Diskretes Modell

Das Wachstum einer mikrobiellen Kolonie, die einen diffundierenden Nährstoff konsumiert, wird mit Hilfe des von Matsuura23 eingeführten gitterbasierten Modells dargestellt, dessen Einzelheiten in Abschnitt 3 erläutert werden. Kurz gesagt, wir betrachten ein rechteckiges Gitter mit L x- und L y-Stellen in x- bzw. y-Richtung. Die Anzahl der besetzten Zellen wird mit ν bezeichnet, die entsprechende Zelldichte ist ρ = ν/(L x L y ). Jedes Element des rechteckigen Gitters darf höchstens eine Zelle beherbergen, kann aber eine beliebige nichtnegative ganze Zahl von Nährstoffpartikeln enthalten, unabhängig davon, ob sich an diesem Ort auch eine Zelle befindet. Bei jedem Zeitschritt können die Hefezellen ein Nährstoffteilchen absorbieren, das sich an demselben Ort befindet, und eine einzelne Tochterzelle an einem benachbarten Ort in einer kardinalen Richtung erzeugen, während die Nährstoffteilchen s Schritte, ebenfalls in den kardinalen Richtungen, machen können. Als Anfangsbedingung werden Zellen in einem vorgeschriebenen Muster in das Gitter gesät, während eine Anzahl von Nährstoffpartikeln gleichmäßig nach dem Zufallsprinzip in der Domäne platziert wird, um eine bestimmte durchschnittliche Anfangskonzentration c0 zu erhalten. Die Begrenzungen des Bereichs werden als feste Wände behandelt, wodurch das experimentelle Verhalten in einer Petrischale nachgebildet wird. Wichtig ist, dass die von diesem Modell erzeugten Muster das Ergebnis der Wechselwirkung zwischen den Zellen und dem Nährstoff allein sind, so dass alle durch das Modell erzeugten uneinheitlichen Morphologien ausschließlich auf DLG zurückgeführt werden können.

Charakteristische DLG-Morphologien

Matsushita & Fujikawa12 verwendete eine Kolonie von B. subtilis-Zellen, um drei Schlüsselphänomene zu veranschaulichen, die durch DLG entstehen: (I) die „Abschirmung“ kürzerer Zweige durch längere Zweige, (II) die Abstoßung zwischen benachbarten Kolonien und (III) das auf eine Nährstoffquelle gerichtete Wachstum (Abb. 2). Es wurde bereits gezeigt, dass diese Merkmale allein durch DLG entstehen, wobei ein gitterbasiertes Modell des Koloniewachstums verwendet wurde, das dem hier verwendeten ähnelt30. Wir bestätigen zunächst, dass das oben beschriebene diskrete Modell dieses Verhalten reproduzieren kann, bevor wir dieses Modell zur Quantifizierung der erzeugten Muster verwenden.

Experimentelle Ergebnisse von Matsushita & Fujikawa12 (obere Reihe) mit entsprechenden Modellsimulationen (untere Reihe). Dargestellt sind (a) größere Zweige, die kleinere Zweige von der Nährstoffzufuhr abschirmen (Phänomen I), (b) zwei dicht nebeneinander ausgesäte Kolonien, die sich gegenseitig abzustoßen scheinen (Phänomen II), und (c) eine einzelne Kolonie, die in Richtung der Nährstoffquelle auf der rechten Seite der Petrischale wächst (Phänomen III). Simulationen von (d) abschirmenden Verzweigungen, (e) zwei Kolonien in unmittelbarer Nähe und (f) Wachstum mit Nährstoff auf der rechten Seite werden mit dem gitterbasierten Modell berechnet. Die Keimzellen sind durch einen roten Punkt gekennzeichnet. Die Simulationen wurden auf Gittern mit den Abmessungen L x = L y = 200 mit den Parametern s = 3 und c0 = 1 berechnet, was zu einem Wert von Δ in der gleichen Größenordnung wie in den Experimenten führt. Die Abbildungen 2(a), 2(b) und 2(c) sind nachgedruckt aus Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 168, Mitsugu Matsushita und Hiroshi Fujikawa, Diffusion-limited growth in bacterial colony formation, 498-506, 1990, mit Erlaubnis von Elsevier.

Die Wechselwirkung zwischen den Zellen und dem Nährstoff lässt sich im Großen und Ganzen durch den Vergleich der relativen Ausbreitungsrate dieser beiden Größen quantifizieren. Das Wachstum der Kolonie wird gemessen, indem man die durchschnittliche Änderungsrate der Koloniefläche Δ m bei Betrachtung von oben berechnet, die die gleiche Einheit wie die Diffusivität hat. Diese Größe lässt sich leicht aus einem experimentellen Bild oder aus simulierten Daten, wie sie das diskrete Modell liefert, berechnen. Die Ausbreitung des Nährstoffs Δ n wird als die Diffusivität von Glukose angenommen, da diese üblicherweise als Nährstoffquelle verwendet wird und sich die Diffusivität verschiedener Nährstoffe kaum unterscheidet. Die Diffusionsfähigkeit von Glukose in Wasser ist bekanntlich ungefähr \({D}_{0}=4,03\mal {10}^{-2}\)mm2 min-1, basierend auf experimentellen Beobachtungen36. Für Glukose in einem Agargel mit geringer Dichte ist die Diffusivität gegeben durch

wobei w der Gewichtsprozentsatz von Agar ist37. Unter der Annahme, dass w = 0,3 % ist, beträgt die Diffusivität 4,01×10-2 mm2 min-2, was der für den Rest dieser Studie verwendete Wert ist. Die Diffusionsfähigkeit ändert sich nur wenig mit der Agarmenge, und daher hat w einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Ergebnisse. Aus diesen Größen berechnen wir das Verhältnis

, das ein dimensionsloses Maß für die relativen Ausbreitungsraten liefert. Bei kleinen Werten von Δ diffundiert der Nährstoff auf einer schnelleren Zeitskala als das Zellwachstum, was bedeutet, dass alle lokalen Schwankungen der Nährstoffkonzentration sich zerstreuen, ohne die Morphologie der Kolonie zu beeinflussen. Ein Wert von Δ, der 1 oder größer ist, zeigt an, dass das Zellwachstum mindestens so schnell abläuft wie die Nährstoffdiffusion, und dass lokale Schwankungen der Nährstoffkonzentration Auswirkungen auf die Koloniemorphologie haben können. Von den drei Versuchsbildern enthält nur das Bild des gerichteten Wachstums ausreichende Informationen sowohl über den Maßstab als auch über die Zeit, die zur Berechnung von Δ erforderlich sind. Aus diesem Bild geht hervor, dass Δ ≈ 0,23. Setzt man im Modell s = 3 und c0 = 1, so erhält man Lösungen mit Δ-Werten zwischen 0,3 und 0,5, was in der gleichen Größenordnung liegt wie die experimentellen Ergebnisse und somit einen geeigneten Vergleich ermöglicht. Diese Parameterwerte werden für den Rest dieses Unterabschnitts verwendet. Das Verhalten in jedem der drei Fälle wird weiter unten anhand von räumlichen Indizes quantifiziert, ähnlich dem Ansatz von Binder et al.38. Bei jeder Simulation wird ein Gitter mit den Abmessungen L x = L y = 200 verwendet, das groß genug ist, um Merkmale mit ausreichender Auflösung zu erzeugen und gleichzeitig rechnerisch effizient zu sein.

Um die Verzweigungsabschirmung (Phänomen I) zu untersuchen, wird der Nährstoff gleichmäßig nach dem Zufallsprinzip über die Domäne verteilt und eine einzelne Zelle in der Mitte des Gitters platziert. Die Simulation wird so lange durchgeführt, bis die Gesamtzelldichte 0,2 erreicht, wie in der repräsentativen Kolonie in Abb. 2 zu sehen ist. Diese Kolonie weist große Verzweigungen auf, die vom Standort der zentralen Ausgangszelle ausgehen, mit kürzeren Verzweigungen dazwischen, die von den größeren Verzweigungen vor Nährstoffen abgeschirmt wurden, und zeigt ein deutlich ungleichmäßiges Wachstum. Dies entspricht dem von Matsushita & Fujikawa12 beobachteten Verhalten. Die Morphologie kann quantifiziert werden, indem zunächst die Winkel zu jeder Zelle gezählt werden, die gegen den Uhrzeigersinn von einem Referenzwinkel aus gemessen werden, wobei der Ursprung im Zentrum der Masse liegt. Die Zählungen werden mit den erwarteten Werten für gleichmäßig verteilte Zellen skaliert, und der Winkelindex für ungleichmäßiges Wachstum I θ ist definiert als die Standardabweichung der skalierten Zählungen, so dass größere Werte von I θ ein höheres Maß an ungleichmäßigem Wachstum anzeigen. Das experimentelle Bild hat einen Index von 0,18, während die Simulation einen Index von 0,2 aufweist, was darauf hindeutet, dass beide nahezu übereinstimmen.

Für den Fall der abstoßenden Kolonien (Phänomen II) wird der Nährstoff wieder gleichmäßig und zufällig über das Gebiet verteilt. Zwei Keimzellen werden vertikal in der Mitte der Domäne platziert, jeweils ein Achtel der Domänenbreite vom Zentrum entfernt, so dass die Zellen durch ein Viertel der gesamten Domänenbreite getrennt sind. Die Simulation wird so lange berechnet, bis die Gesamtzelldichte 0,2 erreicht hat. Eine typische Simulation ist in Abb. 2 dargestellt, die den von Matsushita & Fujikawa12 beobachteten Abstand zwischen den beiden Kolonien zeigt. Abstoßende Kolonien können durch Zählen der Gesamtzahl der Zellen ν und der Anzahl der Zellen ν c zwischen den beiden Keimzellen am Ende der Simulation quantifiziert werden. Der Index der Abstoßung ist dann definiert als I c = 1 – ν c /ν, der nahe bei 0,5 liegt, wenn die beiden Kolonien gleichmäßig wachsen, kleiner als 0,5, wenn sich eine Lücke bildet, und größer als 0,5, wenn die Kolonien bevorzugt zueinander wachsen. Die Standorte der Keimzellen für jede Kolonie im Versuchsbild werden angenähert, indem Linien entlang der Äste gezeichnet werden und festgestellt wird, wo sich diese kreuzen. Das experimentelle Bild und die Simulation haben die Indizes 0,19 bzw. 0,27, was darauf hindeutet, dass beide ähnliche Wachstumsmuster mit einem signifikanten Abstand zwischen den beiden Kolonien erzeugen.

Gerichtetes Wachstum (Phänomen III) wird simuliert, indem zunächst alle Nährstoffe in der Spalte ganz rechts im Bereich platziert werden, wobei eine einzelne Zelle in der Mitte des Bereichs platziert wird. Die Simulation wird dann so lange berechnet, bis die Zelldichte 0,1 erreicht. Eine typische Kolonie ist in Abb. 2 dargestellt, die dem experimentellen Ergebnis von Matsushita & Fujikawa12 sehr ähnlich ist. Um die Tendenz zu einer Seite des Bereichs zu messen, wird der Anteil I b der Zellen auf der rechten Seite des Bereichs im Verhältnis zur Gesamtzahl der Zellen berechnet, so dass I b ∈ gilt. Werte des Index I b nahe 0,5 weisen auf eine geringe Verzerrung hin, während I b < 0,5 eine Verzerrung zur rechten Seite und I b < 0,5 eine Verzerrung zur linken Seite anzeigt. Das experimentelle Bild hat einen Index von 0,92, was dem Simulationsindex von 0,93 sehr nahe kommt. In beiden Fällen weisen die Indizes auf eine große Wachstumsverzerrung in Richtung des ursprünglichen Nährstoffstandortes hin.

Wie von Ginovart et al.30 festgestellt, zeigen die guten qualitativen Übereinstimmungen zwischen den experimentellen Bildern und den Simulationen, dass DLG allein die Abschirmung, Abstoßung und das gerichtete Wachstum von B. subtilis-Kolonien bewirken kann. Wir haben diesen Vergleich durch die Verwendung eines quantitativen Vergleichs zwischen den Experimenten und einem mathematischen Modell noch verstärkt. So erwarten wir, dass diese Phänomene vorhanden sind, wenn DLG die Morphologie beeinflusst, während das Fehlen dieser Merkmale darauf schließen lässt, dass andere Mechanismen für das Wachstumsmuster verantwortlich sind. Entscheidend ist, dass die Übereinstimmung zwischen dem diskreten Modell und dem von Ginovart et al. vorgeschlagenen Modell zeigt, dass das hier verwendete diskrete Modell eine zufriedenstellende Darstellung von DLG liefert und somit zur Quantifizierung dieses Verhaltens verwendet werden kann.

Induzierung von DLG

Nachdem wir gezeigt haben, dass das diskrete Modell in der Lage ist, das DLG-Verhalten zu replizieren, quantifizieren wir hier die Abhängigkeit dieser Phänomene von den Modellparametern, um vorherzusagen, wann DLG-Effekte auftreten werden. Die Kolonien werden erneut auf einem Gitter mit den Abmessungen L x = L y = 200 simuliert, wobei dieselben drei Anfangsbedingungen und Abbruchkriterien wie im vorherigen Unterabschnitt verwendet werden. Die Simulationen werden 50 Mal für jedes Paar von Nährstoffstufen s = 1, 5, …, 37 und Anfangskonzentrationen c0 = 1, 2, …, 7 wiederholt. Für jedes Parameterpaar berechnen wir den entsprechenden Durchschnittsindex über die 50 Realisierungen.

Um das Verzweigungsscreening (Phänomen I) zu untersuchen, betrachten wir Kolonien, die aus einer einzigen Zelle in einem einheitlichen Nährstofffeld gewachsen sind, mit den entsprechenden Werten mittlerer Indexwerte \({\bar{I}}_{\theta }\) über die 50 Realisierungen, die in Abb. 3 gezeigt sind. Die größten Werte von \({\bar{I}}_{\theta }\) treten auf, wenn sowohl s als auch c0 klein sind, was auf zwei Faktoren zurückzuführen ist. Erstens ist die Diffusionsfähigkeit der Nährstoffe, d. h. s, im Verhältnis zur Zellwachstumsrate gering, so dass sich im gesamten Gebiet Schwankungen im Nährstoffgehalt ergeben. Zweitens führt die niedrige anfängliche Nährstoffkonzentration c0 dazu, dass diese Schwankungen zu Regionen führen, in denen der Nährstoffgehalt zu niedrig ist, um das Zellwachstum zu unterstützen. Wenn entweder s oder c0 größer ist, kann mindestens eine dieser Bedingungen nicht eintreten, und der Wert von \({\bar{I}}_{\theta }\) wird kleiner, was bedeutet, dass DLG keinen signifikanten Einfluss mehr auf die Kolonie hat. Diese Ergebnisse zeigen also, dass ungleichmäßige Muster nur dann auftreten können, wenn sowohl die Nährstoffdiffusivität im Verhältnis zur Zellwachstumsrate als auch die Nährstoffkonzentration gering sind.

Messungen der DLG-Effekte in simulierten mikrobiellen Kolonien. Alle Simulationen wurden mit dem gitterbasierten Modell unter Verwendung einer Reihe von Nährstoffschritten s und anfänglichen Nährstoffkonzentrationen c0 berechnet. Dargestellt sind (a) der mittlere Index \({\bar{I}}_{\theta }\) für Verzweigungsscreening (Phänomen I), (b) der mittlere Index \({\bar{I}}_{c}\) für abstoßende Kolonien (Phänomen II), und (c) der mittlere Index \({\bar{I}}_{b}\) für gerichtetes Wachstum (Phänomen III).

Ein ähnliches Verhalten wird für den abstoßenden Fall (Phänomen II) beobachtet, wie aus dem in Abb. 3 aufgetragenen durchschnittlichen Index \({\bar{I}}_{c}\) hervorgeht. Die größten Werte des Index werden bei kleinen Werten von s und c0 gefunden, was aus den gleichen Gründen wie bei \({\bar{I}}_{\theta }\) auftritt.

Das Verhalten für gerichtetes Wachstum (Phänomen III) ist anders, wie aus dem durchschnittlichen Index \({\bar{I}}_{b}\) in Abb. 3 ersichtlich ist. Bei kleinen Werten von s ist der Index \({\bar{I}}_{b}\) groß und variiert kaum mit c0. Mit zunehmendem s nimmt \({\bar{I}}_{b}\) ab und zeigt eine stärkere Abhängigkeit von c0, wobei die Werte von \({\bar{I}}_{b}\) bei kleineren c0 größer sind. Der Bereich der Parameterwerte, in dem gerichtetes Wachstum beobachtet werden kann, ist viel größer als bei den beiden anderen DLG-Phänomenen. Wenn also kein gerichtetes Wachstum auftritt, werden auch die beiden anderen Merkmale nicht auftreten, und somit bietet das gerichtete Wachstum eine nützliche erste Überprüfung für DLG, die einfach zu messen ist. Dieses Merkmal wird im weiteren Verlauf dieser Arbeit zur Prüfung auf DLG verwendet.

Kontinuumsmodell

Das Auftreten von DLG-Phänomenen hängt sowohl von der Nährstoffkonzentration als auch von den Diffusivitäten der beiden Arten ab. Während die Indizes die Abhängigkeit dieser Phänomene von der Anzahl der diskreten Nährstoffschritte s und der anfänglichen Nährstoffkonzentration c0 messen, konnte der Wert von Δ nur aus den simulierten Daten berechnet und nicht als Input für das Modell angegeben werden. Bei der Betrachtung experimenteller Daten ist es jedoch naheliegend, die relative Ausbreitung der Zellen und des Nährstoffs mit Hilfe von Δ zu charakterisieren, da diese leicht aus experimentellen Bildern gemessen werden kann. Wir führen hier ein deterministisches System von Reaktions-Diffusions-Gleichungen ein, das die Zelldichte und die Nährstoffkonzentration modelliert und die Spezifikation der relativen Diffusivitäten jeder Größe erlaubt, was der Einstellung von Δ entspricht. Während dieses Modell nicht geeignet ist, die in Abb. 2 beobachteten feinen Merkmale zu erfassen, ist es in der Lage, das gerichtete Wachstum in Richtung einer Nährstoffquelle (Phänomen III) zu replizieren, das über den größten Parameterbereich hinweg auftrat. Wir konzentrieren uns daher auf diesen Aspekt von DLG, der als leicht messbares Zeichen für das Auftreten von DLG dient.

Wir betrachten einen eindimensionalen Bereich, der ausreicht, um das allgemeine Verhalten des Modells zu veranschaulichen29,32,39. Unter Verwendung der dimensionslosen Position x, der Zeit t, der Zelldichte n(x,t) und der Nährstoffkonzentration g(x, t), die in Abschnitt 3 beschrieben wurden, reduzieren sich die herrschenden Gleichungen auf

Der Parameter D = D m /D n ist das Verhältnis der Zelldiffusivität D m zu der des Nährstoffs D n . Dies entspricht der Definition von Δ (2), wobei die Zelldiffusivität anstelle der gemessenen Änderungsrate der Koloniefläche verwendet wird. Der erste Term auf der rechten Seite beider Gleichungen stellt den Beitrag der Diffusion dar, während die zweiten Terme den Nährstoffverbrauch bzw. das Wachstum neuer Zellen darstellen, wobei c die dimensionslose Menge des pro neuer Zelle verbrauchten Nährstoffs ist.

Als Anfangsbedingungen werden die Zellen in der Mitte des Bereichs platziert, wobei der Nährstoff nach rechts gemäß

wobei N als dimensionslose Nährstoffkonzentration interpretiert werden kann. Zur Veranschaulichung des allgemeinen Verhaltens sind in Abb. 4 die Anfangsbedingungen für N = 1 dargestellt.

Ergebnisse des eindimensionalen Reaktions-Diffusions-Modells. (a) Die Anfangsbedingung für N = 1 zeigt, dass die Zellen in der Mitte der Domäne konzentriert sind, während sich der Nährstoff auf der rechten Seite befindet. (b) Die Maximalwerte von I b bis zum Zeitpunkt t = 1, aufgetragen gegen den Logarithmus zur Basis 10 von D und N, zeigen, dass DLG nur bei bestimmten Parameterwerten auftritt. Zwei repräsentative Beispiele sind markiert. (c) Beim größten Wert von I b, wenn D = 10-6 und N = 1, sind die Zellen immer noch fast symmetrisch um x = 0, während die Nährstoffkonzentration praktisch einheitlich geworden ist. (d) Die Verwendung von D = 10-0,5 und N = 105 führt zu einer deutlichen Verzerrung auf der rechten Seite, wo der Nährstoff ursprünglich konzentriert war.

Wenn man die in Abschnitt 3 angegebenen typischen Parameterwerte als fest ansieht, variiert der Wert von N nur aufgrund der physikalischen Nährstoffkonzentration. Betrachtet man ein Medium, das nur Nährstoffe enthält, die eine maximale Konzentration darstellen, so stellt man fest, dass der Wert von N nicht größer als etwa 105 sein kann. Die Lösungen werden also für 1 ≤ N ≤ 105 berechnet. Während typische experimentelle Beobachtungen darauf hindeuten, dass 10-3 ≤ D ≤10-1 ist, betrachten wir Werte für 10-6 ≤ D ≤103, um theoretisch zu untersuchen, wie sich das Verhalten mit D ändert. Für verschiedene Werte dieser Parameter berechnen wir den maximalen Wert von I b, der bis zum Zeitpunkt t = 1 beobachtet wird. Dies entspricht etwa 119 Wachstumstagen, was zwar länger ist als die typischen Versuchszeiten, aber sicherstellt, dass der Maximalwert von I b während der Simulation beobachtet wird. Die berechneten Indizes I b sind in Abb. 4 unter Verwendung einer logarithmischen Skala zur Basis 10 für beide Achsen aufgetragen. Für log(N) < 1 gibt es nur eine geringe oder gar keine Verzerrung im Wachstum der Zellen, gemessen durch I b . Bei größeren Werten von N hängt das Ausmaß der beobachteten Verzerrung vom Wert von D ab, wobei das Maximum in der Nähe von (D,N) = (1, 105) auftritt. Dieser Wert von D entspricht Zell- und Nährstoffdiffusivitäten gleicher Größenordnung, und um diesen Wert herum ist es möglich, eine Verzerrung des Wachstums für Werte von N so klein wie 101,5 zu beobachten. Unter typischen Versuchsbedingungen hat N eine Größenordnung von 2, was darauf hindeutet, dass DLG-Effekte am ehesten zu beobachten sind, wenn D nahe bei 1 liegt.

Die Bandbreite des Verhaltens wird weiter veranschaulicht, indem die Verteilungen von zwei kontrastierenden Beispielen betrachtet werden. In jedem Fall wird die Lösung zu dem Zeitpunkt gezeigt, der der maximalen Zellverschiebung entspricht. Für D = 10-6 und N = 1, wie in Abb. 4 dargestellt, ist die Nährstoffkonzentration praktisch gleichmäßig geworden, bevor die Zelldichte eine deutliche Tendenz zur rechten Seite entwickeln kann, wo der Nährstoff ursprünglich konzentriert war. Im Gegensatz dazu zeigen die Zellen bei D = 10-0,5 und N = 105, ebenfalls in Abb. 4 dargestellt, eine offensichtliche Vorliebe für die rechte Seite des Bereichs.

Die Analyse des Kontinuumsmodells deutet darauf hin, dass, wenn \(D\ll 1\), dann gerichtetes Wachstum und somit jegliche DLG-Effekte nur bei Werten von N auftreten, die mindestens so groß wie 103 sind. Da die Schätzungen darauf hindeuten, dass N eine Größenordnung von 2 hat, deutet dies darauf hin, dass DLG nur dann zu beobachten ist, wenn D nahe an der Einheit liegt, wie aus Abb. 4 ersichtlich. Dies kann auch anhand physikalischer Parameter veranschaulicht werden. Unter Verwendung der in Abschnitt 3 angegebenen Parameterwerte würden Mikroben mit einer Diffusivität \({D}_{m}=3\mal {10}^{-2}\)mm2 min-1 in einer Umgebung mit maximaler anfänglicher Nährstoffkonzentration \({N}_{0}\mathrm{=3,8}\mal {10}^{-3}\)g mm-2 ungefähr den dimensionslosen Werten D = 0,75 und N = 104 entsprechen. Nach Abb. 4 wäre zu erwarten, dass diese Art in Richtung einer Nährstoffquelle wächst und somit ein DLG-Verhalten zeigt. Würden dieselben Mikroben in eine Umgebung mit maximaler Nährstoffkonzentration \({N}_{0}\mathrm{=3,8}\mal {10}^{-6}\)g mm-2 gebracht, würde der Wert von N auf 10 fallen und ein einseitiges Wachstum wäre nicht mehr zu beobachten. Die Ergebnisse dieses Abschnitts bieten somit einen Rahmen, um allein auf der Grundlage von Schätzungen von D und N festzustellen, wann DLG zu erwarten ist.

Experimentelle Vergleiche

Nachdem wir die Modellvorhersagen untersucht haben, verwenden wir diese nun, um den dominanten Wachstumsmechanismus in mikrobiellen Kolonien zu identifizieren. Wir betrachten die drei in Abb. 1 dargestellten repräsentativen experimentellen Beispiele: zwei Kolonien des Bakteriums B. subtilis und eine Kolonie von S. cerevisiae. Da wir den geeigneten Wert des Diffusionsverhältnisses D, den das Reaktions-Diffusions-Modell verlangt, nicht kennen, wird das Wachstum stattdessen durch die relative Ausbreitung Δ (2) charakterisiert. Dieser Parameter stellt das Verhältnis zwischen der durchschnittlichen Änderungsrate der Koloniefläche, von oben betrachtet, und der Diffusionsfähigkeit der Glukose dar und kann anhand der Bilder gemessen werden. Da der Nährstoff gleichmäßig verteilt ist und nur eine einzige Kolonie gezüchtet wird, ist zu erwarten, dass sich DLG in diesen Beispielen als unregelmäßiges Wachstum mit Verzweigungsscreening manifestiert (Phänomen I).

Die berechneten Werte der Wachstumsraten Δ m sind in Tabelle 1 angegeben, zusammen mit den entsprechenden relativen Raten Δ. Diese Werte zeigen, dass die B. subtilis-Kolonien zwei Größenordnungen schneller wachsen als die Hefekolonie und eine Größenordnung langsamer als das Diffusionsvermögen von Glucose. Die Verwendung typischer Werte für die anfängliche Nährstoffkonzentration legt nahe, dass die Experimente einem Wert von N entsprechen, der die Größenordnung 2 hat. Ein Abgleich dieser Schätzung und der Werte von Δ mit den Modellergebnissen aus Abb. 4 zeigt, dass B. subtilis einem Regime entspricht, in dem ein gerichtetes Wachstum aufgrund von DLG stattfindet. Da diese Schätzung durch die Messung der Zellproliferationsrate p in einer Kolonie von S. cerevisiae vorgenommen wurde, die wahrscheinlich kleiner ist als der entsprechende Wert für Bakterien, wird erwartet, dass dies eine Unterschätzung für N ist und ein größerer Wert von N die Wahrscheinlichkeit der Beobachtung von DLG erhöht. Im Gegensatz dazu weist die S. cerevisiae-Kolonie ein Δ in der Größenordnung von -3 auf, was darauf hindeutet, dass der Nährstoff auf einer viel schnelleren Zeitskala diffundiert als das Zellwachstum. Folglich ist davon auszugehen, dass sich lokale Schwankungen der Nährstoffkonzentration verflüchtigen, bevor sie einen Einfluss auf die Morphologie der Kolonie haben. Dies deutet darauf hin, dass die Morphologie nicht von DLG beeinflusst wird. Trotz der großen Ähnlichkeit zwischen den Formen von Bakterien- und Hefekolonien in nährstoffarmen Umgebungen sind diese beiden Morphologien also auf unterschiedliche Phänomene zurückzuführen. Bakterienkolonien wachsen so schnell, dass die Nährstoffdiffusion das Wachstum begrenzen kann, was zu einem unregelmäßigen Muster führt. Das viel langsamere Wachstum von Hefekolonien bedeutet, dass DLG nicht auftreten kann und stattdessen die uneinheitlichen Koloniemorphologien, die in nährstoffarmen Umgebungen entstehen, allein auf pseudohyphales Wachstum zurückzuführen sein müssen.

Wir suchten nach einer weiteren Bestätigung dieser Ergebnisse, indem wir das gerichtete Wachstum (Phänomen III) in Kolonien von S. cerevisiae testeten und dabei den von Matsushita & Fujikawa12 und in den Simulationen verwendeten Aufbau nachahmten40. Eine Petrischale wurde mit synthetischer Dextrose mit niedrigem Ammoniumgehalt (SLAD) gefüllt, wobei der Nährstoff in die Mitte der Petrischale gegeben wurde. Die Hefezellen wurden in verschiedenen Abständen von der Mitte ausgesät und nach 16 Tagen Wachstum fotografiert. Weitere Einzelheiten zu den Versuchen finden sich in Abschnitt 3. Als begrenzter Nährstoff wurden sowohl Glukose als auch Ammoniumsulfat verwendet; repräsentative Bilder für beide sind in Abb. 5 zu sehen. Die Bilder sind so ausgerichtet, dass sich die Mitte der Petrischale, in die der Nährstoff eingebracht wurde, auf der rechten Seite befindet. Die Diffusionsfähigkeit von Ammonium in Wasser beträgt etwa 9,84×10-2 mm2 min-1 41. Da dies in der gleichen Größenordnung liegt wie die Diffusivität von Glukose, wird erwartet, dass jede Nährstoffquelle zu einem ähnlichen Wert von Δ führt. Keine der beiden Kolonien zeigt eine merkliche Verzerrung des Wachstums in irgendeine Richtung, und beide erzeugen Verzerrungsindizes I b, die fast genau gleich 0,5 sind. Die effektiven Diffusivitäten Δ m und die dimensionslosen Diffusivitäten Δ für jeden Versuch sind in Tabelle 2 angegeben. In beiden Fällen hat Δ die Größenordnung -3, was darauf hindeutet, dass ein gerichtetes Wachstum nicht beobachtet werden sollte und mit den Ergebnissen aus den vorherigen Experimenten übereinstimmt.

Bilder aus den Experimenten zum gerichteten Wachstum mit S. cerevisiae. Die Bilder sind so ausgerichtet, dass sich der entsprechende Nährstoff auf der rechten Seite der Kolonie befindet, wie durch den vertikalen Text angegeben. Die Kolonien wurden auf (a) SLAD-G mit Glukosezugabe auf der rechten Seite und (b) SLAD-N mit Ammoniumsulfatzugabe auf der rechten Seite gezüchtet. Die Skalenbalken stellen 5 mm dar.

Weitere Hinweise auf den Wachstumsmodus liefert das Verhalten in der Nähe des Randes der Kolonien. Es gibt deutliche Anzeichen für ein ungleichmäßiges Wachstum am Rand der Kolonie, die auf SLAD-N gewachsen ist, aber nicht auf der Kolonie, die auf SLAD-G gewachsen ist. Wenn dieses Muster auf DLG zurückzuführen wäre, würden wir ein ähnliches Verhalten auf beiden Medien erwarten. Es ist jedoch bekannt, dass diploide Hefen, wie der in diesem Versuch verwendete AWRI796-Stamm, zu pseudohyphalem Wachstum übergehen, wenn ihnen Stickstoff2 entzogen wird, wie z. B. auf SLAD-N. Dies deutet darauf hin, dass das in Hefekolonien beobachtete ungleichmäßige Wachstum, wie in Abb. 1 gezeigt, auf pseudohyphales Wachstum und nicht auf DLG zurückzuführen ist.