Results and Discussion
Unsere neue AMHS-Methode wird durch die anatomisch-funktionelle Struktur des Bienenkreislaufs erleichtert. Der Kreislauf wird durch die pulsierende Kontraktion der dorsalen und ventralen Zwerchfelle angetrieben, die die Hämolymphe in das Herz pumpen. Anschließend transportiert die Aorta die Hämolymphe in den Kopf (Abb. 1F) und versorgt das Gehirn und die Antennen der Biene mit Hämolymphe.
Im Vergleich zum TCHS ermöglichte das AMHS die Entnahme von 80-100 μl steriler Hämolymphe in kürzerer Zeit und von einer geringeren Anzahl von Individuen, wodurch das Risiko einer Melanisierung minimiert wurde. Wir glauben, dass es bei der Hämolymphsammlung wichtig ist, die Zeit des Kontakts mit Luft zu minimieren. Das Melanisierungsrisiko wird durch eine kürzere Entnahmezeit und einen schnelleren Übergang zum Kühlungsschritt verringert. Neben der verkürzten Sammelzeit ist der geringere Einsatz von Insekten ein weiterer wesentlicher Vorteil des AMHS gegenüber dem TCHS. Bei der Apidae-Forschung sollte stets darauf geachtet werden, dass möglichst wenige Bienen geschädigt werden. Die Verwendung des AMHS zur Verringerung der Anzahl der Bienen, die für die Entnahme des erforderlichen Hämolymphvolumens benötigt werden, steht im Einklang mit den Leitprinzipien für eine ethischere Verwendung von Tieren in der Forschung.
Unsere derzeitigen Ergebnisse zeigten auch, dass eine größere Insektengröße mit einer einfacheren und schnelleren Hämolymphentnahme und mit einem größeren Volumen an gesammelter Hämolymphe verbunden war (Tabelle 1). Die Entnahme von Hämolymphe aus Apis mellifera carnica und Apis cerana Arbeiterinnen dauerte länger und erforderte mehr Insekten als die Entnahme von Hämolymphe aus Hummeln, da die erstgenannten Arten wesentlich kleiner sind und weniger Hämolymphe haben.
Hämolymphe wird am häufigsten mit Kapillaren unter Verwendung verschiedener Methoden gewonnen, beispielsweise durch Punktion des Herzens, des dorsalen oder ventralen Thoraxsinus oder der dorsalen Aorta. Jedes dieser Verfahren birgt das Risiko, dass der Ventriculus punktiert wird, was zu einer Kontamination der Probe mit Darminhalt führt. Eine solche Kontamination macht nicht nur die Probe unbrauchbar, sondern erfordert auch, dass die Kapillare vor der nächsten Verwendung durch eine neue ersetzt oder gereinigt und desinfiziert werden muss, wodurch sich die Gesamtdauer der Hämolymphsammlung verlängert. Die Sterilität der Hämolymphe kann auch durch das Durchstechen der Membran, die die Abdomensegmente verbindet, beeinträchtigt werden. Die Verwendung des AMHS beseitigt diese kapillarbedingten Probleme. Außerdem kann bei der Hämolymphsammlung durch Enthauptung die Hämolymphe mit Nektar verunreinigt werden, der aus dem Magen der Bienen austritt. Unser neuartiges AMHS führte zu Hämolympheproben von hoher biologischer Qualität. In jeder mit AMHS gewonnenen Hämolymphprobe waren die Hämozyten deutlich sichtbar (Abb. 1C). Die Analyse jedes Objektträgers zeigte, dass die mit AMHS gewonnenen Hämolymphproben rein und transparent waren und keine Verunreinigungen (z. B. Pollenkörner) enthielten.
Wir erwarteten, dass bei der Durchführung von AMHS die Desinfektion mit Ethanol und der begrenzte Kontakt zwischen dem Hämolymphtropfen und dem Bienenkörper die Sterilität der Proben gewährleisten würden. Diese Erwartung wurde durch mikrobiologische Untersuchungen bestätigt. Die Bebrütung der mit AMHS gewonnenen Hämolymphe auf MRS- und Sabouraud-Agar-Medien bestätigte die Sterilität der Hämolymphe. Auf keinem der 100 ausplattierten Hämolymphtropfen wurde ein Wachstum von Mikroorganismen beobachtet. Daher werden hier keine quantitativen Ergebnisse präsentiert. Nach Beendigung der Inkubationszeit beobachteten wir lediglich dunkelbraune Kreise aus melanisierter Hämolymphe um jeden Tropfen. Diese Melanisierung trat während der Inkubationszeit auf, nicht während der Probenahme (Abb. 1D und 1E). Wenn die gesammelte Hämolymphe nicht für mikrobiologische Tests verwendet werden soll, kann der Desinfektionsschritt weggelassen werden. Es ist möglich, dass Ethanol, das im Bereich der Antennen aufgetragen wird, die Enzym- oder Hormonaktivitäten beeinflussen kann.
Neben der Methodik können auch andere Faktoren die Effizienz der Hämolymphsammlung beeinflussen. In unseren früheren Studien haben wir festgestellt, dass die Menge der von einer Biene gesammelten Hämolymphe nicht nur von der Bienenkaste und dem Alter abhängt, sondern auch von ihrem Hydratationsgrad, der anhand des Volumens des vor der Hämolymphentnahme getrunkenen Nektars oder Zuckersirups gemessen wird. Ptaszyńska et al. berichten, dass die Entnahme der richtigen Hämolymphmenge bei älteren Bienen weniger effektiv ist. Außerdem kann die Effizienz der Probenahme von den Laborkenntnissen des Forschers abhängen. Diese Faktoren erschweren den Vergleich der quantitativen Merkmale verschiedener Hämolymphe-Protokolle bei Studien, die in unterschiedlichen Labors und mit unterschiedlichen Organismen durchgeführt wurden. In unseren früheren Untersuchungen haben wir die Hämolymphe von Tausenden von Bienen sowohl mit AMHS als auch mit anderen Methoden, einschließlich TCHS , entnommen. Unsere Labormitarbeiter verfügen über umfangreiche Erfahrungen mit der Entnahme von Hämolymphe von Bienen unterschiedlichen Alters und verschiedener Kasten. Diese Erfahrung half uns, die verschiedenen Probenahmeverfahren zu vergleichen, da unsere Ergebnisse nicht durch Fehler aufgrund unterschiedlicher Fähigkeiten des Laborpersonals beeinflusst wurden. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die AMHS eine effiziente, saubere und hochpräzise Methode ist (Tabelle 1), die weniger zeitaufwendig ist als die TCHS.
Für die Entnahme von Hämolymphe mit anderen Methoden als der AMHS sind in der Regel zusätzliche Geräte wie Mikrokapillarröhrchen erforderlich. Außerdem erfordert die Entnahme von Hämolymphe aus Mikrokapillarröhrchen entweder die Verwendung einer speziellen Pumpe oder das Zerkleinern der Röhrchen und Zentrifugieren mit Perlen. Ein weiterer Vorteil des AMHS ist die Möglichkeit, mit einer Pipettenwaage das Hämolymphvolumen einer einzelnen Biene zu messen. Dies ist besonders nützlich bei der biochemischen Analyse von Mikroproben, z. B. bei der Bestimmung von Enzymaktivitäten. Es sei darauf hingewiesen, dass bei der Anwendung anderer Methoden als AMHS das reine Hämolymphvolumen indirekt berechnet werden kann, und zwar auf der Grundlage des Volumens der Hämolymphverdünnung in einem Röhrchen vor der Probenahme und des gemessenen Volumens der Hämolymphverdünnung nach der Probenahme. Eine solche Methode kann jedoch zu zusätzlichen Fehlern führen; daher verwenden einige Forscher Hamilton-Spritzen. Die AMHS vermeidet die Kosten und den zusätzlichen Aufwand (z. B. Verstopfung der Spritze, Desinfektion usw.), die mit der Verwendung von Hamilton-Spritzen verbunden sind.
Die Methode von Mayack und Naug (Hämolymphe wird durch Spinnen von Bienen mit abgeschnittenen Fühlern gewonnen) ist der AMHS ähnlich. Ihre Methode erfordert jedoch eine Laborzentrifuge, und die Mundwerkzeuge der Bienen mussten zugeklebt werden, um eine mögliche Kontamination zu verhindern. Außerdem sezierten sie in ihrer Studie die Eingeweide der Bienen, um die Infektion mit Nosema ceranae zu beurteilen, bevor sie die Bienen schleuderten. Ohne diesen Schritt wären die Eingeweide eine wahrscheinliche Kontaminationsquelle. Bei ihrer Methode wurden die Bienen in Zentrifugenröhrchen gegeben und 30 Sekunden lang bei 16.000 RCF geschleudert, um die Hämolymphe zu gewinnen. Dieses Verfahren könnte zu einer Schichtung der Hämolymphbestandteile (z. B. Proteine und Hämozyten) führen und birgt ein erhöhtes Risiko einer mikrobiologischen Kontamination und einer Melanisierung der Hämolymphe (siehe Diskussion oben). Während es für die Analyse des Hämolymphzuckerspiegels bei den Honigbienen-Sammlern mit zuvor entferntem Darm (wie in ihrer Studie) ideal sein mag, ist es für mikrobiologische und genetische Studien oder Untersuchungen der Enzymaktivitäten nicht ganz geeignet. In diesem Zusammenhang ist unsere neue AMHS-Methode für den allgemeinen Gebrauch besser geeignet, da sie leicht und einfach ist und wahrscheinlich in einer Vielzahl von verschiedenen Arten von Studien angewendet werden kann.