Resultater og diskussion

Vores nye AMHS-metode er muliggjort af den anatomiske/funktionelle struktur af biens kredsløbssystem. Cirkulationen er fremtvunget af pulserende sammentrækning af de dorsale og ventrale membraner, som pumper hæmolymphe ind i hjertet. Derefter transporterer aortaen hæmolymphen ind i hovedet (fig. 1F), som forsyner biens hjerne og antenner med hæmolymphe.

Sammenlignet med TCHS gjorde AMHS det muligt at indsamle 80-100 μL steril hæmolymphe på kortere tid og fra et mindre antal individer, hvilket minimerer risikoen for melanisering. Vi mener, at det under indsamling af hæmolymph er vigtigt at minimere den tid, hvor den er i kontakt med luft. Melaniseringsrisikoen reduceres med en kortere indsamlingstid og en hurtigere overgang til køletrinet. Ud over den kortere opsamlingstid er den reducerede brug af insekter en anden væsentlig fordel ved AMHS i forhold til TCHS. Forskning i Apidae bør altid udformes således, at antallet af bier, der skal skades, minimeres. Anvendelsen af AMHS til at reducere antallet af bier, der er nødvendige for at indsamle en krævet hæmolymphvolumen, er i overensstemmelse med de vejledende principper for mere etisk brug af dyr i forskning .

Vores nuværende resultater viste også, at større insektstørrelse var forbundet med lettere og hurtigere hæmolymphprøvetagning og med større mængder indsamlet hæmolymph (tabel 1). Hæmolymphprøvetagning fra Apis mellifera carnica og Apis cerana-arbejdere tog længere tid og krævede flere insekter end hæmolymphprøvetagning fra humlebier, da førstnævnte arter er betydeligt mindre og har mindre hæmolymph.

Hæmolymph indsamles oftest med kapillærer ved hjælp af varierende metoder, f.eks. ved at punktere hjertet, den dorsale eller ventrale thorax sinus eller den dorsale aorta . Hver af disse procedurer indebærer en risiko for, at ventriklen bliver punkteret, hvilket fører til kontaminering af prøven med tarmindhold. En sådan forurening gør ikke blot prøven ubrugelig, men kræver også, at kapillæret skal udskiftes med et nyt eller rengøres og desinficeres før næste brug – hvilket forlænger den samlede tid til opsamling af hæmolymphe. Hæmolymphs sterilitet kan også bringes i fare ved at punktere den membran, der forbinder mavesegmenterne. Anvendelse af AMHS eliminerer disse kapillærrelaterede problemer. Desuden kan opsamling af hæmolymphe ved halshugning forurene hæmolymphen med nektar, der lækker fra biernes mave. Vores nye AMHS resulterede i hæmolymphprøver af høj biologisk kvalitet. Hæmocytter var tydeligt synlige i hver enkelt hæmolymphprøve, der blev indsamlet ved AMHS (fig. 1C). En analyse af hvert enkelt objektglas viste, at de AMHS-prøver af hæmolymphen var rene og gennemsigtige uden forurening (f.eks. pollenkorn).

Vi forventede, at i forbindelse med AMHS-udførelsen ville ethanoldesinfektion og begrænset kontakt mellem hæmolymphdråben og biens krop sikre sterilitet af prøven. Denne forventning blev bekræftet ved mikrobiologiske analyser. Inkubering af hæmolymphe, der er opnået ved AMHS, på både MRS og Sabouraud agarmedier bekræftede steriliteten af hæmolymphen. Der blev ikke observeret vækst af mikroorganismer på nogen af de 100 udplottede dråber hæmolymph. Der fremlægges derfor ingen kvantitative resultater her. Efter afslutning af inkubationsperioden observerede vi kun mørkebrune cirkler af melaniseret hæmolymph omkring hver dråbe. Denne melanisering skete under inkubationsperioden, ikke under prøvetagningen (fig. 1D og 1E). Når den indsamlede hæmolymphe ikke skal bruges til mikrobiologiske undersøgelser, kan desinfektionstrinnet udelades. Det er muligt, at ethanol anvendt ved antenneleddet kan påvirke enzym- eller hormonaktiviteterne.

Andre faktorer end metodologi kan påvirke effektiviteten af hæmolympheindsamlingen. I vores tidligere undersøgelser har vi observeret, at mængden af hæmolymphe, der opsamles fra en bi, ikke kun afhænger af biens kaste og alder, men også af dens hydreringsgrad, målt på grundlag af mængden af nektar eller sukkersirup, der er indtaget før prøvetagningen af hæmolymphen. Ptaszyńska et al. rapporterer, at det er mindre effektivt at udtage prøver af den rette mængde hæmolymphe fra ældre bier. Desuden kan effektiviteten af prøvetagningen afhænge af forskerens laboratoriekompetencer. Disse faktorer gør det vanskeligt at sammenligne de kvantitative egenskaber ved forskellige protokoller for udtagning af hæmolymphprøver mellem undersøgelser udført i forskellige laboratorier og med forskellige organismer. I vores tidligere undersøgelser har vi bl.a. udtaget hæmolymphprøver fra tusindvis af bier ved hjælp af AMHS og andre metoder, herunder TCHS . Vores laboratoriepersonale har stor erfaring med indsamling af hæmolymphe fra bier af forskellige aldre og kaster. Denne erfaring har hjulpet os med at sammenligne de forskellige prøveudtagningsmetoder, da vores resultater ikke blev påvirket af fejl som følge af laboratoriepersonalets varierende færdigheder. Vores nuværende resultater viste, at AMHS var en effektiv, ren og meget nøjagtig metode (tabel 1), der var mindre tidskrævende end TCHS .

Hæmolymphprøvetagning ved hjælp af andre metoder end AMHS kræver typisk yderligere udstyr, f.eks. mikrokapillærrør. Desuden kræver fjernelse af hæmolymphe fra mikrokapillarrør enten brug af en særlig pumpe eller knusning af rørene og centrifugering af dem med perler. En anden fordel ved AMHS er muligheden for at anvende en pipettevægt til at måle den hæmolymphvolumen, der er opsamlet fra en enkelt bi. Dette er særlig nyttigt ved biokemiske analyser af mikroprøver, f.eks. til bestemmelse af enzymaktiviteter . Det er værd at bemærke, at når der anvendes andre metoder end AMHS , kan det rene hæmolymphvolumen beregnes indirekte på grundlag af volumenet af hæmolymphtynding i et rør før prøvetagning og det målte volumen af hæmolymphtynding efter prøvetagning. En sådan metode kan imidlertid føre til yderligere fejl, og derfor anvender nogle forskere Hamiltonsprøjter . Med AMHS-metoden undgår man de udgifter og det ekstra arbejde (f.eks. afpropning af sprøjter, desinfektion osv.), der er forbundet med brugen af Hamilton-sprøjter.

Mayack og Naug-metoden (hæmolymphe opsamles ved at spinde bier med afklippede antenner) svarer til AMHS-metoden. Deres metode kræver dog både en laboratoriecentrifuge, og apernes munddele måtte limes til for at forhindre eventuel kontaminering. I deres undersøgelse dissekerede de desuden biavlerne for at vurdere Nosema ceranae-infektion, inden bierne blev spundet. Uden dette trin ville indvoldene være en sandsynlig kilde til kontaminering. Deres metode indebærer, at bierne anbringes i centrifugerør og centrifugeres ved 16.000 RCF i 30 sekunder for at opnå hæmolymphe. Denne proces kan medføre en stratificering af hæmolymphkomponenterne (f.eks. proteiner og hæmocytter) og indebærer en øget risiko for mikrobiologisk kontaminering og for melanisering af hæmolymphen (se ovenstående diskussion). Selv om det kan være ideelt til at analysere hemolymphs sukkerniveauer blandt honningbiernes fouragere med tidligere fjernede tarme (som i deres undersøgelse), er det ikke helt hensigtsmæssigt til mikrobiologiske og genetiske undersøgelser eller undersøgelser af enzymaktiviteter. I denne sammenhæng er vores nye AMHS-metode mere egnet til generel brug, da den er let og enkel og sandsynligvis kan anvendes i en lang række forskellige typer af undersøgelser.