forventede værdier for celler, der er fordelt ensartet tilfældigt, og vinkelindekset for uensartet vækst I θ er defineret som standardafvigelsen af de skalerede tællinger, således at større værdier af I θ angiver større niveauer af uensartet vækst. Det eksperimentelle billede har indeks 0,18, mens simuleringen har indeks 0,2, hvilket indikerer, at de to er i tæt overensstemmelse.

For tilfældet med frastødende kolonier (fænomen II) er næringsstoffet igen placeret ensartet tilfældigt på tværs af domænet. To frøceller placeres lodret centreret inden for domænet, hver en ottendedel af domænets bredde væk fra midten horisontalt, således at cellerne er adskilt af en fjerdedel af den samlede domænebredde. Simuleringen beregnes, indtil den samlede celletæthed når op på 0,2. En typisk simulering er vist i fig. 2, som viser den afstand mellem de to kolonier, der er observeret af Matsushita & Fujikawa12. Afvisende kolonier kan kvantificeres ved at tælle det samlede antal celler ν og antallet af celler ν c mellem de to frøceller i slutningen af simuleringen. Indekset for frastødning defineres derefter som I c = 1 – ν c /ν, som er tæt på 0,5, når de to kolonier vokser ensartet, mindre end 0,5, når der dannes en kløft, og større end 0,5, når kolonierne viser en præference for at vokse mod hinanden. Frøcellens placering for hver koloni i det eksperimentelle billede er tilnærmet ved at tegne linjer langs grenene og identificere, hvor disse skærer hinanden. Det eksperimentelle billede og simuleringen har indeks 0,19 og 0,27, hvilket tyder på, at de begge producerer lignende vækstmønstre med en betydelig afstand mellem de to kolonier.

Dirigeret vækst (fænomen III) simuleres ved indledningsvis at placere alle næringsstoffer i domænets yderste højre kolonne med en enkelt celle placeret i midten af domænet. Simuleringen beregnes derefter, indtil celletætheden når op på 0,1. En typisk koloni er vist i fig. 2, som minder meget om det eksperimentelle resultat fra Matsushita & Fujikawa12. For at måle bias mod den ene side af domænet beregner vi andelen I b af celler på højre side af domænet i forhold til det samlede antal celler, således at I b ∈ . Værdier af indekset I b tæt på 0,5 angiver ringe bias, mens I b < 0,5 angiver bias mod højre side, og I b < 0,5 angiver bias mod venstre side. Det eksperimentelle billede har indeks 0,92, hvilket stemmer nøje overens med simuleringsindekset på 0,93. I begge tilfælde indikerer indeksene en stor vækstbias mod den oprindelige næringsstofplacering.

Som fundet af Ginovart et al.30 viser de gode kvalitative overensstemmelser mellem de eksperimentelle billeder og simuleringerne, at DLG alene kan frembringe screening, afstødning og rettet vækst af B. subtilis-kolonier. Vi har yderligere styrket denne sammenligning ved hjælp af en kvantitativ sammenligning mellem eksperimenterne og en matematisk model. Vi forventer således, at disse fænomener er til stede, når DLG påvirker morfologien, mens fraværet af disse træk tyder på, at andre mekanismer er ansvarlige for vækstmønsteret. Afgørende er, at overensstemmelsen mellem den diskrete model og den model, der er foreslået af Ginovart et al. viser, at den diskrete model, der er anvendt her, giver en tilfredsstillende repræsentation af DLG og dermed kan bruges til at kvantificere denne adfærd.

Induktion af DLG

Når vi har vist, at den diskrete model er i stand til at gengive DLG-adfærd, kvantificerer vi her disse fænomeners afhængighed af modelparametrene for at forudsige, hvornår DLG-effekter vil opstå. Kolonierne simuleres igen på et gitter med dimensionerne L x = L y = 200 ved hjælp af de samme tre startbetingelser og stopkriterier som i det foregående afsnit. Simuleringerne gentages 50 gange for hvert par næringsstoftrin s = 1, 5, …, 37 og indledende koncentrationer c0 = 1, 2, …, 7. For hvert parameterpar beregner vi det relevante gennemsnitsindeks over de 50 realiseringer.

For at undersøge screening af grene (fænomen I) betragter vi kolonier, der er vokset fra en enkelt celle i et ensartet næringsstoffelt, med de tilsvarende værdier gennemsnitsindeksværdier \({\bar{I}}_{\theta }\) over de 50 realiseringer vist i fig. 3. De største værdier af \({\bar{I}}}_{\theta }\) opstår, når både s og c0 er små, hvilket skyldes to faktorer. For det første, fordi næringsstofdiffusionen, effektivt s, er lille i forhold til cellevæksthastigheden, opstår der udsving i næringsstofniveauerne på tværs af domænet. For det andet betyder den lave indledende næringsstofkoncentration c0, at disse udsving skaber områder, hvor næringsstofniveauet er for lavt til at understøtte cellevækst. Når enten s eller c0 er større, kan mindst en af disse forhold ikke forekomme, og værdien af \({\bar{I}}_{\theta }\) bliver mindre, hvilket indikerer, at DLG ikke længere har en betydelig indflydelse på kolonien. Disse resultater viser således, at uensartede mønstre kun kan forekomme, når både næringsstofdiffusionen i forhold til cellevæksthastigheden og næringsstofkoncentrationen er lille.

Målinger af DLG-effekter i simulerede mikrobielle kolonier. Alle simuleringer er beregnet ved hjælp af den gitterbaserede model med en række næringsstoftrin s og indledende næringsstofkoncentrationer c0. Vist er (a) gennemsnitsindekset \({\bar{I}}}_{\theta }\) for grenscreening (fænomen I), (b) gennemsnitsindekset \({\bar{I}}}_{c}\) for afvisende kolonier (fænomen II) og (c) gennemsnitsindekset \({\bar{I}}}_{b}\) for rettet vækst (fænomen III).

Samme opførsel observeres for det frastødende tilfælde (fænomen II), som det fremgår af det gennemsnitlige indeks \({\bar{I}}}_{c}\), der er plottet i fig. 3. De største værdier af indekset findes ved små værdier af s og c0, hvilket sker af samme årsager som for \({\bar{I}}}_{\theta }\).

Adfærden for rettet vækst (fænomen III) er anderledes, som det fremgår af det gennemsnitlige indeks \({\bar{I}}}_{b}\) vist i Fig. 3. Ved små værdier af s er indekset \({\bar{I}}_{b}\) stort og varierer kun lidt med c0. Når s stiger, falder \({\bar{I}}}_{b}\) og viser større afhængighed af c0, med større værdier af \({\bar{I}}}_{b}\) ved lavere c0. Det interval af parameterværdier, over hvilket der kan observeres rettet vækst, er meget større end for de to andre DLG-fænomener. Hvis der ikke forekommer rettet vækst, vil de to andre fænomener derfor heller ikke gøre det, og derfor er rettet vækst en nyttig første kontrol af DLG, som er enkel at måle. Dette træk vil blive brugt til at teste for DLG i resten af dette arbejde.

Kontinuumsmodel

Den fremkomst af DLG-fænomener afhænger både af næringsstofkoncentrationen og diffusiviteterne af de to arter. Mens indeksene måler disse fænomeners afhængighed af antallet af diskrete næringsstoftrin s og den oprindelige næringsstofkoncentration c0, kunne værdien af Δ kun beregnes ud fra de simulerede data og ikke specificeres som input til modellen. Når der tages hensyn til eksperimentelle data, er det imidlertid naturligt at karakterisere den relative spredning af cellerne og næringsstoffet ved hjælp af Δ, da dette let kan måles ud fra eksperimentelle billeder. Vi introducerer her et deterministisk system af reaktions-diffusionsligninger, der modellerer celletætheden og næringsstofkoncentrationen og gør det muligt at specificere de relative diffusiviteter for hver mængde, hvilket svarer til at indstille Δ. Selv om denne model ikke er egnet til at indfange de fine træk, der er observeret i fig. 2, er den i stand til at gengive den målrettede vækst mod en næringsstofkilde (fænomen III), som viste sig at opstå over det største parameterområde. Vi fokuserer derfor på dette aspekt af DLG, der fungerer som et let målbart tegn på, at DLG forekommer.

Vi betragter et endimensionelt domæne, hvilket er tilstrækkeligt til at illustrere modellens generelle adfærd29,32,39. Ved hjælp af den dimensionsløse position x, tiden t, celletætheden n(x,t) og næringskoncentrationen g(x,t), der er beskrevet i afsnit 3, reduceres de styrende ligninger til

Parameteren D = D m /D n er forholdet mellem cellediffusiviteten D m og næringsstoffets D n . Dette svarer til definitionen af Δ (2), idet cellediffusionsevnen anvendes i stedet for den målte ændringshastighed i koloniarealet. Det første udtryk på højre side af begge ligninger repræsenterer bidraget fra diffusion, mens de andre udtryk repræsenterer henholdsvis forbruget af næringsstof og væksten af nye celler, hvor c er den dimensionsløse mængde næringsstof, der forbruges pr. ny celle.

Som initialbetingelser placeres cellerne i midten af domænet med næringsstoffet biased mod højre i henhold til

hvor N kan fortolkes som en dimensionsløs næringsstofkoncentration. For at illustrere den generelle adfærd er begyndelsesbetingelserne for N = 1 vist i figur 4.

Resultater fra den endimensionale reaktions-diffusions-model. (a) Den indledende tilstand for N = 1 viser, at cellerne er koncentreret i midten af domænet med næringsstoffet til højre. (b) De maksimale værdier af I b frem til tidspunkt t = 1, plottet mod base 10-logaritmen af D og N, tyder på, at DLG kun forekommer ved bestemte parameterværdier. To repræsentative eksempler er vist markeret. (c) Ved den største værdi af I b, når D = 10-6 og N = 1, er cellerne stadig næsten symmetriske omkring x = 0, mens næringsstofkoncentrationen er blevet effektivt ensartet. (d) Anvendelse af D = 10-0,5 og N = 105 resulterer i en betydelig skævhed mod højre side, hvor næringsstoffet oprindeligt var koncentreret.

Hvis de typiske parameterværdier, der er angivet i afsnit 3, betragtes som faste, varierer værdien af N kun som følge af den fysiske næringsstofkoncentration. Hvis man betragter et medium, der kun indeholder næringsstoffer, og som repræsenterer en maksimal koncentration, finder man, at værdien af N ikke kan være større end ca. 105. Der beregnes således løsninger for 1 ≤ N ≤ 105. Mens typiske eksperimentelle observationer tyder på, at 10-3 ≤ D ≤10-1, overvejer vi værdier for 10-6 ≤ D ≤103 for at give en teoretisk undersøgelse af, hvordan adfærden ændrer sig med D. For forskellige værdier af disse parametre beregner vi den maksimale værdi af I b, der er observeret indtil tidspunkt t = 1. Dette svarer til ca. 119 vækstdage, hvilket, selv om det er større end de typiske eksperimentelle tider, sikrer, at den maksimale værdi af I b observeres i løbet af simuleringen. De beregnede indeks I b er plottet i fig. 4 ved hjælp af en logaritmisk skala i base 10 for begge akser. For log(N) < 1 er der kun lidt eller ingen skævhed i cellernes vækst, som målt ved I b . Ved større værdier af N afhænger omfanget af den observerede skævhed af værdien af D, med et maksimum i nærheden af (D,N) = (1, 105). Denne værdi af D svarer til cellediffusion og næringsstofdiffusion af samme størrelse, og omkring denne værdi er det muligt at observere en skævhed i væksten for værdier af N så små som 101,5. Under typiske forsøgsbetingelser har N størrelsesordenen 2, hvilket indikerer, at DLG-effekter er mest sandsynlige at observere, når D er tæt på enhed.

Afstanden af adfærd illustreres yderligere ved at betragte fordelingerne fra to kontrasterende eksempler. I hvert tilfælde er løsningen vist på det tidspunkt, der svarer til den maksimale celleforvridning. For D = 10-6 og N = 1, vist i fig. 4, er næringsstofkoncentrationen blevet effektivt ensartet, før celletætheden kan udvikle nogen tydelig skævhed mod højre side, hvor næringsstoffet oprindeligt var koncentreret. Hvis man derimod tager D = 10-0,5 og N = 105, som også er vist i fig. 4, viser cellerne en tydelig præference for højre side af domænet.

Analysen af kontinuummodellen tyder på, at hvis \(D\ll 1\), så vil der kun forekomme rettet vækst og dermed nogen DLG-effekter ved værdier af N, der er mindst lige så store som 103. Da skøn viser, at N har størrelsesordenen 2, tyder dette på, at DLG kun vil blive observeret, når D er tæt på enheden, som det fremgår af fig. 4. Dette kan også illustreres ved hjælp af fysiske parametre. Med de parameterværdier, der er angivet i afsnit 3, vil mikrober med diffusivitet \({D}_{m}=3\times {10}^{-2}\})mm2 min-1 placeret i et miljø med maksimal indledende næringsstofkoncentration \({N}_{0}\mathrm{=3,8}\times {10}^{-3}\}\)g mm-2 svare omtrent til de dimensionsløse værdier D = 0,75 og N = 104. Ud fra fig. 4 forventes det, at denne art vil vokse mod en næringsstofkilde og dermed udvise DLG-adfærd. Hvis de samme mikrober blev anbragt i et miljø med maksimal næringsstofkoncentration \({N}_{0}\mathrm{=3,8}\ gange {10}^{-6}}\)g mm-2, ville værdien af N falde til 10, og der ville ikke længere kunne observeres en skæv vækst. Resultaterne i dette afsnit giver således en ramme for identifikation af, hvornår DLG forventes at forekomme alene på baggrund af estimater af D og N.

Eksperimentelle sammenligninger

Når vi har undersøgt modelforudsigelserne, bruger vi dem nu til at identificere den dominerende vækstmekanisme i mikrobielle kolonier. Vi betragter de tre repræsentative eksperimentelle eksempler, der er vist i fig. 1: to kolonier af bakterien B. subtilis og en koloni af S. cerevisiae. Da vi ikke kender den passende værdi af diffusionsforholdet D, som kræves af reaktions-diffusionsmodellen, er væksten i stedet karakteriseret ved den relative spredning Δ (2). Denne parameter repræsenterer forholdet mellem den gennemsnitlige ændringshastighed i koloniarealet, set oppefra, og glukosens diffusivitet og kan måles på billederne. Da næringsstoffet er jævnt fordelt, og der kun dyrkes en enkelt koloni, forventes en eventuel DLG i disse eksempler at manifestere sig som uregelmæssig vækst med grenafskærmning (fænomen I).

De beregnede værdier af væksthastighederne Δ m er angivet i tabel 1 sammen med de tilsvarende relative hastigheder Δ. Disse værdier viser, at B. subtilis-kolonierne vokser to størrelsesordener hurtigere end gærkolonien og en størrelsesorden langsommere end glukosens diffusivitet. Anvendelse af typiske værdier for den oprindelige næringsstofkoncentration tyder på, at eksperimenterne svarer til en værdi af N, der har størrelsesorden 2. Hvis dette estimat og værdierne for Δ matches med modelresultaterne fra fig. 4, tyder det på, at B. subtilis svarer til et regime, hvor der vil forekomme rettet vækst som følge af DLG. Da dette skøn blev foretaget ved at måle celledannelseshastigheden p i en koloni af S. cerevisiae, som sandsynligvis vil være mindre end den tilsvarende værdi for bakterier, forventes dette at være en undervurdering af N, og en større værdi af N øger sandsynligheden for at observere DLG. I modsætning hertil har S. cerevisiae-kolonien en Δ med størrelsesorden -3, hvilket tyder på, at næringsstoffet diffunderer på en meget hurtigere tidsskala end cellevæksten. Som følge heraf forventes eventuelle lokale variationer i næringsstofkoncentrationen at forsvinde, før de har indflydelse på koloniens morfologi. Dette tyder på, at morfologien ikke påvirkes af DLG. På trods af den store lighed mellem bakterie- og gærkoloniernes form i miljøer med lavt næringsindhold skyldes disse to morfologier således forskellige fænomener. Bakteriekolonier vokser på en tilstrækkelig hurtig tidsskala til, at diffusion af næringsstoffer kan begrænse væksten, hvilket resulterer i et uregelmæssigt mønster. Gærkoloniernes meget langsommere vækst betyder, at DLG ikke kan forekomme, og at de uensartede kolonimorfologier, der opstår i miljøer med lavt næringsindhold, i stedet må skyldes pseudohyfevækst alene.

Vi søgte yderligere bekræftelse af disse resultater ved at teste for rettet vækst (fænomen III) i kolonier af S. cerevisiae, idet vi efterlignede den opsætning, der blev anvendt af Matsushita & Fujikawa12 og i simuleringerne40. En petriskål blev fyldt med syntetisk dextrose med lavt ammoniumindhold (SLAD) med næringsstof placeret i midten af petriskålen. Gærceller blev udsået i forskellige afstande fra midten og fotograferet efter 16 dages vækst. Yderligere oplysninger om forsøgene findes i afsnit 3. Der blev anvendt både glukose og ammoniumsulfat som begrænset næringsstof, og repræsentative billeder for hver af dem er vist i fig. 5. Billederne er orienteret således, at centrum af petriskålen, hvor næringsstoffet blev anbragt, er placeret i højre side. Diffusionsevnen for ammonium i vand er ca. 9,84×10-2 mm2 min-1 41. Da dette er af samme størrelsesorden som glukosens diffusivitet, forventes hver næringsstofkilde at resultere i en lignende værdi af Δ. Ingen af kolonierne viser en mærkbar skævhed i væksten i nogen retning, og begge giver et skævhedsindeks I b næsten nøjagtigt lig med 0,5. De effektive diffusiviteter Δ m og de dimensionsløse diffusiviteter Δ for hvert forsøg er angivet i tabel 2. I begge tilfælde har Δ størrelsesorden -3, hvilket indikerer, at der ikke bør observeres rettet vækst, og stemmer overens med resultaterne fra de tidligere forsøg.

Billeder fra forsøgene med rettet vækst med S. cerevisiae. Billederne er orienteret således, at det tilsvarende næringsstof er på højre side af kolonien, som angivet ved den lodrette tekst. Kolonierne blev dyrket på (a) SLAD-G med glukose tilsat til højre og (b) SLAD-N med ammoniumsulfat tilsat til højre. Skalaen repræsenterer 5 mm.

Et yderligere bevis for vækstmåden er givet af adfærden nær kanten af kolonierne. Der er tydelige tegn på uensartet vækst omkring kanten af kolonien dyrket på SLAD-N, men ikke på kolonien dyrket på SLAD-G. Hvis dette mønster skyldtes DLG, ville vi forvente en lignende adfærd på begge medier. Det er imidlertid kendt, at diploide gærsvampe, som den AWRI796-stamme, der blev anvendt i dette forsøg, skifter til pseudohyphal vækst, når de fratages kvælstof2 , f.eks. med SLAD-N. Dette tyder på, at den uensartede vækst, der er observeret i gærkolonier, som vist i fig. 1, skyldes pseudohyfevækst og ikke DLG.