Abstract

Urinærvejsinfektioner (UTI) er et globalt problem. Det meste UTI-forskning fokuserer på gramnegativ ætiologi. Enterobacteriaceae blev fundet at være den mest udbredte UTI-infektion, der udgør mere end 80 % af alle de rapporterede tilfælde. De vigtigste grampositive bakterier i UTI-tilfælde er Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis og Streptococcus agalactiae. Gram-positive patogener blev rapporteret i flere lande i både ukomplicerede og komplicerede urinvejsinfektioner. Antibiotikabehandling af grampositive bakterier er helt anderledes end antibiotikabehandling af gramnegative UTI-patogener. Symptomerne i forbindelse med UTI forårsaget af gram-positive og gram-negative bakterier er dog meget ens. Uden en korrekt diagnose er der stor risiko for at få en forkert diagnose og efterfølgende antibiotikabehandling. Der findes kun meget begrænsede undersøgelser, der fokuserer på ætiologi og deres antibiotikafølsomhed i Bangladesh-perspektiv. Vi søgte at søge at udfylde dette manglende forskningsområde. Denne undersøgelse har påvist 8,2 % gram-positive bakterier hos UTI-patienter. Prævalensen viser harmoni med de tidligere offentliggjorte rapporter. Mænd og kvinder blev fundet at være lige smittet af grampositive UTI-patogener. De fleste af de tidligere publikationer viser, at kvinder er mere sårbare over for gramnegative UTI-bakterier. Det er usandsynligt, at vores resultater viser, at mænd er lige sårbare over for gram-positive bakterier i forhold til kvinder. Yderligere undersøgelser med flere stikprøver kan retfærdiggøre de foreløbige resultater. Antibiogramanalyser viste, at amikacin og gentamicin var de mest effektive antibiotika mod vores testede isolater. I modsætning hertil blev nitrofurantoin fundet som det mest ineffektive lægemiddel i denne undersøgelse. Undersøgelsens resultater kan hjælpe med at ordinere antibiotika ud fra denne evidensbaserede undersøgelse.

Nøgleord

Nøgleord

uropatogen, UTI, antimikrobiel resistens, empirisk behandling, Bangladesh

Abkortninger

API: Analytic Profile Index; CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute; CLED: Cystein Lactose Electrolyte Deficient Agar; MDR: Multi Drug Resistant; MHA: Muller Hinton Agar; PBS: PBS: Phosphate Buffered Saline; UTI: Urinary Tract Infection

Introduktion

Urinærvejsinfektion (UTI) er en af de mest almindelige infektionssygdomme. De vigtigste årsagsmidler til urinvejsinfektioner er Escherichia coli og andre Enterobacteriaceae. Den resterende del er forbundet med en række forskellige organismer, herunder de grampositive bakterier Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae (gruppe B-streptokokker, GBS) og andre mindre hyppigt isolerede organismer . De mest udbredte gram-positive uropatogene bakterier omfatter Staphylococcus saprophyticus og Enterococcus facecalis . Gram-positive uropatogene bakterier blev rapporteret i flere lande i både ukomplicerede og komplicerede urinvejsinfektioner . Der er ikke foretaget sådanne eksklusive undersøgelser i Bangladeshs befolkning for at finde gram-positive UTI-ætiologi. Uden en korrekt diagnose er der stor risiko for at få forkert og uhensigtsmæssig medicinering og efterfølgende negative bivirkninger af den tilknyttede behandling. Gram-positive bakterier findes oftere som ætiologiske agenter for urinvejsinfektioner blandt gravide kvinder og ældre . Endvidere forekommer komplicerede urinvejsinfektioner ofte i nosokomiale og/eller institutionelle omgivelser, og disse personer er i større risiko for grampositive og polymikrobielle urinvejsinfektioner . De tegner sig for en stor del af antibiotikaforbruget og har en stor socioøkonomisk betydning og kan bidrage til bakteriel resistens . Klinikere står ofte over for problemer med at vælge et passende antibiotikum til empirisk behandling af urinvejsinfektioner . I Bangladesh medfører vilkårlig brug af antibiotika mange negative resultater for UTI-patienterne klinisk set med en langvarig økonomisk byrde. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere gram-positive uropatogeners modtagelighedsprofil over for forskellige antibiotika, der er ordineret. Vores undersøgelse har rationaliseret nødvendigheden af fortsat overvågning af urinvejsinficerede patienter for at opnå en bedre forståelse af deres nuværende epidemiologi med grampositive bakteriestammer i den bangladeshiske befolkning.

Metoder og materialer

Dataindsamling

Patienternes sociodemografiske oplysninger, behandlingshistorik (om patienterne blev behandlet med en antimikrobiel behandling) og eventuelle relevante kliniske oplysninger (nyresten, graviditet, nylig brug af kateter) blev registreret ved hjælp af et struktureret spørgeskema.

Studieopbygning og prøveindsamling

En tværsnitsundersøgelse blev gennemført mellem juli 2018 og december 2018 for at søge gram-positive bakterieisolater fra patienter med urinvejsinfektion. Denne undersøgelse blev designet på baggrund af laboratorieundersøgelser af urinprøver indsamlet fra UTI-patienter, der behandler på forskellige kommunehospitaler i Savar-området. For at aktualisere planlægningen blev sandsynlige UTI-patienter, der søgte lægehjælp på Gonosastha Hospital og Enam Medical College i Savar, Dhaka, anmodet om at deltage i denne undersøgelse. Undersøgelsen omfatter patienter med samtykke, der har kliniske tegn på UTI med symptomer i mindre end syv dage, der præsenteres på hospitalernes ambulatorium, og patienter, der er indlagt i mindre end 48 timer.

Bakteriel isolering og identifikation

For at isolere UTI-patogenet blev renfangede urinprøver midt i urinstrømmen opsamlet i sterile glasrør og inokuleret på et differentielt kulturmedium, cystein-, laktose- og elektrolytfattig (CLED) agar (Lyophilchem, Italien). Patienterne blev på forhånd forklaret om standardproceduren med ren fangst af midtvejsprøver for at undgå kontaminering med kommensale bakterier. For at undgå falsk-positive resultater blev urinprøverne udpladeret inden for 2 timer efter indsamling. Anvendelse af CLED-agar giver fordele i form af vækstunderstøttelse af de fleste potentielle uropatogener, herunder grampositive kokker som Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus og Enterococcus spp. Parallelt hermed blev der inokuleret Mannitol Salt Agar (MSA) for at målrette væksten af grampositive UTI’er. Urinkulturer blev inkuberet natten over ved 35ºC-37ºC i omgivende luft. Der blev foretaget kvantitative urinkulturer, og koloniantal på 102 eller 103 CFU/mL blev anset for at definere sandsynlig UTI-infektion hos de respektive patienter . Koloniantal på mindre end 102 CFU/mL blev anset for at være en potentiel kontaminering. De rensede bakteriekolonier blev identificeret ved gramfarvning, konventionelle biokemiske procedurer efterfulgt af et hurtigt biokemisk testkit (API 20E, BioMe´rieux, Durham, NC) bestående af et sæt kromogene paneler, kulhydratbatterier og enzymatiske substrater. Bakterieidentifikation blev yderligere valideret ved genotyping ved hjælp af 16S rRNA af isolaterne delvist.

Antimikrobiel følsomhedsvurdering

Isolater blev underkastet in vitro antibiotikafølsomhedstest ved hjælp af standard Kirby-Bauer diskdiffusionsmetode, og hæmningszonen blev fortolket i henhold til CLSI’s (Clinical amp; Laboratory Standards Institute-2010) anbefalinger. Seks antibiotikadisketter fra beta-lactam, nitrofurantoin og fluoroquinolon blev anbragt på bakterieplænen og inkuberet ved 37ºC for at bestemme følsomhedsmønsteret. Sensitive bakterier gav en klar zone omkring antibiotikadiscen, og zonediameteren blev målt for at sammenligne med standarden.

Detektion af β-lactamase- og quinolonresistente gener

Isolater, der udviste resistent fænotypisk, blev underkastet PCR til påvisning af blaTEM- og qnrS-genet. Der blev fremstillet i alt seks bakteriel lysater. PCR blev udført i PCR-rør indeholdende bakteriel lysat som DNA-template (1 µl) med et slutvolumen på 12 µl indeholdende DNA 2x premix (6 µl), 5 pmol af hver primer (1 µl) og deioniseret vand (4 µl). PCR blev udført i en termisk cycler, og cyklusbetingelserne for bla TEM og qnrS var: indledende denaturering ved 94°C i 5 min efterfulgt af 32 amplifikationscyklusser med denaturering ved 94°C i 30 s, annealing ved 50°C i 30 s (blaTEM) og 55°C i 30 s (qnrS) og forlængelse ved 72°C i 1 min og afsluttende med en endelig forlængelse ved 72°C i 7 min. PCR-produkter af den forventede størrelse blev oprenset og sekventeret ved hjælp af de samme primere, som blev anvendt til at generere PCR-produkterne.

Statistiske analyser

Som beskrevet blev den validerede Bangla-version af spørgeskemaet anvendt til dataindsamling. Udfyldte dataindsamlingsformularer blev efterkontrolleret af tilsynsførende for dataindsamling. Tilfældigt udvalgte 10 % laboratorieanalyser blev udført to gange af forskellige forskere for at sikre laboratoriedataenes autenticitet og for at vurdere bias mellem forskerne. Verificerede data blev indtastet og efterfølgende analyseret ved hjælp af IBM SPSS Statistics data editor (version 21). Manglende data blev udelukket fra den bivariate analyse. De beskrivende statistikker blev rapporteret som hyppighed, procentdel og gennemsnit, hvor det var relevant, sammen med standardafvigelse. Testbakteriernes antimikrobielle modtagelighed blev vurderet ved hjælp af en kategorisk vurderingsskala af 3-typen som modtagelig (antibiotikum angivet som fuldt effektivt), intermediær (angivet som delvist effektivt) og resistent (angivet som ikke-effektivt). Til testning af sammenhængen mellem kategoriske data blev Pearsons chi-square-test anvendt, og Yates korrektion for kontinuitet blev anvendt, hvor det var relevant. Som sådan blev eksponeringen af antimikrobielle stoffer for erhvervelse af antibiotikaresistente gener beregnet. Korrelationskoefficienten blev beregnet for at kontrollere styrken af forbindelsen. Der blev udført uafhængige t-tests ved sammenligning af middelværdierne for kontinuerlige variabler. En tosidet p-værdi mindre end 0,05, blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Demografiske oplysninger om undersøgelsespopulationen

Vi henvendte os til patienter, der besøgte læger på Gonosatha Medical College med deres UTI-associerede komplikationer. Vi inkluderede 147 patienter i denne undersøgelse, som havde alvorlige kliniske symptomer. Af dem var 36 (24,5 %) mænd, og de resterende 111 (75,5 %) var kvinder. Derfor blev næsten tre gange så mange UTI-patienter fundet kvindelige i forhold til deres modsatte køn (figur 1). Chi-square-test viste, at kvindeligt køn var forbundet med et signifikant højere antal UTI-hændelser (p = 0,04). Aldersfordelingen af vores undersøgelsestilfælde ligger fra under et år til over 70 år. Den hyppigste UTI-infektion var dog i aldersgruppen mellem 21-30 år. Den samlede aldersfordeling af tilfældene blev beskrevet i tabel 1. I alt fem ud af 12 Staphylococcus spp. (42 %) blev identificeret i aldersgruppen 21-30 år. Der blev ikke observeret nogen anden tendens i aldersfordelingen infektion af gram-positiv UTI-infektion.

Figur 1. Fordeling af gram-positive og gram-negative bakterier blandt mænd og kvinder. Kvinder havde et signifikant højere antal UTI end mænd, som var forårsaget af gramnegative bakterier. I tilfælde af gram-positiv urinvejsinfektion viste mænd og kvinder samme sårbarhed

Tabel 1. Alder-fordeling af UTI-undersøgelsespatienter

Isolering og identifikation af gram-positive UTI-patogener

Vi undersøgte 147 urinprøver fra klinisk symptomatiske patienter. CLED-kulturmediet producerede forskellige farvekolonier for forskellige UTI-patogener. Gram-positive Staphylococcus aureus producerer gule kolonier og Staphylococcus saprophyticus genererer hvide til gullige kolonier, og Enterococcus spp producerer farveløse til gule kolonier der. Gramnegative bakterier producerer forskellige andre farver. Derfor kan identifikation af UTI-bakterier ved at observere kolonifarver på CLED være en formodning, men det er vanskeligt at konkludere. Vi subkulturerede de sandsynlige Gram-positive kolonier fra CLED-kulturmediet på Mannitol Salt Agar (MSA) og inkuberede dem natten over ved 37 °C. Vækstkolonierne på MSA var hvide til gullige og lyserøde. Bakterier fra MSA blev underkastet Gram-farvning og fundet Gram-positive af natur. De foreløbige grampositive UTI-bakterier, der er blevet identificeret ved denne undersøgelse, er Staphylococcus-arter. Analytisk profileringsindeks (API) og/eller 16sRNA DNA-sekventering kan foretages for at identificere ætiologien på artsniveau. Vi har påvist 12 gram-positive UTI-patogener, hvilket var 8,2 % af den samlede patogenpopulation.

Antimikrobielle resistensmønstre hos de gram-positive UTI-isolater

Disc diffusionseksperiment producerede klare zoner af bakteriel græsplæne på Muller-Hinton (MH) agar, hvilket indikerer modtagelighed for de respektive antibiotika, der er imprægneret der. I modsætning hertil gav resistente isolater ikke mulighed for en klar zone, selv ikke i tilstedeværelse af antibiotikadiscen. Ved vores vurdering blev der observeret en blandet tendens i modtagelighed over for de testede antibiotika. Den højeste resistens blev fundet over for nitrofurantoin (91,7 %), efterfulgt af amoxicillin (83 %) og ofloxacillin (50 %). Både gentamicin og amikacin blev fundet meget effektive lægemidler, hvor kun 8,3 % blev fundet resistente (figur 2).

Figur 2. Prævalens af antibiotikaresistens blandt gram-positive UTI-bakterier.
AMC: Amoxicillin; LOM: Lomefloxacin; OFX: Ofloxacin; CN: Gentamicin; AK: Amikacin; F: Nitrofurantoin. Amikacin og Gentamicin viste sig at være de mest effektive antibiotika mod Gram-positive UTI-bakterier. Nitrofurantoin blev fundet mindst effektivt blandt de testede antibiotika.

Antibiotikaresistente gener i gram-positive uropatogener

Vi fremstillede DNA-prøver fra alle 12 gram-positive isolater ved hjælp af varmekogningsmetoden. Cellevæggene i de gram-positive bakterier er normalt meget mere stive end gram-negative bakterier, hvilket kan påvirke frigørelsen af DNA ved varmekogningsmetoder. I den aktuelle analyse undersøgte vi beta-lactamring, der indeholder antibiotikaresistent gen bla-TEM, og fandt to isolater (2/6, 33 %) isolater positive. Tilsvarende undersøgte vi for fluoroquinolongruppen antibiotikaresistent gen qnr-S og fandt tre isolater positive (3/6, 50 %).

Diskussion

Urinvejsinfektioner er en af de mest almindelige sygdomme, der forekommer i medicinsk praksis, og som forårsager betydelig associeret sygelighed og forekommer fra nyfødte til ældre mennesker . Prævalensen af infektioner kan variere med alder, køn og visse prædisponerende faktorer. De fleste af de rapporterede urinvejsinfektioner var forårsaget af gramnegative bakterier, hovedsageligt Enterobacteriaceae. Der var også stærke beviser for gram-positiv UTI-infektion . Vi søgte at undersøge prævalensen af gram-positive UTI-patogener i den bangladeshiske befolkning. Empiriske behandlinger af urinvejsinfektioner baseret på sværhedsgradskriterier og kliniske symptomer indebærer en stor udfordring . Da antibiotikabehandling af grampositive bakterier er helt anderledes end antibiotikabehandling af gramnegative UTI-patogener, er der stor sandsynlighed for at få den forkerte behandling ved en empirisk tilgang. Derfor er en korrekt diagnose med specifik antibiotikafølsomhedsundersøgelse absolut nødvendig for at kunne fastlægge en eventuel behandlingsforvaltning. Da urinvejsinfektioner er en almindelig samfundserhvervet sygdom i Bangladesh, bliver en betydelig procentdel af befolkningen derfor hvert år smittet med denne sygdom. Undersøgelsen var designet til også at kontrollere antimikrobiel modtagelighed for gram-positive UTI-patogener. Vi påviste omkring 8.2% gram-position UTI etiologier, især Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus og Enterococcus spp. som vedhæftede tidligere offentliggjorte rapporter .

Falmindeligvis blev UTI-infektion registreret meget højere hos kvinder end hos mænd . Usandsynligt fandt vi, at halvdelen af den gram-positive infektion blev rapporteret hos mænd. De foreløbige resultater viste, at mænd er mere sårbare over for gram-positive infektioner i forhold til den generelle situation. Aldersfordelingen af vores undersøgelsestilfælde ligger fra under et år til over 70 år. Den hyppigste gram-positive UTI-infektion var dog i aldersgruppen mellem 21-30 år, hvilket understøttes andetsteds.

Antibiotikaresistens blandt uropatogener er blevet et problem for folkesundheden i Bangladesh. I denne undersøgelse blev antibiotikafølsomhedsprofiler af gram-positive UTI-patogener bestemt med seks forskellige antibiotikadisketter ved hjælp af en diskdiffusionstest. Den højeste procentdel af resistens blev observeret over for nitrofurantoin, mens den laveste procentdel af resistens blev fundet over for amikacin og gentamicin. Mindre end 10 % af de grampositive uropatogene viste sig at være resistente over for disse to antibiotika fra aminoglykosidgruppen. Resultaterne understøtter, at aminoglykosid er det foretrukne lægemiddel til behandling af gram-positive UTI-patogener. Blandt quinolongruppen af antibiotika blev den højeste procentdel af resistens fundet hos 2. generations lomefloxacin (75 %). Vores antibiogram viste, at nitrofurantoin ikke var et meget effektivt lægemiddel mod grampositive UTI-bakterier. Det gamle beta-lactam-antibiotikum, amoxicillin, var svagt funktionelt mod grampositive UTI-patogener. Fluorquinolon-antibiotika, ofloxacillin og lomefloxacin blev fundet moderat effektive.

Isolaterne blev testet for udvalgte AMR-gener ved polymerasekædereaktion (PCR) ved hjælp af primere, der er specifikke for påvisning af bla-TEM og qnrS. Ca. 33 % af isolaterne var positive for bla-TEM, og 50 % var positive for qnrS. Antibiotikaresistente gener blev påvist og viste harmoni med det fænotypiske modtagelighedsmønster. Selv om der blev undersøgt med største oprigtighed og engagement for at gennemføre undersøgelsen, kunne den ikke overskride sine begrænsninger, da stikprøvestørrelsen ikke var stor nok. På trods af denne begrænsning vil undersøgelsens resultater forhåbentlig hjælpe klinikere med at beslutte at ordinere antibiotika ud fra den evidensbaserede undersøgelse. Klinikeren bør tage sig af den specifikke diagnose, før han ordinerer empirisk antibiotikabehandling, især for mandlig UTI.

Ethisk erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske og forskningsgennemgangskomité ved Jahangirnagar University, Faculty of Biological Sciences, og mundtligt samtykke blev indhentet fra UTI-patienter og læger.

Akkreditering

Forfatterne vil gerne takke de respektive patienter og læger for deres samarbejde. Forfatterne anerkender bidraget fra personalet på det generelle laboratorium, Department of Microbiology, Jahangirnagar University.

Oplysning

Dette arbejde blev delvist støttet af Grant for Advance Research (GARE), Ministry of Education og The Ministry of Science and Technology Research Grant, Bangladesh, til Dr. Md. Salequl Islam.

1. Stamm WE, Norrby SR (2001) Urinary tract infections: disease panorama and challenges. J Infect Dis 183: S1-S4.
2. Hooton TM (2012) Klinisk praksis. Ukompliceret urinvejsinfektion. J Infect Dis 366: 1028-1037. Epub 2012/03/16.
3. Piette A, Verschraegen G (2009) Role of coagulase-negative staphylococci in human disease. Vet Microbiol 134: 45-54.
4. Edwards MS, Baker C (2005) Group B streptococcal infections. GROUP 12:c0060.
5. Matthews SJ, Lancaster JW (2011) Urinvejsinfektioner i den ældre befolkning. Am J Geriatr Pharmacother 9: 286-309.
6. Kline KA, Lewis AL (2016) Gram-positive uropatogener, polymikrobielle urinvejsinfektioner og den nye mikrobiota i urinvejene. Microbiol Spectr 4: 2.
7. Clouse K, Shehabi A, Suleimat AM, Faouri S, Khuri-Bulos N, et al. (2019) High prevalence of Group B Streptococcus colonization among pregnant women in Amman, Jordan. BMC pregnancy and childbirth 19: 177.
8. de Sousa VS, da-Silva APS, Sorenson L, Paschoal RP, Rabello RF, et al. (2017) Staphylococcus saprophyticus Recovered from Humans, Food, and Recreational Waters in Rio de Janeiro, Brazil. Int J Microbiol 2017: 4287547
9. Lee DH, Klinkova O, Kim JW, Nanjappa S, Greene JN (2019) A Case Series of Staphylococcus lugdunensis Infection in Cancer Patients at an Academic Cancer Institute in the United States (En sagsserie af Staphylococcus lugdunensis-infektion hos kræftpatienter på et akademisk kræftinstitut i USA). Infect Chemo 51: 45-53.
10. Kunin CM (1994) Urinvejsinfektioner hos kvinder. Clin Infect Dis 18: 1-10.
11. Croxen MA, Finlay BB (2010) Molekylære mekanismer for Escherichia coli-patogenicitet. Nat Rev Microbiol 8: 26-38.
12. Grude N, Tveten Y, Kristiansen BE (2001) Urinvejsinfektioner i Norge: bakteriel ætiologi og modtagelighed. En retrospektiv undersøgelse af kliniske isolater. Clin Microbiol Infect 7: 543-547.
13. Falagas ME, Giannopoulou KP, Kokolakis GN, Rafailidis PI (2008) Fosfomycin: anvendelse ud over urinvejs- og gastrointestinale infektioner. Clin Infect Dis 46: 1069-1077.
14. Stamm WE, Counts GW, Running KR, Fihn S, Turck M, et al. (1982) Diagnostik af coliform infektion hos akut dysuriske kvinder. N Engl J Med 307: 463-468.
15. Detweiler K, Mayers D, Fletcher SG (2015) Bacteruria and Urinary Tract Infections in the Elderly (Bakteriuri og urinvejsinfektioner hos ældre). Urol Clin North Am 42: 561-568.
16. Arshad M, Seed PC (2015) Urinary tract infections in the infant. Clin Perinatol 42: 17-28.
17. Tien BYQ, Goh HMS, Chong KKL, Bhaduri-Tagore S, Holec S, et al. (2017) Enterococcus faecalis Promotes Innate Immune Suppression and Polymicrobial Catheter-Associated Urinary Tract Infection (Enterokokokker faecalis fremmer den medfødte immunundertrykkelse og polymikrobiel kateterassocieret urinvejsinfektion). Infect Immun pii: e00378-17.
18. Vasquez V, Ampuero D, Padilla B (2017) Urinary tract infections in in inpatients: that challenge. Rev Esp Quimioter 30: S39-S41.
19. Hooton TM, Stamm WE (1997) Diagnostik og behandling af ukomplicerede urinvejsinfektioner. Infect Dis Clin North Am 11: 551-581.
20. Medina M, Castillo-Pino E (2019) An introduction to the epidemiology and burden of urinary tract infections. Ther Adv Urol 11: 1756287219832172.
21. Wallmark G, Arremark I, Telander B (1978) Staphylococcus saprophyticus: en hyppig årsag til akut urinvejsinfektion blandt kvindelige ambulante patienter. J Infect Dis 138: 791-797.