Die Etablierung genetischer Transformationssysteme hat es Wissenschaftlern ermöglicht, fremde DNA in filamentöse Pilze zu transformieren und so die gewünschten Stämme für industrielle Zwecke zu erhalten. Jetzt können wir die überlegene Sekretionskraft der Pilze und ihre hervorragende Effizienz bei der Herstellung wertvoller Metaboliten voll ausnutzen.

Protoplasten-vermittelte Transformation (PMT)

PMT ist die am häufigsten verwendete Pilztransformationsmethode, die auf einer großen Anzahl kompetenter Pilzprotoplasten beruht. Das Prinzip besteht darin, einige handelsübliche Enzyme zu verwenden, um komplexe Zellwandbestandteile von Pilzen zu entfernen und Protoplasten zu erzeugen. Anschließend werden einige chemische Reagenzien (wie z. B. PEG) verwendet, um die Fusion von exogenen Nukleinsäuren und Protoplasten zu fördern, wie im Folgenden näher beschrieben. Die Bestandteile der Pilzzellwand sind bei den verschiedenen Stämmen sehr unterschiedlich. Selbst die Bestandteile der Sporenhülle unterscheiden sich erheblich von denen der Hyphen desselben Stammes. Daher gibt es keine universelle Transformationsmethode, die auf verschiedene Pilzstämme angewendet werden kann. Die Herstellung von Protoplasten kann kaum standardisiert werden. Ein Teil der Schwierigkeiten ist auf unser begrenztes Wissen über Zellwandhydrolasen zurückzuführen. Die Entwicklung einer optimierten PMT-Methode für Pilze erfordert noch erhebliche Anstrengungen.

PMT ist eine routinemäßig verwendete Transformationsmethode. Die Methode wurde ständig verbessert, um eine höhere Effizienz bei der Gentransformation zu erreichen und geeignete Genorte durch Gen-Editierung anzusteuern. Zur Herstellung von Protoplasten muss die Zellwand entfernt werden, was hauptsächlich durch eine Enzymbehandlung erreicht wird. Es wurde auch über nicht enzymatische Methoden zur Herstellung von Protoplasten berichtet, z. B. über physikalische Methoden wie Mahlen und Überschallwellenschock. Sie werden jedoch wegen der praktischen Unannehmlichkeiten und der geringen Ausbeute an Protoplasten nicht häufig eingesetzt. Tabelle 1 gibt einen Überblick über Protoplasten-vermittelte Transformationsprotokolle für verschiedene Pilzarten.

Grundlegende Schritte der PMT-Methode

PMT wurde zuerst bei Saccharomyces cerevisiae angewandt. Die Forscher präparierten Protoplasten mit kommerzieller Schneckenase und verwendeten Sorbitol zur Konservierung der Protoplasten. Später wurde diese Methode auch auf filamentöse Pilze wie Neurospora crassa und A. nidulans angewandt. Obwohl die Transformationsmethoden verbessert wurden, sind die grundlegenden Schritte im Wesentlichen dieselben geblieben. Die grundlegenden Schritte der PMT-Methode sind in Abb. 1 dargestellt.

Grundlegende Schritte der protoplastenvermittelten Transformation

Präparation der Protoplasten

Der erste Schritt der Protoplastenpräparation ist die Entfernung der Zellwand durch enzymatischen Verdau. Die Pilzzellwand besteht aus Glucan, Mannan und Chitin. Die Struktur der Pilzzellwand ist sehr dynamisch, und die Zellwand verändert sich während der Zellteilung und des Wachstums der Pilze sowie bei der Sporenkeimung, der Hyphenverzweigung und der Bildung des Diaphragmas. Auch die Zellwandbestandteile sind bei den verschiedenen Pilzarten unterschiedlich, weshalb verschiedene Enzyme in Kombination verwendet werden sollten. Es wurde berichtet, dass die Auswahl einer geeigneten Enzymmischung ein Schlüsselfaktor bei der Protoplastenpräparation ist.

Im Allgemeinen sind die Hyphen empfindlich gegenüber einem geeigneten Enzym, das ihre Zellwand während der logarithmischen Phase hydrolysiert. Beim PMT-Verfahren von Neurospora werden die Protoplasten durch Hydrolyse der neugeborenen Hyphen hergestellt (Kultur für 4-6 h bei 25-30 °C). In ähnlicher Weise können Protoplasten auch mit Konidiosporen hergestellt werden. Bei Aspergillus und Penicillium kann man zum Beispiel Keimsporen oder Thalli wählen.

Protoplasten sind empfindlich gegenüber osmotischem Druck, daher sollte darauf geachtet werden, einen stabilen osmotischen Druck aufrechtzuerhalten, damit die Protoplasten während der Enzymolyse der Zellwände intakt bleiben. Daher sollten allen Puffern für die Protoplastenpräparation osmotische Stabilisatoren (wie Sorbit, Natriumchlorid und Kaliumchlorid) zugesetzt werden, um ein Reißen der Zellen zu vermeiden. So wird beispielsweise bei der Protoplastenpräparation von N. crassa , Aspergillus sp. und Trichoderma sp. eine Sorbitlösung mit einer Konzentration von 0,8-1,2 M verwendet, um die osmotische Stabilität der Protoplasten zu erhalten. Tabelle 2 enthält eine Zusammenfassung der Parameter für die Protoplastenpräparation einiger gängiger Pilzarten.

Aufnahme exogener DNA

Die zur Suspendierung von Protoplasten verwendete Lösung enthält in der Regel Calciumionen und osmotische Stabilisatoren. Es wird angenommen, dass Kalzium Kanäle in der Zytomembran öffnet, die den Eintritt der exogenen DNA in die Zelle erleichtern, während osmotische Stabilisatoren für die Aufrechterhaltung der Morphologie der Protoplasten notwendig sind. In der Regel wird eine bestimmte Menge Polyethylenglykol (PEG) zusammen mit gereinigter DNA (entweder zirkuläre doppelsträngige DNA oder linearisierte DNA) zugegeben. PEG ist ein häufig verwendeter Zellfusionspromotor. Es kann eine molekulare Brücke zwischen Zellen oder zwischen Zytomembran und DNA bilden und so die Adhäsion fördern. Darüber hinaus kann es auch ungeordnete Ladungen auf der Zytomembranoberfläche induzieren, die Membranpermeabilität verändern und das Eindringen von exogenen Nukleinsäuren in die Zellen erleichtern.

PEG ist ein entscheidender Wirkstoff, der die Transformationseffizienz erhöht. Eine geringe Transformationseffizienz kann in den meisten Fällen durch Zugabe von mehr PEG verbessert werden. Unter normalen Bedingungen ist die Leistung von niedermolekularem PEG (wie PEG3000) besser als die von hochmolekularem PEG (wie PEG8000). Dies muss jedoch für verschiedene Arten optimiert werden.

Die Umwandlungseffizienz wird auch durch die Temperatur beeinflusst. Im Allgemeinen sollte die Mischung aus DNA und Protoplasten für 15-30 Minuten auf Eis gelegt werden, damit die DNA an der Oberfläche der Protoplasten haften kann.

Regeneration von Protoplasten

Um eine gute Ausbeute an lebensfähigen Protoplasten zu gewährleisten, lässt man die Protoplasten eine gewisse Zeit auf der Platte ohne Selektionsdruck rekuperieren, bevor sie auf eine Selektionsplatte übertragen werden. Der Regenerationskultur sollte ein osmotischer Stabilisator beigegeben werden. Ein stabiler osmotischer Druck ist der Schlüsselfaktor für die Regeneration der Zellwand durch Protoplasten. Nur die Protoplasten, die exogene Nukleinsäuren tragen, können auf dem Selektivmedium wachsen.

Bemerkungen zur PMT-Methode

Die Methode der Protoplastentransformation ist einfach und effektiv und erfordert keine teure Ausrüstung. Aber das Protokoll umfasst viele Schritte und kritische Reagenzien. Jeder Schritt muss optimiert werden, und die Qualität der Reagenzien muss kritisch geprüft werden. Der Wachstumsstatus der zu transformierenden Pilze muss sorgfältig überwacht werden. Erfahrung ist entscheidend für die erfolgreiche Umsetzung dieser Methode.

Agrobacterium -vermittelte Transformation (AMT)

Agrobacterium ist ein gramnegatives Bakterium, das häufig im Boden vorkommt. Agrobacterium tumefaciens kann verletzte Pflanzen infizieren. Das Tumor-induzierende Plasmid von > 200 kb, das auch als Ti-Plasmid bezeichnet wird, konnte im frühen Stadium der Infektion isoliert werden. Wenn A. tumefaciens eine Pflanze infiziert, dringt es durch die Wunde in die Pflanze ein und integriert einen Teil des Ti-Plasmids in das Genom der infizierten Pflanzenzellen. Das integrierte DNA-Fragment aus dem Ti-Plasmid wird gemeinhin als Transfer-DNA oder T-DNA bezeichnet. Die T-DNA wird zufällig als Monoklon in das Pflanzengenom eingebaut. Die T-DNA wird von zwei richtungsabhängigen, unvollkommenen Wiederholungen flankiert (als linker und rechter Rand bezeichnet) und enthält Gene, die für Enzyme kodieren, die für die Bildung von Pflanzenhormonen verantwortlich sind, die das Tumorwachstum verursachen. Ein binärer Vektor wurde so konzipiert, dass das Zielgen zwischen der linken und rechten T-DNA-Grenze eingefügt wurde, und das rekombinante Plasmid wurde in Agrobacterium tumefaciens transformiert. Der positive Agrobacterium-Klon wurde als Vehikel für die Integration des Zielgens in das Pilzgenom verwendet. Die einzelnen Schritte werden weiter unten im Detail erörtert.

Die AMT-Methode hat sich als stabiler und effizienter als herkömmliche Transformationsmethoden erwiesen, seit in der ersten Veröffentlichung darüber berichtet wurde, dass diese Methode für die Pilztransformation angewendet werden kann. Die AMT-Methode wurde erstmals zur Transformation von S. cerevisiae eingesetzt. Ein Plasmid, das ein Hygromycin-Resistenzgen trägt, wird üblicherweise zur Transformation von Aspergillus awamori verwendet. Die AMT-Methode wurde auf viele Ascomyceten angewandt, darunter Aspergillus und Monascus purpureus. Die grundlegenden Schritte der AMT-Methode sind in Abb. 2 dargestellt. Eine Zusammenfassung des Agrobacterium-vermittelten Transformationsprotokolls für verschiedene Pilzarten ist in Tabelle 3 enthalten.

Die grundlegenden Schritte der Agrobacterium-vermittelten Transformation

Faktoren, die die AMT-Effizienz beeinflussen

Viele Faktoren beeinflussen die AMT-Effizienz, Dazu gehören die Art des Pilzausgangsmaterials (Protoplasten, Sporen, Hyphen und Fruchtkörpergewebe), die Acetosyringon-Konzentration, das Verhältnis von Pilz zu Agrobacterium und die Bedingungen für die Co-Kultur.

1. Die Art des Pilzausgangsmaterials Bei der AMT-Methode können Protoplasten, Sporen, Hyphen und Fruchtkörpergewebe von Pilzen als Empfänger verwendet werden. Für verschiedene Stämme sollten geeignete Ausgangsmaterialien ausgewählt werden. Zum Beispiel funktioniert die AMT-Methode nur für Protoplasten von Rhizopus oryzae und Mucor circinelloides, während Sporen oder Keimsporen keine Transformanten erzeugen würden.

2. Die Konzentration von Acetosyringon (AS) AS wirkt auf zwei Stufen während des AMT-Prozesses. Das eine ist der Induktionsprozess und das andere ist der Transformationsprozess. AS wird im Allgemeinen verwendet, um die Expression der Vir-Domäne der T-DNA zu induzieren, und das Gen in der Vir-Domäne aktiviert den Transfer der T-DNA. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass während des Transformationsprozesses eine angemessene Menge an AS erforderlich ist. Allerdings ist die Zugabe von AS in der Vorkulturphase des Agrobacteriums nicht unbedingt erforderlich, was bei einigen Stämmen die Transformationseffizienz verringern könnte. Die Konzentration von AS ist ein wichtiger Faktor, der die Transformationseffizienz während des Pilz-Agrobacterium-Kokultivierungsprozesses im AMT von Aspergillus awamori beeinflusst.

3. Das Verhältnis von Pilzen zu Agrobacterium Innerhalb bestimmter Grenzen erreicht die Transformationseffizienz das maximale Niveau mit der Erhöhung der Pilz- oder Agrobacteriummenge. Ein optimales Verhältnis für den AMT für verschiedene Pilze muss empirisch ermittelt werden. Das Verhältnis von Pilz- zu Bakterienzellen sollte für verschiedene Pilz-Agrobacterium-Transformationssysteme optimiert werden.

4. Die Bedingungen für die Co-Kultivierung Die Bedingungen für die Co-Kultivierung sind ein wichtiger Faktor bei der AMT-Methode. Dazu gehören die Kulturzeit, die Temperatur, der pH-Wert und die Auswahl des Filters. Die Temperatur und die Zeit für die Co-Kultivierung sind die Schlüsselfaktoren unter den AMT-Schritten. Bei der Pilz-Agrobakterium-Transformation sind eine Temperatur von 20-28 °C und eine Co-Kultivierungszeit von 16-96 h eine geeignete Startbedingung. Eine niedrigere Temperatur (20-25 °C) ist für die AMT-Methode in der Regel von Vorteil. Der hydrophile Filter, der als Träger für die Pilz-Agrobakterium-Kokultur dient, erleichtert die Übertragung einzelner Kolonien auf die Screening-Platte. Als Filter können eine Nitrocellulosemembran, eine Nylonmembran, Filterpapier, Zellophan und eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran verwendet werden.

Bemerkungen zur Agrobacterium-vermittelten Transformation

Die AMT-Methode eröffnet einen neuen Weg für Pilze, die sich mit herkömmlichen Methoden nicht transformieren lassen. Die AMT-Methode eignet sich besonders für die Erzeugung von Knock-in-Mutationen in Pilzen, da die T-DNA zufällig als einzelne Kopie in das Genom eingebaut wird. Darüber hinaus kann mit der AMT eine hohe Effizienz der homologen Rekombination in verschiedenen Gen-Targeting-Experimenten erreicht werden.

Zu den wichtigsten Vorteilen der AMT-Methode gehören: erstens, vielfältige Transformationsempfänger, einschließlich Protoplasten, Hyphen und Sporen; zweitens, die Fähigkeit, exogene Gene in das Genom zu integrieren, um stabile Transformanten zu bilden; und drittens, eine hohe Transformationseffizienz, die zu einer großen Anzahl von Transformanten führt.

Die AMT-Methode erfordert binäre Vektoren, die mühsam herzustellen sind. Bei der Optimierung des Transformationsprozesses müssen mehrere Faktoren berücksichtigt werden. Dies ist eine wesentliche Einschränkung der AMT-Methode.

Elektroporationstransformation

Die Elektroporation ist eine einfache, schnelle und effiziente Transformationsmethode für filamentöse Pilze. Bei der Elektroporation werden elektrische Ladungen in einem Kondensator gespeichert, um eine hohe Spannung aufzubauen, die Probe wird von der Impulsspannung getroffen, und die exogene Nukleinsäure kann sofort in die Zellen übertragen werden. Für die Transformation von Pilzen werden in der Regel Rechteckwellen oder exponentiell abklingende Wellen verwendet. Exponentielle Abklingimpulse werden einfach durch das Auf- und Entladen eines Kondensators erzeugt. Das elektrische Feld nimmt vom Spitzenwert aus exponentiell ab. Eine Rechteckwelle ist eine nicht-sinusförmige periodische Wellenform (die als unendliche Summierung von Sinuswellen dargestellt werden kann), bei der die Amplitude mit gleichbleibender Frequenz zwischen festen Mindest- und Höchstwerten wechselt. Für die verschiedenen Arten werden unterschiedliche Wellenformen der Elektroporation verwendet. Eine Zusammenfassung der Wellenformen, die bei der Elektroporation verschiedener Spezies verwendet werden, ist in Tabelle 4 zu finden.

Wenn eine Zelle einem elektrischen Feld ausgesetzt wird, wird die Struktur der Zytomembran durch eine zwischen der Zytomembran induzierte Spannung verändert. Nach einem elektrischen Schock können sich Mikroporen in der Zytomembran bilden. Die induzierte Zellwandpermeabilität ist innerhalb der Schwellenwerte von Spannung und Dauer reversibel, andernfalls führt sie zu einer irreversiblen Schädigung der Zellen. Daher scheinen die Mikroporen in der Zytomembran nach einem Elektroschock zwei Muster aufzuweisen, ein reversibles und ein irreversibles Muster. Die Lipid- und Proteinmoleküle in der Zytomembran können ihre ursprüngliche Struktur wiederherstellen, wenn eine geeignete Feldstärke angelegt wird, während der irreversible Stromschlag zu einer irreparablen oder extrem langsamen Erholung führt, die schließlich den Zelltod zur Folge hat. Exogene DNA kann durch Elektroporation in Bakterien, Pflanzenprotoplasten, tierische Zellen und filamentöse Pilze übertragen werden. Diese Methode wurde bereits bei mehreren Pilzen erfolgreich angewandt. Ozeki et al. entdeckten, dass Keimsporen für die Transformation durch Elektroporation besser geeignet sind. In den letzten Jahren hat sich die Elektroporation zu einer zuverlässigen Methode für die Gentransformation einiger gängiger Stämme entwickelt. Tabelle 5 gibt einen Überblick über die durch Elektroporation vermittelten Transformationsprotokolle für verschiedene Pilzarten.

Faktoren, die die Elektroporationstransformation beeinflussen

Elektroporationsparameter

1. Elektrische Feldstärke Die elektrische Feldstärke ist der wichtigste Faktor, der die Effizienz der Elektroporation beeinflusst. Wenn die angelegte elektrische Feldstärke eine Stärke von kV/cm und eine Impulsbreite von μs-ms erreicht, wird die Zytomembran verändert und viele Mikroporen werden an den Zellwänden erzeugt. Eine hohe Intensität des elektrischen Feldes ist mit einer hohen Aufnahmerate von exogenen Nukleinsäuren und einer geringeren Überlebensrate der Zellen verbunden. Die verschiedenen Zelltypen benötigen jedoch unterschiedliche elektrische Feldstärken, da sie sich in ihren Zytomembrankomponenten unterscheiden. Wenn die elektrische Feldstärke den erforderlichen Schwellenwert nicht überschreitet, bilden sich nur wenige Mikroporen. Im Gegensatz dazu führt eine zu hohe elektrische Feldstärke zu einer irreversiblen Schädigung der Zytomembran, was zum Zelltod führt.

2. Kapazität Während des Elektroporationsprozesses hängen die Variation der elektrischen Ladungen und die Intensität des elektrischen Feldes, das auf die Zellsuspension einwirkt, von der Kapazität und der Pulsdauer ab. Die Intensität und Dauer des Pulses werden auch durch die Kapazität beeinflusst, daher hat eine größere Kapazität bessere Transformationswirkungen.

3. Pulsdauer und Frequenz Die Dauer der Perforation auf der Zytomembran, die in direktem Zusammenhang mit der Effizienz der Elektroporationstransformation steht, wird durch Pulsdauer und Frequenz beeinflusst.

Elektroporationsumgebung und externe Faktoren

1. Pufferlösung Die Pufferlösung stellt eine wichtige Umgebung für die Elektroporation von Zellen dar, und der pH-Wert der Elektroschock-Pufferlösung ist von großer Bedeutung. Normalerweise wird ein Puffer mit einem pH-Wert von 7,0 verwendet. Bei einem pH-Wert von mehr als 7,0 werden die Zellen leicht durchstochen und abgetötet.

2. Temperatur Während des Elektroporationsprozesses wird eine große Menge an Wärme erzeugt, die an die Pufferlösung abgegeben wird. Daher wird für eine bessere Wirkung eine niedrigere Temperatur (0-4 °C) empfohlen. Darüber hinaus kann ein Eisbad der Mischung vor dem Elektroschock die Effizienz des Elektroschocks ebenfalls verbessern.

3. Konzentration der exogenen Nukleinsäure Insgesamt steigt die Effizienz der Elektroporation mit der Konzentration der exogenen Nukleinsäure. Kompakte Superhelix-DNA gelangt leichter durch die Zytomembran in die Zellen. In einer Studie aus dem Jahr 1995 wurde berichtet, dass mit 1 μg Plasmid-DNA 100 Transformanten für A. niger erzeugt werden können.

Bemerkungen zur Elektroporationsmethode

Die Elektroporationsmethode ist bei zahlreichen Zelltypen, einschließlich Prokaryonten und Eukaryonten, umfassend angewandt worden. Diese Technologie hat das Potenzial, die Methode der Wahl für die Transformation unerforschter Pilzarten zu werden. Im Vergleich zur PMT-Methode, bei der komplizierte Schritte erforderlich sind, ist die Elektroporation einfach und bequemer. Der Mechanismus der Elektroporation ist jedoch nach wie vor unklar. Die Perforationsrate der Zytomembran ist von vielen Parametern des elektrischen Feldes abhängig. Außerdem erfordert sie geeignete Pufferbedingungen, um optimal wirksam zu sein.

Biolistische Transformation

Die biologische Transformation wird auch als Partikelbeschuss bezeichnet. Ihr Prinzip besteht darin, dass fremde DNA an der Oberfläche von Wolfram- oder Goldpartikeln adsorbiert wird. Unter hohem Druck werden die Partikel in die Wirtszellen geschleudert. Der Partikelbeschuss kann sowohl eine stabile als auch eine vorübergehende Transformation bewirken.

Viele Faktoren beeinflussen die Effizienz des Beschusses in Form von komplexen Wechselwirkungen. Biologische Parameter (Zelltyp, Wachstumsbedingungen und Zelldichte) und instrumentelle Einstellungen (Partikeltyp und -größe, Vakuum- und Druckniveau, Zielentfernung) sind wichtige Variablen.

Partikelbeschuss ist die leistungsstärkste unter allen genetischen Transformationsmethoden. Sie unterliegt nicht den Beschränkungen der Zelltypen des Wirts oder der Spezies. Bei Pilzen ist der Partikelbeschuss ausreichend effizient für Organismen, die schwer zu kultivieren sind oder von denen Protoplasten schwer herzustellen sind. Der Partikelbeschuss ist einfach und bequem zu handhaben. Allerdings sind die Instrumente und Verbrauchsmaterialien für den Partikelbeschuss teuer. Er wird nur dann in Betracht gezogen, wenn andere Methoden nicht funktionieren. Gegenwärtig wird der Partikelbeschuss zur erfolgreichen Transformation von A. nidulans und T. reesei usw. eingesetzt.

Stoßwellenvermittelte Transformation (SWMT)

SWMT nutzt das Prinzip der Energieumwandlung und -übertragung, um eine vorübergehende Druckstörung und eine Verwindungskraft in den Zellen zu erzeugen, die zu einem vorübergehenden Kavitationseffekt führt. Diese Methode wurde in der medizinischen Behandlung wie der Orthopädie und der Zertrümmerung von Nierensteinen eingesetzt. SWMT verändert die Durchlässigkeit von Zellmembranen durch akustische Kavitation, was zur Aufnahme von exogener Nukleinsäure in die Zellen führt. Die Methode wurde erfolgreich für die Einführung von exogener Nukleinsäure in Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa und Salmonella typhimurium eingesetzt. Im Jahr 2013 berichteten Denis Magaña-Ortíz et al. erstmals über die Anwendung von SWMT bei Pilzen, darunter A. niger, Fusarium oxysporum und Phanerochaete chrysosporium . In diesem Artikel wurden drei Vorteile der SWMT-Methode hervorgehoben. Erstens ist diese Methode im Vergleich zu herkömmlichen Transformationsmethoden in der Lage, direkt auf Sporen, nicht aber auf Protoplasten einzuwirken. Zweitens waren die physikalischen Parameter leicht zu kontrollieren, lediglich die Anzahl der Sporen, die Energie und die Geschwindigkeit der Stoßwelle mussten genau gesteuert werden. Drittens war die Effizienz der Transformation ausgezeichnet. Die Ergebnisse von Denis Magaña-Ortíz et al. wiesen darauf hin, dass die SWMT-Methode im Vergleich zur Agrobacterium-Transformationsmethode die Transformationseffizienz von A. niger um das 5400-fache steigern konnte.

Aber auch bei dieser Transformationsmethode sind einige Einschränkungen zu beachten. Da bei der Stoßwellenbehandlung ein großer Teil der DNA geschädigt wird, war die Transformationseffizienz, bestimmt durch das Verhältnis von DNA zu Zellen, recht gering. Für die Anzahl der beteiligten Zellen war die Transformationseffizienz jedoch deutlich höher. Bei der Bewertung der Effizienz müssen zwei Aspekte berücksichtigt werden: die Menge der DNA und die Anzahl der Zellen. In dem von Magana-Ortiz et al. durchgeführten Experiment beispielsweise werden für die Protoplastentransformation und Elektroporation im Allgemeinen etwa 1-10 μg Plasmid-DNA verwendet. Es ist teuer und unpraktisch, eine so große Menge an Plasmid im Labor für die SWMT-Methode herzustellen. Außerdem sind Stoßwellenquellen und -instrumente teuer, da sie in erster Linie für medizinische Zwecke entwickelt wurden. Dies erweist sich als großes Hindernis für die Anwendung dieser Methode in einem mikrobiologischen Labor mit begrenzten Ressourcen.