INDLEDNING

Yoghurt er et mejeriprodukt fremstillet ved fermentering af mælk med Lactobacillus spp. Nu til dags er yoghurts terapeutiske, profylaktiske og ernæringsmæssige egenskaber bredt accepteret (Boor, 2001). Når de indgives i en tilstrækkelig mængde, giver probiotika værten sundhedsmæssige fordele og øger den mikrobielle balance (Fuller, 1989; Guarner et al., 2005). Probiotika er således levende, ikke-patogene, venlige mikroorganismer, som spiller en gavnlig rolle i værtens mikroflora (Schrezenmeir og de Vrese, 2001). Mælkesyrebakterier (LAB) er den vigtigste probiotiske gruppe af mikroorganismer, især Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp. og Enterococcous sp. (Klein et al., 1998). Mælkeproduktets ernæringsmæssige og terapeutiske kvaliteter bestemmes af probiotiske mikroorganismer (Boor, 2001).

Yoghurt er en potentiel kilde til probiotiske Lactobacillus spp. Yoghurt er også kendt som den rigeste probiotiske kontaminerende fødevare. Mælkeproduktets ernæringsmæssige værdi øges af probiotiske mikroorganismer og metabolitter, der produceres som følge af fermentering. Regelmæssig indtagelse af yoghurt reducerer den overdrevne fedtform i leveren og øger ved sekretion. Det er også nødvendigt for dem, der lider af hjertesygdomme, åreforkalkning, hypertension og betændelse. Mavesaft, som udskilles af yoghurt, fører til en høj fordøjelseskapacitet. Den gavnlige virkning af probiotiske mikroorganismer, især Lactobacillus sp., som findes i mælkeprodukter, hvilket beviser rapporteret yderligere, mange forskere har undersøgt virkningerne af probiotiske mikroorganismer mod patogene organismer ved hjælp af forskellige metoder (Mercenier et al., 2003).

Lactobaciller er medlemmer af mælkesyrebakterierne, hvis primære fermenterings slutprodukt er mælkesyre. De er kommercielt vigtige bakterier med en bred vifte af anvendelsesmuligheder både i fødevare- og nonfoodindustrien på grund af deres “Generally Recognized As Safe”-status (GRAS). Lactobaciller er blevet undersøgt indgående for deres molekylærbiologi med henblik på at forbedre deres specifikke gavnlige egenskaber (Pouwels og Leer, 1993).

Probiotikas virkemåde er baseret på de probiotiske bakteriers evne til at binde patogener i tarmepithelvævet. Antipatogen virkning af probiotika består i produktion af mælkesyre, som sænker pH-værdien, interagerer med de toksiner, der produceres af patogener med produktion af hydrogenperoxid og syntese bakteriocin (Corcionivoschi et al., 2010).

Et effektivt probiotisk produkt kræver korrekt identifikation og karakterisering af en bakterieart, der anvendes. Udvælgelsen af probiotiske organismer, der kan være nyttige terapeutisk og ernæringsmæssigt, vil være baseret på specifikke egenskaber (Fuller, 1989; Quewand og Vesterlund, 2004).

Sigtet med denne forskning var at indsamle yoghurt fra forskellige regioner i Bangladesh og identifikation af lactobaciller ved bakteriologisk såvel som slægtsspecifik PCR og analyse af deres probiotiske egenskaber efter interferens med patogen bakterievækst.

MATERIALER OG METODER

Prøveindsamling og isolering af mælkesyrebakterier (LAB): Der blev indsamlet to typer yoghurtprøver fra forskellige supermarkeder i Chittagong og Bogra by i Bangladesh, som var sure (prøve M1, M2 og M3) og søde (prøve S2) i smagen. Derefter blev prøverne opbevaret umiddelbart efter indsamlingen i køleskab ved lav temperatur (4 °C) på aseptisk vis for at beskytte mod kontaminering og forringelse. Lactobacillus spp. blev isoleret fra yoghurtprøverne ved passende fortyndinger med 0,9 % saltopløsning. Der blev anvendt MRS-bouillon (Man, Rogosa og Sharpe) og MRS agarmedier (Man, Rogosa og Sharpe) til vækst af organismen. Mediernes pH-værdi blev justeret til 6,5. Pladerne blev inkuberet aerobt ved 37 °C i 48 timer. Endelig blev den enkelte koloni af Lactobacillus isoleret ved at observere koloniens morfologi og nogle biokemiske test såsom gramfarvning, katalase- og oxidasetest. Godt isolerede kolonier blev opsamlet og overført til MRS-bouillon til berigelse af Lactobacillus ved 37 °C.

Identificering af mælkesyrebakterier (LAB) ved bakteriologisk analyse: Identifikation blev udført i henhold til de metoder, der er beskrevet i Bergeys manual of systemisk bakteriologi. Uden brug af anaerobe forhold voksede alle stammer godt på MRS agar ved 37°C i 48 timer med henblik på selektiv udvækst af lactobaciller. Fra passende fortyndinger blev der udtaget en repræsentativ koloni, som blev tentativt identificeret som lactobaciller efter Gram-færgningsreaktion, koloniudseende, cellemorfologi, katalaseprøve, oxidaseprøve, indolprøve, methylrødprøve, Voges-proskauerprøve, citratudnyttelsestestest og kulhydratfermenteringsmønstre som beskrevet i Bergeys manual (Hensyl, 1994).

DNA-ekstraktion fra isolater: DNA blev ekstraheret fra 4 prøver isoleret fra yoghurt i henhold til den klassiske varme-tø-metode (Salehi et al., 2005). Ren bakteriekultur fra MRS agar slant blev subkultiveret i MRS bouillonmedium, hvorfra 1,5 mL bouillonkultur blev taget i eppendorfrør og centrifugeret ved 10.000 rpm i 5 min. Herefter blev supernatanten kasseret, og pelleten blev opsamlet. Ca. 200 μL autoklaveret, afioniseret vand blev tilsat til pellet og opløst ved fingerrystning. Eppendorf-rørets låg blev gennemboret med en steril nål, hvorefter røret blev kogt i vandbad ved 100 °C i 10 minutter. Lige efter kogningen blev eppendorfrøret opbevaret på is i 10 minutter og derefter centrifugeret ved 10 000 rpm i 10 minutter. Derefter blev der opsamlet 100-150 μL supernatant indeholdende bakteriel kromosomal DNA.

Genusspecifik PCR-amplifikation: For at bestemme tilhørsforholdet til slægtsniveauet for alle 4 isolater blev PCR udført med Lactobacillus-genus-specifikke primersæt LbLMA1-rev (5′-CTCAA AACTAAACAAAGTTTC-3′) og R16-1 (5′-CTTGTACACACACCG CCCGTCA-3′), designet af Dubernet et al. PCR-analysen blev udført på grundlag af 16-23S ribosomal RNA intergenic spacer-regionen som tidligere beskrevet (Dubernet et al., 2002).

Reaktionsblandingen (20 μL) indeholdt 1 μL (100 ng μL1) af hver primer tilsat 10 μL 10× PCR Master Mix, 6 μL PCR-vand og 2 μL skabelon. Kørselsbetingelserne var indledende denaturering ved 95 °C i 5 minutter, efterfulgt af 30 cyklusser bestående af denaturering ved 95 °C i 30 sekunder, annealing ved 55 °C i 30 sekunder, forlængelse ved 72 °C i 30 sekunder og et sidste forlængelsestrin på 7 minutter ved 72 °C. Produkterne blev opbevaret ved 4 °C indtil analysen. De amplificerede produkter blev underkastet elektroforese i 1% agarosegeler i TAE-buffer (40 mM Trisacetat, 1 mM EDTA, pH 8,2). Gelerne blev farvet med ethidiumbromid (5 μg mL1) og visualiseret under UV-transilluminator (Biometra GmBH, Tyskland).

Analyse af probiotiske egenskaber:

NaCl-tolerancetest: Probiotiske egenskaber blev bestemt ved at analysere følgende tests:

NaCl-tolerancetest: Til bestemmelse af NaCl-tolerance blev isolerede Lactobacilli dyrket i MRS-bouillon indeholdende ni reagensglas, der blev justeret med forskellige koncentrationer af NaCl (1-9%). Efter autoklavering i 15 min. ved 15 Ibs tryk ved 121°C blev hvert reagensglas inokuleret med 10 μL over night-kultur af Lactobacillus og inkuberet anaerobt ved 37°C i 24 timer. Efter 24 timers inkubation blev bakterievæksten målt ved hjælp af et spektrofotometer ved 560 nm (Graciela og Maruia, 2001).

Galdesalt-tolerancetest: Væksthastigheden af bakteriekulturer blev bestemt i MRS-bouillon indeholdende forskellige niveauer (0,05, 0,1, 0,15, 0,3 og 0,5 %) af galdesalte. Frisk fremstillede kulturer blev inokuleret (1%) i mediet og inkuberet ved 37°C i 24 timer under anaerobe forhold. Derefter blev den optiske tæthed af hver prøve målt ved hjælp af et spektrofotometer ved 560 nm (Graciela og Maruia, 2001).

Bestemmelse af optimal pH for vækst: Til bestemmelse af den optimale pH-værdi for vækst blev 100 μL frisk Lactobacillus-kultur fra natten inokuleret i reagensglas med MRS-bouillon med varierende pH-værdier fra 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 og 8,0. Til bestemmelse af pH-værdiens indvirkning på væksten blev der anvendt acetatbuffer (pH -4, 4,5, 5, 5,5, 5,5, 6, 6,5), Tris-HCl-buffer (pH-7) og boratbuffer (pH-8). Den inokulerede bouillon blev inkuberet under anaerobe forhold i 24 timer ved 37 °C. Efter inkubationen blev bakteriernes vækst målt ved hjælp af et spektrofotometer ved 560 nm i forhold til uinokuleret kontrolbouillon.

Kvantificering af organisk syre og bestemmelse af pH-værdien: I henhold til Hoque et al. (2010) blev kvantificering af organiske syrer produceret af isolaterne og bestemmelse af deres pH-værdi udført. MRS-bouillon suppleret med 10 % skummetmælk inokuleret med 1 % (v/v) eller 100 μL overnatningskultur af isolaterne og inkuberet under anaerobe forhold ved 37 °C i 72 h. Fermenterede prøver blev opsamlet hver 24., 48. og 72. time, og væsker af koaguleret mælk blev adskilt ved filtrering. Efter filtrering blev pH-værdien af den separerede væske registreret ved hjælp af en digital elektrode-pH-måler og kvantificering af organisk syre blev foretaget ved titrering med 0,1 N NaOH ved hjælp af phenophthalien som pH-indikator (Hoque et al., 2010).

Screening af interferens med patogene bakterier: De antibakterielle aktiviteter af de isolerede Lactobacillus spp. mod nogle patogene bakterier blev bestemt ved hjælp af modificeret agar overlay-metode (Aween et al., 2012). Otte forskellige humane patogener, Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli og Shigella sonnei blev anvendt i denne undersøgelse som testpatogener. Den antibakterielle aktivitet blev yderligere karakteriseret ved at bestemme, om den var bakteriostatisk eller bakteriedræbende. Testen blev udført ved afprøvning af væksthæmningszonen. Svabben blev udstrøet på en næringsagarplade og inkuberet aerobt ved 37 °C i 72 timer. Tilstedeværelsen af vækst på næringsagarpladen blev fortolket som en hæmmende aktivitet, dvs. bakteriostatisk, mens ingen vækst blev fortolket som bakteriedræbende.

RESULTATER OG DISKUSSION

Identificering af bakterier ved hjælp af bakteriologiske og biokemiske test: De fire isolater blev dyrket i Man, Rogosa og Sharpe (MRS)-medium ved pH 6,5. Alle isolaterne blev produceret små, uregelmæssige og runde former med skinnende hvidlig cremefarvet eller brunlig farve, som morfologisk lignede Lactobacillus spp.

Derpå blev alle isolater undersøgt under lysfeltmikroskop for at observere deres mikroskopiske egenskaber. Disse isolater blev fundet som grampositive, korte og mellemstore stavformede ikke-sporeformede bakterier (Fig. 1a-d), hvilket indikerer, at de tilhører Lactobacillus spp. (Thamaraj og Shah, 2003).

Dertil kommer, at der blev udført nogle biokemiske test såsom katalase test, oxidase test, indol test, Methyl Red (MR) test, Voges Proskauer (VP) test, citrat udnyttelse test og kulhydrat fermenteringsmønstre som beskrevet i Bergeys manual systematisk bakteriologi (Hensyl, 1994).

Isolaterne blev fundet katalase- og oxidase-negative, og i IMViC-test (indol, methyl-rød, Voges Proskauer, citratudnyttelse) blev alle isolater også fundet negative, hvorved disse kunne bekræfte, at isolaterne var Lactobacillus spp. (Dhanasekaran et al., 2010).

I denne undersøgelse var alle fire isolater i stand til at fermentere 11 forskellige kulhydrater, dvs. glukose, saccharose, fructose, lactose, xylose, ribose, galactose, maltose, mannitol, rhamnose og dextrose, hvilket indikerer, at de er i stand til at vokse i forskellige habitater og udnytte forskellige typer kulhydrater. De sammenfattede resultater af alle bakteriologiske og biokemiske test er vist i tabel 1. Alle disse resultater er fundet relevante i forhold til resultaterne af Chowdhury et al. (2012).

Molekylær identifikation ved hjælp af genusspecifik PCR: I denne undersøgelse anvendte vi en genusspecifik primer fremstillet ved at analysere ligheder mellem nukleotidsekvenserne i spacerregionen mellem 16- og 23S ribosomal RNA-generne hos Lactobacillus (Dubernet et al., 2002). Specificiteten af denne genusspecifikke primer kombineret med en universel primer blev testet mod 23 Lactobacillus-stammer af forskellig oprindelse. PCR-produkterne blev kørt gennem gelelektroforese i 1% agarose og visualiseret ved hjælp af UV-transilluminator. For hver prøve (M1, M2, M3 og S2) blev der fundet et forventet skarpt bånd på 200 bp amplicon, som svarer til 16-23S rRNA intergenic spacer-regionen hos Lactobacillus spp. (Dubernet et al., 2002). Alle 4 isolater blev således bekræftet på slægtsniveau som Lactobacillus spp. Den negative kontrol uden nogen skabelon gav ingen bånd, hvilket tyder på, at alle 4 PCR-produkter var korrespondance af skabelon-DNA’et (fig. 2).

Analyse af probiotiske egenskaber: Probiotiske bakterier producerer en række stoffer med antibakterielle egenskaber, herunder organisk syre, H2O2, bakteriociner, der påvirker bakteriernes metabolisme eller toksinproduktion (Rafter, 2003; Rolfe, 2000; Vandenbergh, 1993).

For at kunne gøre dette, skal de kunne modstå de ugunstige forhold i tarmen som NaCl og galdesalt.

NaCl-tolerancetest: Isolatet Lactobacillus spp. fra yoghurt var i stand til at tolerere 1-9% NaCl. For at bestemme isolaternes NaCl-tolerance blev den optiske tæthed målt ved 560 nm, og dataene blev plottet. Isolat M1, M2, M3 og S2 voksede godt i en NaCl-koncentration på 1 %. Den maksimale vækst (OD) for isolaterne M1, M2, M3 og S2 blev fundet på henholdsvis 1,420, 2,143, 1,662 og 2,207 i 1% NaCl (fig. 3). Høj salttolerance er en ønskværdig egenskab for organismer, der skal anvendes som probiotika.

Det er kendt, at NaCl er et hæmmende stof, som kan hæmme væksten af visse typer bakterier. I denne undersøgelse viste resultaterne, at Lactobacillus spp. isoleret fra yoghurt var i stand til at tolerere 1-9 % NaCl, og optimal vækst blev observeret ved 1-5 % NaCl (Hoque et al., 2010).

Galdesalt-tolerancetest: Isoleret Lactobacillus spp. var i stand til at overleve i 0,05, 0,1, 0,15 og 0,3% galdesyre. Den isolerede Lactobacillus spp. var også i stand til at formere sig i ovennævnte koncentrationer af galdesyre. Den optiske massefylde blev målt ved 560 nm, og dataene blev plottet. Alle isolater vokser godt i 0,05% galdesaltkoncentration. Den maksimale vækst (OD) for isolaterne M1, M2, M3 og S2 blev fundet på henholdsvis 1,741, 2,213, 1,758 og 2,125. Væksthastigheden faldt med stigende galdesaltkoncentration (fig. 4).

I dette forsøg blev der anvendt en galdekoncentration på 0,05-0,3 %, som kan findes i det menneskelige tarmsystem, og den maksimale koncentration af galde, der findes i et sundt menneske, er 0,3 % (Graciela og Maruia, 2001). Det er rapporteret, at før en probiotisk bakterie udvælges til menneskeføde, skal den kunne tåle en galdekoncentration på 0,3 % (Gilliland et al., 1984). På baggrund af resultatet foreslås det, at disse stammer kan være potentielle til brug som probiotiske organismer, fordi alle isolaterne var resistente og i stand til at vokse i 0,3% galdesaltkoncentration.

Bestemmelse af optimal pH for vækst: De isolerede Lactobacillus spp. fra yoghurt var i stand til at vokse op pH-områder fra 4,0-8,0. Den optiske tæthed blev målt ved 560 nm, og dataene blev plottet. Den maksimale vækst (OD) for isolaterne M1, M3 og S2 blev fundet på henholdsvis 2,201, 2,0619 og 2,237 ved pH 6,0, mens den maksimale vækst for isolaterne M2 var 2,259 ved pH 6,5 (fig. 5). Isolaterne kunne vokse ved pH-værdier mellem 4,0 og 8,0, men den optimale vækst blev observeret ved pH-værdier mellem 5,0 og 6,5, når de blev dyrket i MRS-bouillon ved 37 °C. Af denne undersøgelse kan det konkluderes, at væksthastigheden for Lactobacillus spp. falder på et vist tidspunkt, når pH-koncentrationen stiger (Chowdhury et al, 2012).

Kvantificering af organisk syre og bestemmelse af pH-værdi: Til kvantificering af organisk syre blev der anvendt titreringsmetoden.

Kvantificering af organisk syre = V×N×D

hvor V er volumen af NaOH, N er NaOH’s styrke og D er fortyndingsfaktoren. Resultatet af produktionen af organisk syre er vist i tabel 2.

Denne undersøgelse viser, at produktionen af organisk syre steg med inkubationstiden, men samtidig faldt mediernes pH-værdi med den stigende syreproduktion. Af resultatet (tabel 2) fremgår det, at den højeste surhedsgrad (1,9 %) og den laveste pH-værdi (3,64) blev observeret efter 72 timers inkubation ved 37 °C for probiotisk Lactobacillus isoleret fra Bogra-yoghurt. Andre probiotiske bakterier isoleret fra yoghurt fra forskellige supermarkeder i Chittagong viste den højeste surhedsgrad på henholdsvis 1,83, 2,11 og 2,11 % og den laveste pH-værdi på henholdsvis 3,9, 3,68 og 3,65 efter 72 timers inkubation.

Der er en mindre variation i produktionen af organisk syre af lactobaciller på grund af deres regionale forskelle, hvilket indikerer, at disse isolater er lidt klima- og miljøafhængige (Hoque et al, 2010).

Screening af interferens med patogene bakterier: Probiotika, herunder Lactobacillus, Bifidobacterium og Streptococcus spp., er kendt for at være hæmmende for væksten af en lang række tarmpatogener hos mennesker. Ud over de gunstige virkninger mod sygdomme forårsaget af en ubalance i tarmmikrofloraen har Dunne et al. (2001) og Wollowski et al. (2001) rapporteret om flere eksperimentelle observationer af bakterier mod udviklingen af tyktarmstumorer.

I denne undersøgelse blev de udvalgte 4 isolater undersøgt ud fra deres antibakterielle aktivitet mod forskellige patogene bakterier såsom Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli og Shigella sonnei, der er forbundet med fødevarebårne sygdomme. Sammenligningen af deres hæmning (i mm) mod 8 testpatogener er vist i tabel 3.

De eksperimentelle resultater viste, at den højeste hæmmende aktivitet af isolat M1 blev påvist mod Bacillus cereus (51,20 ± 1,22 mm) og den laveste hæmningszone var (23,46 ± 1,00 mm) mod Shigella sonnei efter 72 timers inkubation. Den højeste diameter af hæmningszonen for isolat M2 blev vist mod E. coli (38,43 ± 1,00 mm) og den laveste zone (20,10 ± 1,00 mm) mod Bacillus megaterium efter 72 timers inkubation. Tilsvarende blev den højeste diameter af hæmningszonen for isolat M3 vist mod P. aeruginosa (42,90 ± 1,20 mm) og den laveste zone (17,83 ± 1,10 mm) mod S. aureus. Endelig blev der i isolat S2 observeret den højeste zone mod E. coli (43,80 ± 1,20 mm) og den laveste zone (21,63 ± 1,10 mm) mod S. aureus efter 72 timers inkubation. Resultaterne vedrørende Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae og Escherichia coli blev fundet relevante i forhold til resultaterne af Chowdhury et al. (2012).

I den foreliggende undersøgelse viste isolaterne M1, M2, M3 og S2 tilfredsstillende resultater med hensyn til bakteriocid og bakteriostatisk aktivitet. Isolat M1 var bakteriedræbende over for Bacillus megaterium, Vibrio cholera, Shigella sonnei og bakteriostatisk over for Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, P. aeruginosa, S. aureus og E. coli. Isolat M2 var baktericid over for Bacillus cereus og Shigella sonnei og bakteriostatisk over for Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae og Escherichia coli. Isolat M3 var baktericid over for Shigella dysenteriae, Bacillus megaterium og Staphylococcus aureus og bakteriostatisk over for Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa og Vibrio cholerae, Escherichia coli og Shigella sonnei, og isolat S2 var baktericid over for Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae og Shigella sonnei og bakteriostatisk over for Bacillus megaterium og Escherichia coli.

KONKLUSION

I denne undersøgelse er Lactobacillus spp, blev isoleret og identificeret fra selektive regionale yoghurter. Til identifikation af bakterierne blev der udført flere bakteriologiske og biokemiske test. Desuden blev der gennemført en PCR ved hjælp af genusspecifikke primere (LbLMA-rev) og universelle primere (primer R16-1), der svarer til 16-23S rRNA intergenic spacer-regionen for Lactobacillus spp. for at bekræfte den bakteriologiske identifikation. De isolerede Lactobacillus spp. var i stand til at tolerere hæmmende stoffer som NaCl (1-9 %) og gallesalt (0,05-0,3 %) og kunne også overleve i alkaliske omgivelser (pH 8,0). Alle disse isolater (M1, M2, M3 og S2) var i stand til at udnytte kulhydrater som glukose, xylose, saccharose, fructose, galactose, lactose, maltose, ribose, rhamnose, mannitol og dextrose. Desuden var de isolerede Lactobacillus spp. fra alle fire isolater (M1, M2, M3 og S2) i stand til at producere organisk syre i mælk. Denne undersøgelse viser, at der er en mindre variation i Lactobacillus’ produktion af organisk syre som følge af deres regionale variation. Alle fire isolater (M1, M2, M3 og S2) udviste tilfredsstillende antibakterielle aktiviteter over for otte almindelige humanpatogene bakterier, og isolaterne producerede ekstracellulært bakteriocin. Et probiotikum skal være i stand til at hæmme patogene organismer og bør kunne tåle de barske forhold i menneskets tarm, f.eks. højt saltindhold, lav pH-værdi og høj koncentration af galdesalte. Alle de isolerede Lactobacillus spp. opfyldte disse kriterier, og de kan derfor betragtes som potentielle probiotika for menneskers sundhed.