Abstract

Hintergrund. Die frühzeitige Erkennung einer grampositiven Bakteriämie und eine rechtzeitige angemessene antimikrobielle Therapie sind erforderlich, um die Patientensterblichkeit zu senken. Ziel unserer Studie war es, die Leistung des Verigene-Assays für grampositive Blutkulturen (BC-GP) in zwei speziellen Gesundheitseinrichtungen zu bewerten und die potenziellen Auswirkungen von Blutkultur-Schnelltests für grampositive Bakteriämie im japanischen Gesundheitssystem zu bestimmen. Darüber hinaus umfasste die Studie simulierte Blutkulturen, die eine Bibliothek von gut charakterisierten Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA)- und Vancomycin-resistenten Enterokokken (VRE)-Isolaten aus verschiedenen geografischen Regionen Japans enthielten. Methoden. Es wurden insgesamt 347 BC-GP-Tests an klinischen und simulierten Blutkulturen durchgeführt. Die BC-GP-Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen von Referenzmethoden zur Identifizierung von Gattungen und Arten sowie zum Nachweis von Resistenzgenen mittels molekularer und MALDI-TOF MS-Methoden verglichen. Ergebnisse. Bei der Identifizierung und dem Nachweis von Resistenzgenen an zwei klinischen Standorten und simulierten Blutkulturen betrug die Gesamtübereinstimmung von BC-GP mit Referenzmethoden 327/347 (94 %). Die Zeit für die Identifizierung und den Nachweis antimikrobieller Resistenzen durch BC-GP war im Vergleich zu Routinetests deutlich kürzer, insbesondere in der kardiologischen Klinik, die an Wochenenden und Feiertagen keine klinischen Mikrobiologiedienste anbietet. Schlussfolgerung. BC-GP ermöglichte eine genaue Identifizierung und den Nachweis von Resistenzmarkern im Vergleich zu Routinelabormethoden für grampositive Organismen in spezialisierten klinischen Einrichtungen und lieferte schnellere Ergebnisse als die derzeitigen Routinetests.

1. Einleitung

Gramm-positive Bakterien sind die vorherrschenden Mikroorganismen, die mit Sepsis im Gesundheitswesen in Verbindung gebracht werden, und die häufigste Ursache für Bakteriämie bei Patienten mit hämatopoetischer Stammzelltransplantation. Enterokokken-Bakteriämie ist bei Patienten mit hämatopoetischer Stammzelltransplantation mit einem erhöhten Sterberisiko verbunden, unabhängig von der Empfindlichkeit gegenüber Vancomycin. In kardiologischen Abteilungen sind infektiöse Endokarditis, infektiöse Aneurysmen, katheterbedingte Blutstrominfektionen oder Infektionen an der Operationsstelle nach Herzoperationen die häufigsten Infektionen, bei denen Gram-positive Kokken die häufigsten Erreger sind. In beiden medizinischen Abteilungen ist die frühzeitige Erkennung von Gram-positiven und resistenten Markern von entscheidender Bedeutung für die Patientenversorgung, die Antibiotikaverwaltung und die Verhinderung der Ausbreitung resistenter Mikroorganismen.

Da ein frühzeitiges Eingreifen mit einer antimikrobiellen Therapie mit einer verbesserten Prognose einhergeht und jede Stunde Verzögerung mit einer erhöhten Sterblichkeit verbunden ist, ist eine schnelle Diagnose von entscheidender Bedeutung. Der Verigene Gram-positive Blood Culture Assay (BC-GP) (Nanosphere, Inc., Northbrook, IL) ist ein Probe-zu-Ergebnis-Microarray-System zur Identifizierung gängiger Gram-positiver Bakterien und wichtiger Resistenzmarker direkt aus einer positiven Blutkultur. Obwohl in einer Reihe von Studien die Leistung des BC-GP mit 92 bis 99 % Übereinstimmung mit der konventionellen Methodik bewertet wurde, besteht eine Einschränkung darin, dass viele der Studien aus den Vereinigten Staaten sowie aus Ländern außerhalb Japans stammen und nur ein einziger Bericht mit begrenztem Umfang in Japan veröffentlicht wurde.

Genetische Variationen zwischen bakteriellen Linien, die in verschiedenen geografischen Regionen der Welt zirkulieren, können die Empfindlichkeit molekularer Assays auf der Grundlage von Oligonukleotid-Sonden zum Nachweis von Organismen oder Resistenzmarkern beeinträchtigen. In Studien aus Hongkong und Belgien wurde über eine geringere Leistungsfähigkeit von BC-GP berichtet.

Ziel dieser Studie war es, die potenziellen Auswirkungen von BC-GP auf das Patientenmanagement und die Patientenergebnisse in spezialisierten Krankenhäusern im japanischen Gesundheitswesen zu ermitteln, das mit einer Reihe von Herausforderungen konfrontiert ist. Eine zunehmend alternde Bevölkerung und die damit einhergehende Belastung durch steigende Gesamtkosten im Gesundheitswesen haben die Infrastruktur des Gesundheitswesens vor Herausforderungen gestellt. Obwohl Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) für über 90 % der im Krankenhaus erworbenen Infektionen verantwortlich ist, die durch resistente Bakterien in Japan verursacht werden, ist die Auslagerung klinisch-mikrobiologischer Tests oder das Fehlen einer Wochenendabdeckung in vielen Gesundheitseinrichtungen als Teil der Kostendämpfung üblich. Die vorliegende Arbeit stellt die erste umfassende Evaluierung von BC-GP in Japan dar, um seine klinische Leistung zu validieren. Die simulierte Blutkulturstudie umfasst eine Bibliothek von gut charakterisierten, im Gesundheitswesen vorkommenden MRSA (HA-MRSA), in der Gemeinde erworbenen MRSA (CA-MRSA) und Vancomycin-resistenten Enterokokken (VRE), die in Japan im Umlauf sind.

2. Methoden

BC-GP wurde vom 26. Juni 2012 bis zum 6. März 2013 im Toranomon Hospital (TH) und im Sakakibara Heart Institute (SHI) in Übereinstimmung mit den vom institutionellen Prüfungsausschuss des jeweiligen Standorts genehmigten Studienprotokollen untersucht. Das TH ist ein allgemeines Lehrkrankenhaus mit 1168 Betten und einer hämatologischen Abteilung mit 123 Betten für hämatopoetische Stammzelltransplantationen, in der 140 bis 160 hämatopoetische Stammzelltransplantationen pro Jahr durchgeführt werden. Das mikrobiologische Labor des Krankenhauses ist täglich während der Tagesstunden in Betrieb. Das SHI ist ein 320-Betten-Lehrkrankenhaus, das auf Herz-Kreislauf-Erkrankungen spezialisiert ist und jährlich über 1 500 Operationen am offenen Herzen durchführt. Das mikrobiologische Labor des Krankenhauses wird von einem externen kommerziellen Referenzlabor betrieben. Das mikrobiologische Labor arbeitet werktags in der Tagesschicht und ist an Wochenenden und Feiertagen geschlossen.

Blutkulturen wurden im SHI mit BacT/ALERT FA-Flaschen durchgeführt und mit BacT/ALERT 3D (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankreich) überwacht. Die TH verwendete BACTEC Plus Flaschen und die Überwachung mit BACTEC 9240 und FX (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Pro Patient wurde nur eine positive Blutkulturflasche mit Gram-positiven Kokken oder Bazillen in die Studie aufgenommen. Zwei ml des positiven Blutkulturmediums wurden bei -85°C für erneute Tests gelagert.

Die routinemäßige mikrobiologische Identifizierung und Empfindlichkeitsprüfung der Isolate erfolgte mit Hilfe konventioneller Identifizierungstests wie Gallenlöslichkeit, Optochin-Scheibenempfindlichkeit und dem MicroScan WalkAway System (Beckman Coulter, Pasadena, CA) beim TH und dem Vitek 2 System (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankreich) beim SHI. Das Cefoxitin-Screening auf Methicillin-Resistenz wurde gemäß den CLSI-Richtlinien durchgeführt. Ein Latex-Agglutinationstest zum Nachweis des Penicillin-bindenden Proteins PBP2a wurde ebenfalls eingesetzt.

BC-GP-Tests wurden bei positiven Blutkulturen mit Gram-positiven Organismen gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt wurde eine gut gemischte 350-μl-Probe des Blutkulturmediums in die Probenvertiefung des BC-GP-Nukleinextraktionstabletts pipettiert, auf den Verigene Processor SP zur Verarbeitung und Analyse durch das Verigene-Lesegerät gelegt.

Eine Bewertung wurde durchgeführt, um den Zeitunterschied zwischen der Meldung von Ergebnissen unter Verwendung von BC-GP und kulturbasierten Identifizierungs- und Antibiotikaempfindlichkeitsergebnissen für 139 positive Blutkulturbrühen zu bestimmen. Bei kulturbasierten Ergebnissen war die Zeit, die bis zur Erstellung des endgültigen Berichts benötigt wurde, die Zeit zwischen dem Lesen der Gram-Färbung und der Eingabe der endgültigen Identifikations- und Empfindlichkeitsergebnisse in das Laborinformationssystem. Bei BC-GP war die Zeit bis zum Ergebnis die Zeit zwischen dem Ablesen der Gram-Färbung und der Eingabe der BC-GP-Ergebnisse in das Laborinformationssystem.

Zur Bewertung von BC-GP wurde ein Challenge-Set von 208 simulierten Blutkulturen unter Verwendung von Typen, Referenzstämmen und klinischen Stämmen aus verschiedenen geografischen Regionen in Japan erstellt. Zu den klinischen Stämmen gehörten Organismen, die in früheren klinischen Studien der TH und des SHI Herausforderungen für kommerzielle Identifizierungssysteme darstellten. Darüber hinaus wurde auch eine Bibliothek mit gut charakterisierten HA-MRSA-, CA-MRSA- und VRE-Stämmen aus Japan getestet. Simulierte Blutkulturstudien wurden im Miroku Medical Laboratory (Saku City, Präfektur Nagano, Japan) durchgeführt. Zweihundertundacht Stämme wurden in steriler Kochsalzlösung auf eine Trübung von etwa 100 KBE/ml eingestellt. Dreihundert μl wurden in BACTEC Plus Aerobic/F-Flaschen mit 8 bis 10 ml menschlichem Vollblut (Blutgruppe O, Tennessee Blood Services, Memphis, TN) beimpft, um ein Endinokulum von 30 KBE/Flasche zu erhalten. Für S. pneumoniae und die S. anginosus-Gruppe wurde ebenfalls eine BACTEC Plus Anaerobic/F-Flasche inokuliert. Jede Flasche wurde im BACTEC-System bebrütet, bis ein positives Signal erzeugt wurde. Wenn BC-GP negative Ergebnisse lieferte, wurde eine 11-fache Verdünnung des Blutkulturmediums mit sterilem destilliertem Wasser erneut getestet.

Jedes der positiven Blutkulturisolate an den beiden Krankenhausstandorten wurde in 10%iger Magermilch (Difco) bei -85°C gelagert. Die Identifizierung der Spezies wurde mittels matrixunterstützter Laserdesorptionsionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS) bestätigt (Microflex LT mit Biotyper ver. 3.0 Software; Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Deutschland) für alle Stämme bestätigt. Wurde der Organismus durch MALDI-TOF MS nicht bis zur Spezies identifiziert (Score-Wert < 2,0) oder als Micrococcus, Listeria, Staphylococcus außer S. aureus, Streptococcus außer S. pyogenes und S. agalactiae identifiziert, wurden an der Juntendo-Universität oder der Tokyo Women’s Medical University Bestätigungstests durch PCR-direkte Sequenzierung von 16S rDNA oder sodA durchgeführt. Spezifische PCR zum Nachweis von mecA bei allen Staphylokokken und vanA, vanB bei allen Enterokokken wurde durchgeführt. Die für die SCCmec-Typisierung von in der Gemeinschaft oder im Gesundheitswesen erworbenen MRSA verwendeten Methoden zur Charakterisierung der Stämme wurden bereits beschrieben.

Die Übereinstimmung wurde im Vergleich zu den Ergebnissen der Referenzmethoden ermittelt. Eine Übereinstimmung lag vor, wenn der BC-GP-Zielnachweis mit der Referenzmethode entweder auf Gattungs- oder auf Speziesebene übereinstimmte. Die fünfundneunzigprozentigen Konfidenzintervalle (95% CI) und der Paartest wurden mit GraphPad StatMate (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) ermittelt.

3. Ergebnisse

In dieser Studie betrug die Gesamtübereinstimmung zwischen BC-GP und der Referenzmethode 327/347 (94%) für prospektive Blutkulturen an zwei klinischen Standorten und simulierte Blutkulturen. Die kombinierte Übereinstimmung zwischen PCR und BC-GP für den mecA-Nachweis betrug 71/73 (97 %) für prospektive Blutkulturen und simulierte Blutkulturen.

Die kombinierte Identifizierungsgenauigkeit aus beiden Krankenhausstandorten betrug 129/139 (93 %). Bei monomikrobiellen Kulturen lag die Identifizierungsgenauigkeit bei 121/124 (98 %). Die Übereinstimmung zwischen PCR und BC-GP für mecA-Positivität betrug 51/53 (96 %). Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse von TH. Insgesamt wurden 96/104 (92 %) Organismen durch BC-GP korrekt auf Art- oder Gattungsebene identifiziert, einschließlich des Nachweises von Resistenzgenen. Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, betrug die Gesamtübereinstimmung von BC-GP mit der Referenzmethode im GKV 33/35 (94 %) Organismen.

BC-GP meldet das Vorhandensein von mecA nur für S. aureus und S. epidermidis. In dieser Studie waren von den 102 Staphylokokkenstämmen 72 entweder S. aureus oder S. epidermidis. Nicht übereinstimmende Ergebnisse waren auf nicht nachweisbare mecA-S. epidermidis-Organismen in polymikrobiellen Kulturen zurückzuführen, die sowohl mecA-positive als auch mecA-negative S. epidermidis enthielten. Von den 30 Staphylococcus spp. außer S. epidermidis und S. aureus waren 21 (70 %) mecA-positiv, darunter 2 S. lugdunensis, die von BC-GP nicht als mecA-positiv gemeldet werden konnten.

Tabelle 3 zeigt den Zeitunterschied zwischen der Generierung von BC-GP-Ergebnissen und der kulturbasierten endgültigen Identifizierung und den Ergebnissen der antimikrobiellen Empfindlichkeit in beiden Krankenhäusern. In der TH lagen die BC-GP-Ergebnisse im Durchschnitt 28,2 bis 51,0 Stunden vor den endgültigen kulturbasierten Identifizierungs- und Empfindlichkeitsergebnissen vor. In der GKV lagen die BC-GP-Ergebnisse im Durchschnitt 34,5 bis 196,6 Stunden früher vor. Beim Vergleich der Zeit bis zu den endgültigen kulturbasierten Identifizierungs- und Empfindlichkeitsergebnissen in der TH und der GKV benötigten die Ergebnisse für S. epidermidis und koagulasenegative Staphylokokken mit Ausnahme von S. epidermidis, Enterokokken und Streptokokken in der GKV signifikant () mehr Zeit (83,3, 123,6, 159,1 bzw. 199,1 Stunden) als in der TH (40,8, 53,9, 36,1 bzw. 53,5 Stunden).

Bei Verwendung simulierter grampositiver Blutkulturen identifizierte BC-GP 198/208 (95 %) der Organismen korrekt (Tabelle 4). Sechs Streptokokken (3 %) wurden von BC-GP entweder falsch oder nur auf Gattungsebene identifiziert. Von den 4 BC-GP-falsch-negativen Blutkulturflaschen wurde 1 S. pyogenes korrekt identifiziert und 1 S. mitis erzeugte nach 11-facher Verdünnung des Blutkulturmediums ein positives Streptococcus genus/S. pneumoniae-Signal. Das mecA-Gen wurde bei 20/20 (100 %) MRSA-Organismen nachgewiesen, die sowohl in der Gemeinschaft erworbene (SCCmec Typ IIa, IV und V) als auch im Gesundheitswesen vorkommende (SCCmec Typ I, IIb, III und nicht typisierbare) Stämme repräsentieren. BC-GP wies 14/14 (100 %) vanA- und 20/20 (100 %) vanB-Gene in gut charakterisierten VRE-Stämmen aus früheren Studien in Japan nach.

4. Diskussion

Die in unserer Studie beobachtete Leistung von BC-GP war ähnlich wie in früheren Berichten. Da die klinische Mikrobiologie in vielen japanischen Krankenhäusern werktags ausgelagert ist oder außerhalb der Schichten nicht arbeitet und an Wochenenden und Feiertagen geschlossen ist, haben diagnostische Schnelltests ein erhebliches Potenzial, die Patientenversorgung zu verbessern, indem sie die Zeit bis zur Identifizierung der Organismen und der Ergebnisse zur Empfindlichkeit gegenüber antimikrobiellen Mitteln drastisch verkürzen.

BC-GP weist mecA bei allen Staphylokokken auf der Grundlage der Messung der Signalintensität nach; die Berichterstattung ist jedoch auf S. aureus und S. epidermidis beschränkt, und zwar auf der Grundlage eines Algorithmus, bei dem mecA nur dann gemeldet wird, wenn S. aureus oder S. epidermidis mit BC-GP nachgewiesen wird. Künftige Versionen des BC-GP sollten eine Änderung des Algorithmus in Betracht ziehen, um die Meldung des mecA-Nachweises für andere Staphylokokken als S. aureus oder S. epidermidis zu ermöglichen, da 70 % der 30 Nicht-S.-aureus- und S.-epidermidis-Stämme in unserer Studie methicillinresistent waren. Obwohl S. epidermidis der wichtigste koagulase-negative Staphylokokken-Erreger ist, sind andere Staphylokokken wie S. lugdunensis und S. haemolyticus wichtige Krankheitserreger im Gesundheitswesen.

Polymikrobiell positive Blutkulturen verursachten den Großteil der Diskordanz. Im Gegensatz dazu betrug die Leistung von BC-GP 121/124 (98 %) bei monomikrobiellen klinischen Blutkulturen und 198/208 (95 %) bei simulierten Blutkulturen. In dieser Studie machten polymikrobielle Blutkulturen 14/106 (13 %) bzw. 3/33 (9 %) der positiven Blutkulturen bei TH und SH aus. Zusammengenommen machten polymikrobielle Kulturen 17/139 (12 %) der prospektiven klinischen Blutkulturen aus, was mit früheren Studien übereinstimmt, in denen 6 bis 20 % aller Infektionen der Blutbahn als polymikrobiell eingestuft wurden. BC-GP identifizierte alle Organismen in 12/17 (70 %) der polymikrobiellen Kulturen korrekt. In früheren BC-GP-Studien lagen die korrekten Identifizierungsraten bei polymikrobiellen Kulturen zwischen 57 und 86 %. Da irreführende Informationen die klinische Diagnose beeinflussen und zu einer unangemessenen Auswahl antimikrobieller Mittel führen können, ist es notwendig, die Grenzen von BC-GP zu verstehen.

Ein zusätzliches Problem bei polymikrobiellen Kulturen ist die klinische Interpretation des Nachweises von mecA und Staphylokokken. In unseren 17 polymikrobiellen Kulturen wurden in 5 Proben 2 oder 3 Staphylokokkenstämme mit oder ohne mecA nachgewiesen. Dies kann zu einem unnötigen Einsatz von Vancomycin oder einer Unterschätzung der durch methicillinresistente Staphylokokken verursachten Infektionen führen. Die Wiederholung von BC-GP bei einem anderen Satz von Blutkulturen kann das Risiko dieses Problems verringern. Bei monomikrobiellen Kulturen oder simulierten Kulturen wurden alle Diskrepanzen bei Streptokokken beobachtet, mit Ausnahme von 1 S. caprae-Stamm. Zu den BC-GP-Fehlidentifizierungen bei Streptokokken gehörten 2 S. mitis, die als S. pneumoniae identifiziert wurden, 2 S. pneumoniae, 2 S. anginosus und 2 S. pyogenes wurden nicht nachgewiesen. In früheren Berichten wurden ähnliche Ergebnisse auch für S. mitis, S. oralis und S. pneumoniae berichtet. Da die genetische Verwandtschaft zwischen S. mitis, S. oralis und S. pneumoniae aufgrund der >99%igen Homologie der 16S rRNA-Gensequenzen bekannt ist, sollten BC-GP-Ergebnisse für S. pneumoniae oder Streptococcus mit Alpha-Hämolyse ohne positive speziesspezifische Signale sorgfältig interpretiert und durch konventionelle Methoden wie Optochin-Empfindlichkeit oder den Gallenlöslichkeitstest bestätigt werden. Interessanterweise kann eine 11-fache Verdünnung des ursprünglichen Blutkulturmediums zum Nachweis des Streptokokkensignals und des Speziessignals führen (Tabelle 4). Es wurde über einen vom Organismus abhängigen Nachweisbereich durch BC-GP berichtet.

Der Hauptvorteil der Verwendung von BC-GP besteht darin, dass die Identifizierung und die Resistenzdeterminanten von positiven Blutkulturen früher gemeldet werden können, was eine frühere Auswahl einer geeigneten antimikrobiellen Therapie und die Durchführung von Infektionskontrollmaßnahmen wie Isolierung und Kontaktverhütung ermöglicht. Dies hat das Potenzial, das japanische Gesundheitssystem erheblich zu verändern. Der in Tabelle 3 dargestellte Zeitunterschied zwischen den BC-GP-Ergebnissen und den endgültigen kulturbasierten Identifizierungs- und Empfindlichkeitsergebnissen bei TH stimmt mit früheren Berichten überein. Andererseits spiegeln die früheren Ergebnisse von 80,7 bis 196,6 Stunden für andere Organismen als S. aureus unter Verwendung von BC-GP im SHI die Nichtverfügbarkeit der klinischen Mikrobiologie an Wochenenden und Feiertagen wider. Da die klinische Mikrobiologie in vielen Krankenhäusern in Japan ausgelagert oder auf eine Schicht an Wochentagen beschränkt ist bzw. an Wochenenden nicht angeboten wird, ist der potenzielle Kosten-Nutzen-Faktor der Beibehaltung von Blutkulturen in Krankenhäusern erheblich. Darüber hinaus wird die Schulung des Laborpersonals im allgemeinen Labor zur Erkennung grampositiver Kokken und Bazillen die Durchführung von BC-GP-Tests am Wochenende sowie abends und nachts ermöglichen. BC-GP bietet Krankenhäusern die Möglichkeit, einen sehr wichtigen Labordienst im Haus zu behalten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass BC-GP im Vergleich zu routinemäßigen kulturbasierten Labormethoden für grampositive Organismen, einschließlich der in Japan zirkulierenden CA-MRSA-, HA-MRSA- und VRE-Stämme, eine genaue Identifizierung und Erkennung von Resistenzmarkern ermöglicht. Die Minimierung der Zeit bis zur Optimierung der antimikrobiellen Therapie mithilfe von BC-GP kann zu geringeren Kosten und einer besseren Patientenversorgung beitragen. Im Jahr 2016 erhielt BC-GP in Japan die behördliche Zulassung als erster molekularer Multitarget-Test für positive Blutkulturen, der als In-vitro-Diagnostikum zur Unterstützung der Diagnose von bakteriellen Infektionen der Blutbahn zugelassen wurde. Weitere Studien werden erforderlich sein, um die Kosteneffizienz von BC-GP im Kontext des japanischen Gesundheitssystems zu validieren.

Ethische Genehmigung

Diese Studie wurde von den internen Prüfgremien der TH und des SHI genehmigt.

Konkurrierende Interessen

Alle Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Beiträge der Autoren

Ken Kikuchi hat die Studie konzipiert und durchgeführt und das Manuskript verfasst. Mari Matsuda, Shigekazu Iguchi, Tomonori Mizutani, Kaori Sansaka, Kenta Negishi, Kimie Shimada, Shigeyuki Notake, Hideji Yanagisawa und Reiko Yabusaki führten die Laborarbeiten durch. Keiichi Hiramatsu, Michiru Tega-Ishii, Jun Umemura, Hiroshi Takahashi, Hideki Araoka und Akiko Yoneyama überwachten die Datenerfassung und koordinierten und beteiligten sich an der Gestaltung der Studie.

Danksagungen

Diese Studie wurde zum Teil durch einen Zuschuss (S0991013) des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) für die Gründung strategischer Forschungsprojekte an privaten Universitäten unterstützt.