Etableringen af genetiske transformationssystemer har gjort det muligt for forskere at transformere fremmed DNA i filamentøse svampe og dermed opnå de ønskede stammer til industrielle formål. Vi kan nu drage fuld fordel af svampenes overlegne sekretoriske evne og deres fremragende effektivitet ved fremstilling af værdifulde metabolitter.
- Protoplastmedieret transformation (PMT)
- Grundlæggende trin i PMT-metoden
- Fremstilling af protoplasterne
- Optagelse af eksogent DNA
- Regeneration af protoplaster
- Kommentarer til PMT-metoden
- Agrobacterium -medieret transformation (AMT)
- Faktorer, der påvirker AMT-effektiviteten
- Bemærkninger til Agrobacterium-medieret transformation
- Elektroporationstransformation
- Faktorer, der påvirker elektroporationstransformation
- Elektroporationsparametre
- Elektroporationsmiljø og eksterne faktorer
- Kommentarer til elektroporationsmetoden
- Biolistisk transformation
- Shock-wave-medieret transformation (SWMT)
Protoplastmedieret transformation (PMT)
PMT er den mest almindeligt anvendte svampetransformationsmetode, som er afhængig af et stort antal kompetente svampeprotoplaster. Princippet er at anvende nogle kommercielt tilgængelige enzymer til at fjerne svampes komplekse cellevægskomponenter for at generere protoplaster. Derefter anvendes nogle kemiske reagenser (f.eks. PEG) til at fremme fusionen af eksogene nukleinsyrer og protoplaster, som beskrevet mere detaljeret nedenfor. Komponenterne i svampens cellevæg er meget variable mellem forskellige stammer. Selv komponenterne i sporehuden er væsentligt forskellige fra hyphaerne fra den samme stamme . Der findes således ingen universel transformationsmetode, som kan anvendes på forskellige svampestammer. Det er næppe muligt at standardisere fremstillingen af protoplast. En del af vanskelighederne skyldes vores begrænsede viden om hydrolaser i cellevæggen. Udvikling af en optimeret PMT-metode til svampe kræver stadig en betydelig indsats.
PMT er en rutinemæssigt anvendt transformationsmetode. Metoden har været under konstant forbedring for at opnå højere effektivitet til genetisk transformation og til målretning af egnede genloci gennem genredigering. Forberedelse af protoplaster kræver fjernelse af cellevæggen, hvilket hovedsageligt opnås ved enzymbehandling. Der er også blevet rapporteret om ikke-enzymmetoder til fremstilling af protoplaster, f.eks. fysiske metoder, herunder slibning og supersoniske bølgestød . De anvendes dog ikke i vid udstrækning på grund af praktiske ulemper og det lave udbytte af protoplaster. En oversigt over protoplastmedierede transformationsprotokoller for forskellige svampearter findes i tabel 1.
Grundlæggende trin i PMT-metoden
PMT blev først anvendt på Saccharomyces cerevisiae. Forskerne fremstillede protoplaster med den kommercielle sneglease og brugte sorbitol til at konservere protoplaster. Senere blev en sådan metode anvendt på filamentøse svampe, såsom Neurospora crassa , og A. nidulans . Selv om transformationsmetoderne er blevet forbedret, er de grundlæggende trin i det store og hele de samme. De grundlæggende trin i PMT-metoden er vist i fig. 1.
Grundlæggende trin i den protoplastmedierede transformation
Fremstilling af protoplasterne
Det første trin i protoplastfremstillingen er fjernelse af cellevæggen ved enzymatisk fordøjelse. Svampens cellevæg består af glucan, mannan og chitin. Strukturen af svampens cellevæg er meget dynamisk, og cellevæggen varierer under celledeling og vækst af svampe samt ved sporkimning, hyferforgrening og dannelse af diafragmaet. Cellevægskomponenterne er også forskellige i de forskellige svampearter, og derfor bør forskellige enzymer anvendes i kombination. Det er blevet rapporteret, at valget af en passende enzymblanding er en nøglefaktor i protoplastpræparationen .
Generelt er hyferne følsomme over for et passende enzym, som hydrolyserer deres cellevæg i den logaritmiske fase. I PMT-proceduren for Neurospora fremstilles protoplasterne ved at hydrolyse de nyligt fødte hyfer (dyrkning i 4-6 timer ved 25-30 °C) . På samme måde kan protoplaster også fremstilles med konidiosporer. For Aspergillus og Penicillium kan man f.eks. vælge spirende sporer eller thalli .
Protoplaster er følsomme over for osmotisk tryk, og man bør sørge for at opretholde et stabilt osmotisk tryk for at holde protoplasterne intakte under enzymolysen af cellevæggene. Der bør derfor indgå osmotiske stabilisatorer (såsom sorbitol, natriumklorid og kaliumklorid) i alle buffere til protoplastpræparering for at undgå, at cellerne brister. F.eks. anvendes sorbitolopløsning med en koncentration på 0,8-1,2 M i protoplastpræparationen af N. crassa , Aspergillus sp. og Trichoderma sp. for at opretholde den osmotiske stabilitet af protoplaster. En oversigt over parametre for protoplastpræparering for nogle almindelige svampearter findes i tabel 2.
Optagelse af eksogent DNA
Den opløsning, der anvendes til at suspendere protoplaster, indeholder normalt calciumioner og osmotiske stabilisatorer. Calcium menes at åbne kanaler i cytomembranen, hvilket letter indgangen af eksogent DNA i cellen, mens osmotiske stabilisatorer er nødvendige for at opretholde protoplasternes morfologi. Normalt tilsættes en vis mængde polyethylenglycol (PEG) sammen med renset DNA (som enten kan være cirkulært dobbeltstrenget DNA eller lineært DNA). PEG er en almindeligt anvendt cellefusionsfremmotor . Det kan danne den molekylære bro mellem celler eller mellem cytomembranen og DNA og fremmer således adhæsion. Desuden kan det også fremkalde uordnede ladninger på cytomembranens overflade, ændre membranens permeabilitet og lette indgangen af eksogene nukleinsyrer i cellerne .
PEG er et afgørende middel, der øger transformationseffektiviteten. Lav transformationseffektivitet kan i de fleste tilfælde forbedres ved at tilsætte mere PEG. Under normale forhold er præstationen af PEG med lav molekylvægt (som PEG3000) overlegen i forhold til PEG med høj molekylvægt (som PEG8000). Dette skal dog optimeres for forskellige arter .
Transformationseffektiviteten påvirkes også af temperaturen. Generelt bør DNA- og protoplastblandingen placeres på is i 15-30 minutter, så DNA’et kan hæfte på protoplasternes overflade .
Regeneration af protoplaster
For at sikre en god genvinding af levedygtige protoplaster får protoplaster lov til at regenerere på pladen uden selektionstryk i en vis mængde, før de overføres til en selektiv plade. Der bør indgå en osmotisk stabilisator i regenerationskulturen. Et stabilt osmotisk tryk er en nøglefaktor for, at protoplasten kan regenerere cellevæggen. Kun de protoplaster, der bærer eksogene nukleinsyrer, kan vokse på det selektive medium.
Kommentarer til PMT-metoden
Protoplasttransformationsmetoden er enkel og effektiv uden behov for dyrt udstyr. Men protokollen omfatter mange trin og kritiske reagenser. Hvert trin skal optimeres, og kvaliteten af reagenserne skal testes kritisk. Vækststatus for de svampe, der transformeres, skal overvåges nøje. Erfaring er afgørende for en vellykket gennemførelse af denne metode.
Agrobacterium -medieret transformation (AMT)
Agrobacterium er en gramnegativ bakterie, der almindeligvis findes i jord. Agrobacterium tumefaciens kan inficere skadede planter. Det tumorinducerende plasmid på > 200 kb, som også kaldes Ti-plasmidet, kunne isoleres i den tidlige fase af infektionen. Når A. tumefaciens inficerer en plante, trænger den ind i planten gennem såret og integrerer en del af Ti-plasmidet i genomet i de inficerede planteceller. Det integrerede DNA-fragment fra Ti-plasmidet betegnes almindeligvis som transfer-DNA eller T-DNA. T-DNA’et indsættes tilfældigt i plantegenomet som monoklon. T-DNA’et er flankeret af to retningsbestemte ufuldstændige gentagelser (kaldet venstre og højre kant) og indeholder gener, der koder for enzymer, der er ansvarlige for dannelsen af plantehormoner, som forårsager tumorvækst . En binær vektor blev designet til at have målgenet indsat mellem den venstre og højre T-DNA-grænse, og det rekombinante plasmid blev transformeret i Agrobacterium tumefaciens. Den positive Agrobacterium-klon blev brugt som et medium til at integrere målgenet i svampegenomet. De specifikke trin vil blive diskuteret i detaljer nedenfor.
AMT-metoden har vist sig at være mere stabil og effektiv end konventionelle transformationsmetoder, siden den første artikel rapporterede, at denne metode kunne anvendes til svampetransformation. AMT-metoden blev først anvendt til at transformere S. cerevisiae . Et plasmid, der bærer et hygromycinresistensgen, anvendes almindeligvis til at transformere Aspergillus awamori . AMT-metoden er blevet anvendt på mange ascomyceter, herunder Aspergillus , og Monascus purpureus . De grundlæggende trin i AMT-metoden er vist i fig. 2. En oversigt over Agrobacterium-medieret transformationsprotokol for forskellige svampearter er angivet i tabel 3.
De grundlæggende trin i den Agrobacterium-medierede transformation
Faktorer, der påvirker AMT-effektiviteten
Mange faktorer påvirker AMT-effektiviteten, herunder typen af svampestartmateriale (protoplast, spore, hypha og frugtlegemsvæv), koncentrationen af acetosyringonet, forholdet mellem svamp og Agrobacterium og betingelserne for samdyrkning.
-
Typen af udgangs-svampemateriale AMT-metoden kan anvende protoplaster, sporer, hyphaer og frugtlegemsvæv af svampe som recipient. Der bør vælges passende udgangsmaterialer for forskellige stammer. F.eks. fungerer AMT-metoden kun for protoplaster af Rhizopus. oryzae og Mucor circinelloides, mens sporer eller sporer i spirer ikke ville producere transformanter .
-
Koncentrationen af acetosyringon (AS) AS virker på to stadier under AMT-processen. Den ene er induktionsprocessen, og den anden er transformationsprocessen. AS anvendes generelt til at inducere ekspressionen af Vir-domænet af T-DNA, og genet i Vir-domænet aktiverer overførslen af T-DNA. Talrige undersøgelser har vist, at det var nødvendigt med en passende mængde AS under transformationsprocessen. Det er imidlertid ikke absolut nødvendigt at tilsætte AS i Agrobacteriums præ-kultureringsfase, hvilket kan reducere transformationseffektiviteten for nogle stammer. Koncentrationen af AS er en vigtig faktor, der påvirker transformationseffektiviteten under samkulturprocessen svamp-Agrobacterium i AMT af Aspergillus awamori .
-
Forholdet mellem svampe og Agrobacterium Inden for visse grænser vil transformationseffektiviteten nå det maksimale niveau med forøgelsen af mængden af svampe eller Agrobacterium. Et optimalt forhold for AMT for forskellige svampe skal bestemmes empirisk. Forholdet mellem svampe- og bakterieceller bør optimeres for forskellige svampe-Agrobacterium-transformationssystemer.
-
Betingelserne for samdyrkning Betingelserne for samdyrkning er en vigtig faktor i AMT-metoden. Dette omfatter kulturtid, temperatur, pH-værdi og valg af filter. Temperaturen og tiden for samdyrkning er de vigtigste faktorer blandt AMT-trinnene. I svamp-Agrobacterium-transformationen er en passende startbetingelse en temperatur på 20-28 °C og en samdyrkningstid på 16-96 timer. En lavere temperatur (20-25 °C) er normalt en fordel for AMT-metoden. Filteret, som er hydrofilt og tjener som støtte for svamp-Agrobacterium-samkultivering, letter overførslen af enkeltkolonier til screeningpladen. En nitrocellulosemembran, nylonmembran, filterpapir, cellofan og polyvinylidenfluorid (PVDF)-membran kan anvendes som filter .
Bemærkninger til Agrobacterium-medieret transformation
AMT-metoden åbner en ny vej for de svampe, der er modstridende over for transformation med konventionelle metoder. AMT-metoden er særlig velegnet til at generere knock-in-mutationer hos svampe, fordi T-DNA indsættes tilfældigt i genomet som en enkelt kopi. Desuden kan AMT opnå høj homolog rekombinationseffektivitet i forskellige genmålingsforsøg .
De vigtigste fordele ved AMT-metoden omfatter: for det første diversificerede transformationsmodtagere, herunder protoplaster, hyfer og sporer; for det andet evnen til at integrere eksogene gener i genomet for at danne stabile transformanter; og for det tredje høj transformationseffektivitet, der resulterer i et stort antal transformanter .
AMT-metoden kræver binære vektorer, som er besværlige at forberede. Der skal tages hensyn til flere faktorer ved optimering af transformationsprocessen. Dette er en væsentlig begrænsning ved AMT-metoden .
Elektroporationstransformation
Elektroporation er en enkel, hurtig og effektiv transformationsmetode til filamentøse svampe. Ved elektroporation lagres elektriske ladninger i en kondensator for at opbygge en høj spænding, prøven rammes af impulsspændingen, og den eksogene nukleinsyre kan straks overføres til cellerne. Normalt anvendes firkantede bølger eller eksponentielle henfaldsbølger til transformation af svampe . Eksponentielle henfaldsimpulser genereres simpelthen ved at oplade og aflade en kondensator. Det elektriske felt aftager eksponentielt fra topværdien. En firkantet bølge er en ikke-sinusformet periodisk bølgeform (som kan repræsenteres som en uendelig summering af sinusformede bølger), hvor amplituden veksler med en konstant frekvens mellem faste minimums- og maksimumsværdier. Der anvendes forskellige bølgeformer for elektroporation til forskellige arter. En oversigt over bølgeformer, der anvendes ved elektroporation for forskellige arter, findes i tabel 4.
Når en celle udsættes for det elektriske felt, vil cytomembranens struktur blive ændret med en spænding, der induceres mellem cytomembranen. Der kan dannes mikroporer i cytomembranen efter elektrisk stød. Den inducerede permeabilitet af cellevæggen er reversibel inden for spændingens og varighedens tærskelværdier, ellers vil den forårsage irreversibel skade på cellerne. Derfor ser mikroporerne i cytomembranen ud til at have to mønstre efter elektrisk stød, nemlig det reversible og det irreversible mønster. Lipid- og proteinmolekylerne i cytomembranen kan genoprette den oprindelige struktur, når der anvendes en passende feltintensitet, mens det irreversible elektriske stød vil give anledning til uoprettelighed eller ekstremt langsom genopretning, hvilket i sidste ende fører til celledød . Eksogent DNA kan overføres til bakterier, planteprotoplaster, dyreceller og filamentøse svampe ved elektroporation. Denne metode er blevet anvendt med succes på flere svampe. Ozeki et al. opdagede, at spirende sporer er mere modtagelige for transformation ved elektroporation . I de seneste år er elektroporation blevet en pålidelig metode til gentransformation af nogle almindelige stammer . En oversigt over elektroporationsmedierede transformationsprotokoller for forskellige svampearter findes i tabel 5.
Faktorer, der påvirker elektroporationstransformation
Elektroporationsparametre
-
Elektrisk feltintensitet Elektrisk feltintensitet er den vigtigste faktor, der påvirker elektroporationseffektiviteten. Når den anvendte elektriske feltintensitet når en størrelse på kV/cm og en pulsbredde på μs-ms-skalaen, vil cytomembranen blive ændret, og der vil blive dannet mange mikroporer på cellevæggene . En høj elektrisk feltintensitet er forbundet med en høj optagelseshastighed af eksogene nukleinsyrer og en lavere celleoverlevelseshastighed. Forskellige celletyper kræver imidlertid forskellige elektriske feltintensiteter på grund af forskelle i cytomembranens komponenter . Der dannes kun få mikroporer, når den elektriske feltintensitet ikke overstiger den krævede tærskelværdi. En for høj elektrisk feltintensitet vil derimod resultere i irreversibel skade på cytomembranen, hvilket fører til celledød.
-
Kapacitans Under elektroporationsprocessen afhænger variationen i elektriske ladninger og den elektriske feltintensitet, der påføres cellesuspensionen, af kapacitansen og impulsvarigheden. Intensiteten og varigheden af pulsen påvirkes også af kapacitansen, og derfor har større kapacitans bedre transformationseffekter .
-
Pulsvarighed og frekvens Varigheden af perforeringen af cytomembranen, som er direkte relateret til elektroporationens transformationseffektivitet, påvirkes af pulsvarighed og frekvens .
Elektroporationsmiljø og eksterne faktorer
-
Bufferopløsning Bufferopløsningen udgør et vigtigt miljø for elektroporation af celler, og pH-værdien af elektrochokbufferopløsningen er af stor betydning. Normalt anvendes en buffer med en pH-værdi på 7,0. Cellerne punkteres og dræbes let ved pH højere end 7,0 .
-
Temperatur Der produceres en stor mængde varme under elektroporationsprocessen, som vil blive frigivet i bufferopløsningen. Derfor anbefales en reduceret temperatur (0-4 °C) for at opnå en bedre effekt . Desuden kan isbadning af blandingen forud for elektrochokblandingen også forbedre elektrochokvirkningen.
-
Koncentration af eksogen nukleinsyre Generelt øges elektroporationseffektiviteten med koncentrationen af eksogen nukleinsyre. Kompakt superhelix-DNA trænger lettere ind i cellerne gennem cytomembranen. I 1995 rapporterede en undersøgelse, at hver 1 μg plasmid-DNA kunne generere 100 transformanter for A. niger .
Kommentarer til elektroporationsmetoden
Elektroporationsmetoden er blevet anvendt i vid udstrækning på talrige celletyper, herunder prokaryoter og eukaryoter. Denne teknologi har potentiale til at blive den foretrukne metode til transformation af uudforskede svampearter. Sammenlignet med PMT-metoden, hvor der er komplicerede trin involveret, er elektroporation enkel og mere bekvem. Elektroporationens mekanisme er dog stadig uklar. Perforeringshastigheden af cytomembranen er afhængig af mange parametre for det elektriske felt. Og det kræver også passende bufferforhold for at være optimalt effektivt.
Biolistisk transformation
Biolistisk transformation er også kendt som partikelbombardement. Dens princip er, at fremmed DNA adsorberes på overfladen af wolfram- eller guldpartikler. Under pres fra et højt tryk sprøjtes partiklerne ind i værtscellerne. Partikelbombardement kan realisere både stabil og forbigående transformation.
forskellige faktorer påvirker effektiviteten af bombardement i mønstre af komplekse interaktioner . Biologiske parametre (celletype, vækstbetingelser og celletæthed) og instrumentelle indstillinger (partikeltype og -størrelse, vakuum- og trykniveau, målafstand) er vigtige variabler.
Partikelbombardement er den mest effektive blandt alle metoder til genetisk transformation. Den er ikke underlagt begrænsningerne i forbindelse med celletyper af vært eller art. For svampe er partikelbombardement tilstrækkeligt effektivt til de organismer, der er vanskelige at dyrke, eller fra hvilke protoplaster er svære at fremstille. Partikelbombardement er let og bekvemt at anvende. Instrumenter og forbrugsstoffer til partikelbombardement er imidlertid dyre. Det vil kun blive overvejet i tilfælde, hvor andre metoder ikke virker. På nuværende tidspunkt er partikelbombardement blevet udnyttet til med succes at transformere A. nidulans og T. reesei , osv.
Shock-wave-medieret transformation (SWMT)
SWMT udnytter princippet om energitransformation og -overførsel til at generere transiente trykforstyrrelser og vridningskraft på tværs af cellerne for at danne transiente kavitationseffekter . Denne metode er blevet anvendt i medicinsk behandling såsom ortopædkirurgi og knusning af nyresten . SWMT ændrer cellemembranernes permeabilitet gennem akustisk kavitation, hvilket resulterer i optagelsen af eksogen nukleinsyre i cellerne. Metoden er med succes blevet anvendt til at indføre eksogen nukleinsyre i Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa og Salmonella typhimurium . I 2013 rapporterede Denis Magaña-Ortíz et al. for første gang om anvendelsen af SWMT til svampe, herunder A. niger, Fusarium oxysporum og Phanerochaete chrysosporium . I denne artikel blev der noteret tre fordele ved SWMT-metoden. For det første er denne metode i forhold til konventionelle transformationsmetoder i stand til at virke direkte på sporer, men ikke på protoplaster. For det andet er det let at kontrollere de fysiske parametre, idet kun antallet af sporer, chokbølgens energi og hastighed skal kontrolleres præcist. For det tredje var transformationseffektiviteten fremragende. Resultaterne af Denis Magaña-Ortíz et al. viste, at sammenlignet med Agrobacterium-transformationsmetoden kunne SWMT-metoden øge transformationseffektiviteten med 5400 gange for A. niger .
Men nogle begrænsninger i denne transformationsmetode var også bemærkelsesværdige. Da en stor del af DNA beskadiges ved chokbølgebehandlingen, var transformationseffektiviteten som bestemt af forholdet mellem DNA og celler ret lav . For det involverede antal celler var transformationseffektiviteten imidlertid betydeligt højere . Ved vurderingen af effektiviteten skal man tage hensyn til to aspekter: mængden af DNA og antallet af celler. I det forsøg, der blev udført af Magana-Ortiz et al. er det plasmid-DNA, der anvendes ved protoplasttransformation og elektroporation, generelt ca. 1-10 μg . Det er dyrt og besværligt at fremstille en så stor mængde plasmid i laboratoriet til SWMT-metoden. Desuden er chokbølgekilder og -instrumenter dyre, fordi de primært er designet til medicinske formål. Dette viser sig at være en stor hindring for at indføre denne metode i et mikrobiologisk laboratorium med begrænsede ressourcer.