Abstract

Hintergrund. Tidlig påvisning af Gram-positiv bakteriæmi og rettidig passende antimikrobiel behandling er nødvendig for at mindske patientdødeligheden. Formålet med vores undersøgelse var at evaluere præstationen af Verigene Gram-positiv blodkulturassay (BC-GP) i to specielle sundhedsplejesituationer og at bestemme den potentielle virkning af hurtig blodkulturtestning for Gram-positiv bakteriæmi inden for det japanske sundhedssystem. Endvidere omfattede undersøgelsen simulerede blodkulturer, som omfattede et bibliotek af velkarakteriserede methicillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA) og vancomycinresistente enterokokker (VRE) isolater, der afspejler forskellige geografiske regioner i Japan. Metoder. Der blev udført i alt 347 BC-GP-analyser på kliniske og simulerede blodkulturer. BC-GP-resultaterne blev sammenlignet med resultater opnået ved hjælp af referencemetoder til identifikation af slægt/art og påvisning af resistensgener ved hjælp af molekylære metoder og MALDI-TOF MS-metodologier. Resultater. For identifikation og påvisning af resistensgener på to kliniske steder og simulerede blodkulturer var den samlede overensstemmelse mellem BC-GP og referencemetoder 327/347 (94 %). Tiden til identifikation og påvisning af antimikrobiel resistens ved hjælp af BC-GP var betydeligt kortere sammenlignet med rutinemæssig testning, især på det kardiologiske hospital, som ikke tilbyder klinisk mikrobiologisk service i weekender og på helligdage. Konklusion. BC-GP genererede præcis identifikation og påvisning af resistensmarkører sammenlignet med rutinemæssige laboratoriemetoder for Gram-positive organismer i specialiserede kliniske omgivelser, der giver hurtigere resultater end nuværende rutinemæssige testning.

1. Introduktion

Gram-positive bakterier er de mest fremherskende mikroorganismer, der er forbundet med sepsis i sundhedsvæsenet og den mest udbredte årsag til bakteriæmi hos patienter med hæmatopoietisk stamcelletransplantation . Enterokokkerbakteriæmi er forbundet med øget risiko for dødelighed hos patienter med hæmatopoietisk stamcelletransplantation, uanset om de er modtagelige for vancomycin . På kardiologiske afdelinger er infektiøs endokarditis, infektiøs aneurisme, kateterrelaterede blodstrømsinfektioner eller infektioner på operationsstedet efter kardiologiske operationer de vigtigste infektioner, hvor de hyppigste forårsagende mikroorganismer er grampositive kokker . I begge medicinske enheder er tidlig påvisning af Gram-positive og resistente markører meget kritisk for styring af patientpleje, antibiotisk stewardship og forebyggelse af spredning af resistente mikroorganismer.

Da tidlig indgriben med antimikrobiel behandling er forbundet med forbedret prognose, idet hver times forsinkelse er forbundet med øget dødelighed, er hurtig diagnose afgørende . Verigene Gram-positive blood culture assay (BC-GP) (Nanosphere, Inc., Northbrook, IL) er et mikroarray-system fra prøve til resultat til identifikation af almindelige Gram-positive bakterier og vigtige resistensmarkører direkte fra positiv blodkultur. Selv om en række undersøgelser tidligere har evalueret BC-GP-rapporteringens ydeevne, der varierer fra 92 til 99 % overensstemmelse med konventionel metodologi , har en begrænsning i tidligere rapporter været, at mange af undersøgelserne har været fra USA samt lande uden for Japan med kun én offentliggjort rapport af begrænset omfang i Japan .

Genetisk variation mellem bakteriel lineage, der cirkulerer i forskellige geografiske regioner i verden, kan påvirke følsomheden af molekylære assays baseret på oligonukleotidprober til påvisning af organismer eller resistensmarkører. Undersøgelser i Hongkong og Belgien har rapporteret om lavere BC-GP-ydeevne .

Sigtet med denne undersøgelse var at bestemme den potentielle indvirkning på patienthåndtering og patientresultatet af BC-GP i specialiserede hospitalsindlæggelser inden for det japanske sundhedsvæsen, som står over for en række udfordringer. En stadig mere aldrende befolkning og den ledsagende byrde af stigende samlede sundhedsudgifter har udfordret sundhedsinfrastrukturen. På trods af at methicillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) tegner sig for over 90 % af de hospitalserhvervede infektioner forårsaget af resistente bakterier i Japan , er outsourcing af klinisk mikrobiologisk testning eller ingen weekenddækning almindelig i mange sundhedsfaciliteter som en del af omkostningsbegrænsning. Denne artikel repræsenterer den første omfattende evaluering af BC-GP i Japan med henblik på at validere dens kliniske ydeevne. Den simulerede blodkulturundersøgelse omfatter et bibliotek af velkarakteriserede sundhedsrelaterede MRSA (HA-MRSA), samfundserhvervede MRSA (CA-MRSA) og vancomycinresistente enterokokker (VRE) stammer, der cirkulerer i Japan.

2. Metoder

BC-GP blev evalueret på Toranomon Hospital (TH) og Sakakibara Heart Institute (SHI) i overensstemmelse med stedsspecifikke institutionelle undersøgelsesprotokoller, der er godkendt af det institutionelle review board, i perioden fra 26. juni 2012 til 6. marts 2013. TH er et almindeligt undervisningshospital med 1168 senge med en hæmatologisk afdeling med 123 senge til hæmatopoietisk stamcelletransplantation, der udfører 140 til 160 hæmatopoietiske stamcelletransplantationer om året. Hospitalets mikrobiologiske laboratorium er åbent dagligt i dagtimerne. SHI er et undervisningshospital med 320 senge med speciale i hjerte-kar-sygdomme, hvor der foretages over 1 500 operationer af åbne hjerter om året. Hospitalets mikrobiologiske laboratorium drives af et eksternt kommercielt referencelaboratorium. Mikrobiologilaboratoriet opererer i dagvagten på hverdage og er lukket i weekender og på helligdage.

Blodkulturer blev udført på SHI ved hjælp af BacT/ALERT FA-flasker og overvågning med BacT/ALERT 3D (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankrig). TH anvendte BACTEC Plus-flasker og overvågning med BACTEC 9240 og FX (Becton Dickinson, Franklin Lakes, og NJ). Kun én positiv blodkulturflaske med Gram-positive kokker eller baciller pr. patient blev medtaget i undersøgelsen. To ml positivt blodkulturmedium blev opbevaret ved -85C med henblik på fornyet testning.

Routinemæssig mikrobiologisk identifikation og modtagelighedstest af isolater blev udført ved hjælp af konventionelle identifikationstest såsom galdeopløselighed, optochin diskmodtagelighed og MicroScan WalkAway-systemet (Beckman Coulter, Pasadena, CA) hos TH og Vitek 2-systemet (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankrig) hos SHI. Cefoxitin-screening for methicillinresistens blev udført i overensstemmelse med CLSI-retningslinjerne . Der blev også anvendt en latex-agglutinationstest til påvisning af penicillinbindende protein PBP2a .

BC-GP-testning blev udført på positive blodkulturer, der viste Gram-positive organismer, i henhold til producentens anvisninger. Kort fortalt blev en godt blandet 350 μl prøve af blodkulturmediet pipetteret i prøvebrønden i BC-GP-nukleinekstraktionsbakken, placeret på Verigene Processor SP til behandling og analyse med Verigene Reader.

Der blev foretaget en vurdering for at bestemme forskellen i tid mellem indberetning af resultater ved hjælp af BC-GP og kulturbaseret identifikation og antimikrobielle modtagelighedsresultater for 139 positive blodkulturbøller. For kulturbaserede resultater var den tid, der var nødvendig, indtil den endelige rapport blev udarbejdet, tiden mellem aflæsning af Gram-fæver og indtastning af de endelige identifikations- og modtagelighedsresultater i laboratorieinformationssystemet. For BC-GP var tiden til resultat den tid, der gik mellem aflæsning af Gram-færgefarve og indtastning af BC-GP-resultater i laboratorieinformationssystemet.

Et udfordringssæt på 208 simulerede blodkulturer blev konstrueret ved hjælp af type, referencestammer og kliniske stammer fra forskellige geografiske regioner i Japan for at evaluere BC-GP. De kliniske stammer omfattede organismer, som udgjorde udfordringer for kommercielle identifikationssystemer i tidligere kliniske undersøgelser på TH og SHI. Desuden blev der også testet et bibliotek af velkarakteriserede HA-MRSA-, CA-MRSA- og VRE-stammer fra Japan. Simulerede blodkulturundersøgelser blev udført på Miroku Medical Laboratory (Saku City, Nagano Prefecture, Japan). To hundrede og otte stammer blev justeret til en turbiditet på ca. 100 CFU/ml i steril saltvand. Tre hundrede μl blev inokuleret i BACTEC Plus Aerobic/F-flasker indeholdende 8 til 10 ml humant fuldblod (blodtype O, Tennessee Blood Services, Memphis, TN) for at opnå et endeligt inokulum på 30 CFU/flaske. Der blev også inokuleret en BACTEC Plus Anaerobic/F-flaske til S. pneumoniae og S. anginosus-gruppen. Hver flaske blev inkuberet i BACTEC-systemet, indtil der blev genereret et positivt signal. Hvis BC-GP gav negative resultater, blev 11-dobbelt fortynding af blodkulturmediet med sterilt destilleret vand testet igen.

Hvert af de positive blodkulturisolater på de to hospitalssteder blev opbevaret i 10 % skummetmælk (Difco) ved -85C. Artsidentifikation blev bekræftet ved hjælp af matrix-assisteret laserdesorptionsionisering-tidspunkt for flyvemassespektrometri (MALDI-TOF MS) (Microflex LT med Biotyper ver. 3.0 software; Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Tyskland) for alle stammer . Hvis organismen ikke blev identificeret til artsniveau ved MALDI-TOF MS (scoreværdi < 2,0) eller identificeret som Micrococcus, Listeria, Staphylococcus andre end S. aureus, Streptococcus andre end S. pyogenes og S. agalactiae, blev der udført bekræftende test ved PCR-direkte sekventering af 16S rDNA eller sodA på Juntendo University eller Tokyo Women’s Medical University . Der blev udført specifik PCR til påvisning af mecA i alle stafylokokker og vanA, vanB i alle enterokokker . De metoder, der anvendes til SCCmec-typebestemmelse af samfundserhvervet eller sundhedsassocieret MRSA, der anvendes til at karakterisere stammer, er tidligere beskrevet .

Overensstemmelse blev bestemt i sammenligning med resultaterne af referencemetoderne. Der var overensstemmelse, hvis BC-GP-måldetektion stemte overens med referencemetoden på enten slægts- eller artsniveau. De femoghalvfems procent konfidensintervaller (95 % CI) og den parrede -test blev bestemt ved hjælp af GraphPad StatMate (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

3. Resultater

I denne undersøgelse var den samlede identifikationsoverensstemmelse mellem BC-GP og referencemetoden 327/347 (94 %) for prospektive blodkulturer på to kliniske steder og simulerede blodkulturer. Den kombinerede overensstemmelse mellem PCR og BC-GP for mecA-detektion var 71/73 (97 %) for prospektive blodkulturer og simulerede blodkulturer.

Den kombinerede identifikationsnøjagtighed fra begge hospitalssteder var 129/139 (93 %). For monomikrobielle kulturer var identifikationsnøjagtigheden 121/124 (98 %). Overensstemmelsen mellem PCR og BC-GP for mecA-positivitet var 51/53 (96 %). Tabel 1 viser resultaterne fra TH. Samlet set blev 96/104 (92 %) organismer identificeret korrekt af BC-GP til arts- eller slægtsniveau, herunder påvisning af resistensgener. Som det fremgår af tabel 2, var den samlede overensstemmelse mellem BC-GP og referencemetoden på SHI 33/35 (94 %) organismer.

BC-GP rapporterer tilstedeværelsen af mecA kun for S. aureus og S. epidermidis. I denne undersøgelse var 72 af de 102 stafylokokstammer ud af 102 stafylokokstammer enten S. aureus eller S. epidermidis. Uoverensstemmende resultater skyldtes ikke påviselige mecA S. epidermidis-organismer i polymikrobielle kulturer, der indeholdt både mecA-positive og mecA-negative S. epidermidis-organismer. Af de 30 Staphylococcus spp. ud over S. epidermidis og S. aureus var 21 (70 %) positive for mecA, herunder 2 S. lugdunensis, som ikke kunne rapporteres som mecA-positive af BC-GP.

Tabel 3 viser forskellen i tid mellem genereringen af BC-GP-resultater og kulturbaserede endelige identifikations- og antimikrobielle modtagelighedsresultater på begge hospitaler. BC-GP-resultaterne forelå i gennemsnit mellem 28,2 og 51,0 timer før de endelige kulturbaserede identifikations- og modtagelighedsresultater på TH. På SHI fremkom BC-GP-resultaterne i gennemsnit 34,5 til 196,6 timer tidligere. Ved sammenligning af tiden til endelige kulturbaserede identifikations- og modtagelighedsresultater på TH og SHI krævede resultaterne for S. epidermidis og andre koagulase-negative stafylokokker end S. epidermidis, enterokokokker og streptokokker, med undtagelse af S. aureus, betydeligt () længere tid på SHI (henholdsvis 83,3, 123,6, 159,1 og 199,1 timer) sammenlignet med TH (henholdsvis 40,8, 53,9, 36,1 og 53,5 timer).

Ved simulerede Gram-positive blodkulturer identificerede BC-GP korrekt 198/208 (95 %) af organismerne (tabel 4). Seks streptokokker (3 %) blev enten fejlagtigt identificeret eller kun identificeret på slægtsniveau af BC-GP. Med hensyn til de 4 BC-GP-flasker med falsk negative blodkulturer blev 1 S. pyogenes korrekt identificeret, og 1 S. mitis gav et positivt Streptococcus genus/S. pneumoniae-signal efter 11-dobbelt fortynding af blodkulturmediet. MecA-genet blev påvist i 20/20 (100 %) MRSA-organismer, der repræsenterer samfundserhvervede (SCCmec type IIa, IV og V) og sundhedsassocierede (SCCmec type I, IIb, III og ikke-typeable) stammer, ved hjælp af BC-GP. BC-GP påviste 14/14 (100 %) vanA- og 20/20 (100 %) vanB-gener i velkarakteriserede VRE-stammer fra tidligere undersøgelser i Japan.

4. Diskussion

Den præstation af BC-GP, der blev observeret i vores undersøgelse, svarede til tidligere rapporter . Da de kliniske mikrobiologiske tjenester er outsourcet eller ikke fungerer i off-shift på hverdage og er lukket i weekender og helligdage på mange hospitaler i Japan, har hurtig diagnostisk testning et betydeligt potentiale til at påvirke patientplejen ved dramatisk at reducere tiden til organismidentifikation og antimikrobielle modtagelighed resultater.

BC-GP påviser mecA i alle stafylokokker baseret på måling af signalintensitet; rapporteringen er imidlertid begrænset til S. aureus og S. epidermidis baseret på en algoritme, hvor mecA kun rapporteres, når S. aureus eller S. epidermidis påvises af BC-GP. I fremtidige versioner af BC-GP bør det overvejes at ændre algoritmen, så det bliver muligt at indberette mecA-detektion for andre stafylokokker end S. aureus eller S. epidermidis, da 70 % af de 30 stammer, der ikke var S. aureus og S. epidermidis, i vores undersøgelse var methicillinresistente. Selv om S. epidermidis er det vigtigste koagulase-negative stafylokokkerpatogen, er andre stafylokokker som S. lugdunensis og S. haemolyticus vigtige patogener i sundhedsvæsenet.

Polymikrobielt positive blodkulturer genererede størstedelen af diskordancen. I modsætning hertil var BC-GP’s ydeevne 121/124 (98 %) i monomikrobielle kliniske blodkulturer og 198/208 (95 %) i simulerede blodkulturer. I denne undersøgelse tegnede polymikrobielle blodkulturer sig for henholdsvis 14/106 (13 %) og 3/33 (9 %) af de positive blodkulturer ved TH og SH. Tilsammen udgjorde polymikrobielle kulturer 17/139 (12 %) af de prospektive kliniske blodkulturer, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der rapporterer, at 6-20 % af alle blodstrømsinfektioner er polymikrobielle . BC-GP identificerede korrekt alle organismerne i 12/17 (70 %) af de polymikrobielle kulturer. I tidligere BC-GP-undersøgelser varierede den korrekte identifikationsrate i polymikrobielle kulturer fra 57 til 86 % . Da misvisende oplysninger kan påvirke den kliniske diagnose og resultere i uhensigtsmæssig udvælgelse af antimikrobielle midler, er der behov for at forstå begrænsningerne ved BC-GP.

Et yderligere problem med polymikrobielle kulturer er den kliniske fortolkning af mecA-detektion og stafylokok-detektion. I vores 17-polymikrobielle kulturer gav 5 prøver 2 eller 3 stafylokokstammer med eller uden mecA. Dette kan føre til unødvendig brug af vancomycin eller undervurderer infektion forårsaget af methicillinresistente stafylokokker. Gentagelse af BC-GP på et andet sæt blodkulturer kan mindske risikoen for dette problem. For monomikrobielle kulturer eller simulerede kulturer blev alle uoverensstemmelser observeret med streptokokker undtagen for 1 S. caprae-stamme. BC-GP-fejlidentifikation for streptokokker omfattede 2 S. mitis identificeret som S. pneumoniae, ingen påvisning af 2 S. pneumoniae, 2 S. anginosus-gruppe og 2 S. pyogenes. I tidligere rapporter er der også rapporteret om lignende resultater for S. mitis, S. oralis og S. pneumoniae . Da den genetiske beslægtethed mellem S. mitis, S. oralis og S. pneumoniae er velkendt på grundlag af >99% homologi af 16S rRNA-gensekvenser , bør BC-GP-resultater for S. pneumoniae eller Streptococcus med alfahæmolyse uden positive artsspecifikke signaler fortolkes omhyggeligt og bekræftes ved hjælp af konventionelle metoder såsom optochinfølsomhed eller galdeopløselighedstest . Interessant nok kan en 11-dobbelt fortynding af det oprindelige blodkulturmedium føre til påvisning af Streptococcus-signalet og artssignalet (tabel 4). Der er rapporteret om en række påvisningsmuligheder afhængigt af organismen ved hjælp af BC-GP .

Den største fordel ved at anvende BC-GP er den tidligere tid til at rapportere identifikation og resistensdeterminanter fra positive blodkulturer, hvilket giver mulighed for tidligere valg af passende antimikrobiel behandling og gennemførelse af infektionsbekæmpelsesforanstaltninger såsom isolation og kontaktforebyggelse . Dette har potentiale til at få en betydelig indvirkning på det japanske sundhedsvæsen. Forskellen i tid mellem BC-GP-resultater og endelige kulturbaserede identifikations- og modtagelighedsresultater, der er vist i tabel 3 ved TH, er i overensstemmelse med tidligere rapporter . På den anden side afspejler de tidligere resultater på 80,7 til 196,6 timer for andre organismer end S. aureus ved hjælp af BC-GP på SHI, at de kliniske mikrobiologiske tjenester ikke er til rådighed i weekender og på helligdage. Da klinisk mikrobiologiske tjenester er outsourcet på mange hospitaler i Japan eller er begrænset til et skift på hverdage eller ikke tilbydes i weekender, er de potentielle cost-benefits ved at bibeholde bloddyrkningstjenester på hospitalerne betydelige. Desuden vil uddannelse af laboratoriepersonalet i det almindelige laboratorium i at genkende Gram-positive kokker og baciller gøre det muligt at foretage BC-GP-testning i weekenden og om aftenen/natperioden. BC-GP giver hospitalerne mulighed for at beholde en meget kritisk laboratorietjeneste internt.

Konklusionen er, at BC-GP gav nøjagtig identifikation og påvisning af resistensmarkører sammenlignet med rutinemæssige kulturbaserede laboratoriemetoder for Gram-positive organismer, herunder CA-MRSA, HA-MRSA og VRE-stammer, der cirkulerer i Japan. Minimering af tiden til optimering af antimikrobiel behandling ved hjælp af BC-GP kan bidrage til reducerede omkostninger og forbedret patientpleje. I 2016 modtog BC-GP myndighedsgodkendelse i Japan og blev den første molekylære multitarget-test for positive blodkulturer, der blev godkendt som et in vitro-diagnostisk udstyr til hjælp til diagnosticering af bakterielle blodstrømsinfektioner. Yderligere undersøgelser vil være nødvendige for at validere BC-GP’s omkostningseffektivitet inden for rammerne af det japanske sundhedssystem.

Ethisk godkendelse

Denne undersøgelse blev godkendt af TH og SHI’s interne review boards.

Konkurrerende interesser

Alle forfattere erklærer ingen konkurrerende interesser.

Autors bidrag

Ken Kikuchi designede og udførte undersøgelsen og udarbejdede manuskriptet. Mari Matsuda, Shigekazu Iguchi, Tomonori Mizutani, Kaori Sansaka, Kenta Negishi, Kimie Shimada, Shigeyuki Notake, Hideji Yanagisawa og Reiko Yabusaki udførte laboratoriearbejdet. Keiichi Hiramatsu, Michiru Tega-Ishii, Jun Umemura, Hiroshi Takahashi, Hideki Araoka og Akiko Yoneyama førte tilsyn med dataindsamlingen og koordinerede og deltog i udformningen af undersøgelsen.

Anerkendelser

Denne undersøgelse blev delvist støttet af et Grant-in-Aid (S0991013) fra Ministeriet for Uddannelse, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, Japan (MEXT), for Foundation of Strategic Research Projects in Private Universities.