INTRODUCCIÓN

El yogur es un producto lácteo preparado por fermentación de la leche con Lactobacillus spp. Hoy en día, las propiedades terapéuticas, profilácticas y nutricionales del yogur son ampliamente aceptadas (Boor, 2001). Cuando se administran en una cantidad suficiente, los probióticos aportan beneficios para la salud del huésped y aumentan el equilibrio microbiano (Fuller, 1989; Guarner et al., 2005). Así pues, los probióticos son microorganismos vivos, no patógenos y amistosos que desempeñan funciones beneficiosas en el compartimento de la microflora del huésped (Schrezenmeir y de Vrese, 2001). Las bacterias del ácido láctico (BAL) son el grupo de microorganismos probióticos más importante, especialmente Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp. y Enterococcous sp. (Klein et al., 1998). Las cualidades dietéticas y terapéuticas de los productos lácteos están determinadas por los microorganismos probióticos (Boor, 2001).

El yogur es una fuente potencial de Lactobacillus spp. probióticos. El valor nutricional del producto lácteo se ve incrementado por los microorganismos probióticos y los metabolitos producidos como resultado de la fermentación. La ingesta regular de yogur reduce el exceso de grasa del hígado y mejora su secreción. También es necesario para quienes padecen enfermedades cardíacas, aterosclerosis, hipertensión e inflamación. El jugo gástrico que se segrega por la acción del yogur conduce a una alta capacidad digestiva. El efecto beneficioso de los microorganismos probióticos, especialmente el Lactobacillus sp., que existe en los productos lácteos, es una evidencia, además, muchos investigadores estudiaron los efectos de los microorganismos probióticos contra los organismos patógenos utilizando diferentes métodos (Mercenier et al., 2003).

Los lactobacilos son miembros de las bacterias del ácido láctico cuyo principal producto final de fermentación es el ácido láctico. Son bacterias de importancia comercial con una amplia variedad de aplicaciones tanto en la industria alimentaria como en la no alimentaria debido a su estatus de «Generalmente Reconocido como Seguro» (GRAS). Los lactobacilos se han estudiado ampliamente por su biología molecular con el fin de mejorar sus características beneficiosas específicas (Pouwels y Leer, 1993).

El modo de acción de los probióticos se basa en la capacidad de las bacterias probióticas para unirse a los patógenos en el tejido epitelial intestinal. La acción antipatogénica de los probióticos consiste en la producción de ácido láctico que disminuye el pH, interactúa con las toxinas producidas por los patógenos con la producción de peróxido de hidrógeno y la síntesis de bacteriocina (Corcionivoschi et al., 2010).

Un producto probiótico eficaz requiere una adecuada identificación y caracterización de la especie bacteriana utilizada. La selección de organismos probióticos que puedan ser útiles terapéutica y nutricionalmente se basaría en propiedades específicas (Fuller, 1989; Quewand y Vesterlund, 2004).

El objetivo de esta investigación era recoger yogur de varias regiones de Bangladesh e identificar los lactobacilos mediante PCR bacteriológica y específica de género y analizar sus propiedades probióticas tras la interferencia con el crecimiento de bacterias patógenas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Recogida de muestras y aislamiento de bacterias del ácido láctico (BL): Se recogieron dos tipos de muestras de yogur de diferentes supermercados de la ciudad de Chittagong y Bogra en Bangladesh que eran de sabor agrio (muestra M1, M2 y M3) y dulce (muestra S2). Las muestras se almacenaron inmediatamente después de su recogida en un frigorífico a baja temperatura (4°C) de forma aséptica para protegerlas de la contaminación y el deterioro. El Lactobacillus spp. se aisló de las muestras de yogur mediante diluciones adecuadas con solución salina al 0,9%. Se utilizó el caldo MRS (Man, Rogosa y Sharpe) y el medio de agar MRS (Man, Rogosa y Sharpe) para el crecimiento del organismo. El pH de los medios se ajustó a 6,5. Las placas se incubaron aeróbicamente a 37°C durante 48 h. Finalmente, se aisló la colonia única de Lactobacillus observando su morfología y algunas pruebas bioquímicas como la tinción de Gram, la prueba de la catalasa y la oxidasa. Las colonias bien aisladas se recogieron y se transfirieron al caldo MRS para el enriquecimiento de Lactobacillus a 37°C.

Identificación de las bacterias del ácido láctico (BL) mediante análisis bacteriológico: La identificación se realizó según los métodos descritos en el manual de bacteriología sistémica de Bergeys. Sin el uso de condiciones anaeróbicas, todas las cepas crecieron bien en agar MRS a 37°C durante 48 h para el crecimiento selectivo de los lactobacilos. A partir de las diluciones apropiadas, se recogió una colonia representativa y se identificó provisionalmente como lactobacilos tras la reacción de tinción de Gram, el aspecto de la colonia, la morfología celular, la prueba de la catalasa, la prueba de la oxidasa, la prueba del indol, la prueba del rojo de metilo, la prueba de voges-proskauer, la prueba de utilización del citrato y los patrones de fermentación de los hidratos de carbono, tal como se indica en el manual de Bergeys (Hensyl, 1994).

Extracción de ADN de los aislados: El ADN se extrajo de 4 muestras aisladas de yogur según el método clásico de descongelación por calor (Salehi et al., 2005). El cultivo bacteriano puro del slant de agar MRS se subcultivó en medio de caldo MRS, del que se tomaron 1,5 mL de cultivo de caldo en un tubo eppendorf y se centrifugó a 10.000 rpm durante 5 minutos. Después se descartó el sobrenadante y se recogió el pellet. Se añadieron unos 200 μL de agua desionizada en autoclave al pellet y se disolvió agitando con el dedo. El tapón del tubo eppendorf se perforó con una aguja estéril y luego se hirvió el tubo en un baño de agua a 100°C durante 10 minutos. Justo después de la ebullición, el tubo eppendorf se mantuvo en hielo durante 10 minutos y luego se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos. A continuación se recogieron 100-150 μL de sobrenadante que contenía ADN cromosómico bacteriano.

Amplificación PCR específica de género: Para determinar la afiliación a nivel de género de los 4 aislados, se llevó a cabo la PCR con el conjunto de cebadores específicos de género de Lactobacillus LbLMA1-rev (5′-CTCAA AACTAAACAAAGTTTC-3′) y R16-1 (5′-CTTGTACACCG CCCGTCA-3′) diseñados por Dubernet et al. (2002). El análisis de la PCR se realizó a partir de la región del espaciador intergénico del ARN ribosómico 16-23S, tal como se ha descrito anteriormente (Dubernet et al., 2002).

La mezcla de reacción (20 μL) contenía 1 μL (100 ng μL1) de cada cebador añadido con 10 μL de 10× PCR Master Mix, 6 μL de agua de PCR y 2 μL de plantilla. La condición de ejecución fue la desnaturalización inicial a 95°C durante 5 min, seguida de 30 ciclos consistentes en desnaturalización a 95°C durante 30 seg, recocido a 55°C durante 30 seg, extensión a 72°C durante 30 seg y un paso de extensión final de 7 min a 72°C. Los productos se almacenaron a 4°C hasta su análisis. Los productos amplificados se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1% en tampón TAE (acetato de Tris 40 mM, EDTA 1 mM, pH 8,2). Los geles se tiñeron con bromuro de etidio (5 μg mL1) y se visualizaron bajo transiluminador UV (Biometra GmBH, Alemania).

Análisis de las características probióticas: Las características probióticas se determinaron mediante el análisis de las siguientes pruebas.

Test de tolerancia al NaCl: Para la determinación de la tolerancia al NaCl, los lactobacilos aislados se cultivaron en caldo MRS que contenía nueve tubos de ensayo que se ajustaron con diferentes concentraciones de NaCl (1-9%). Después de la esterilización en autoclave durante 15 minutos en 15 Ibs de presión a 121°C, cada tubo de ensayo se inoculó con 10 μL de cultivo nocturno de Lactobacillus y se incubó anaeróbicamente a 37°C durante 24 h. Después de 24 h de incubación, el crecimiento bacteriano se midió utilizando un espectrofotómetro a 560 nm (Graciela y Maruia, 2001).

Test de tolerancia a la sal biliar: La tasa de crecimiento de los cultivos bacterianos se determinó en caldo MRS que contenía diferentes niveles (0,05, 0,1, 0,15, 0,3 y 0,5%) de sales biliares. Los cultivos recién preparados se inocularon (1%) en el medio y se incubaron a 37°C durante 24 horas en condiciones anaeróbicas. Luego se midió la densidad óptica de cada muestra utilizando un espectrofotómetro a 560 nm (Graciela y Maruia, 2001).

Determinación del pH óptimo para el crecimiento: Para la determinación del pH óptimo para el crecimiento, se inocularon 100 μL de cultivo fresco de Lactobacillus de un día para otro en tubos de ensayo que contenían caldo MRS con un pH variable que oscilaba entre 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 y 8,0. Para determinar el efecto del pH en el crecimiento se utilizó tampón de acetato (pH -4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5), tampón Tris-HCl (pH-7) y tampón de borato (pH-8). El caldo inoculado se incubó en condiciones anaeróbicas durante 24 horas a 37°C. Tras la incubación, se midió el crecimiento de las bacterias utilizando un espectrofotómetro a 560 nm frente al caldo de control no inoculado.

Cuantificación del ácido orgánico y determinación del valor del pH: Según Hoque et al. (2010), se realizó la cuantificación de los ácidos orgánicos producidos por los aislados y la determinación de sus valores de pH. El caldo MRS suplementado con 10% de leche desnatada se inoculó con 1% (v/v) o 100 μL de cultivo de una noche de los aislados y se incubó en condiciones anaeróbicas a 37°C durante 72 h. Las muestras fermentadas se recogieron en cada 24, 48 y 72 h y los líquidos de la leche coagulada se separaron por filtración. Después de la filtración, el pH del líquido separado se registró utilizando un medidor de pH de electrodo digital y la cuantificación del ácido orgánico se realizó a través de la titulación con 0,1 N NaOH utilizando fenoftalina como indicador de pH (Hoque et al., 2010).

Control de la interferencia con las bacterias patógenas: Las actividades antibacterianas de los Lactobacillus spp. aislados, contra algunas bacterias patógenas se determinaron mediante el método de superposición de agar modificado (Aween et al., 2012). En este estudio se utilizaron ocho patógenos humanos diferentes, Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli y Shigella sonnei como patógeno de prueba. La actividad antibacteriana se caracterizó además determinando si era bacteriostática o bactericida. La prueba se realizó mediante un hisopado de la zona de inhibición del crecimiento. El hisopo se extendió en una placa de agar nutritivo y se incubó aeróbicamente a 37°C durante 72 h. La presencia de crecimiento en la placa de agar nutritivo se interpretó como actividad inhibitoria, es decir, bacteriostática, mientras que la ausencia de crecimiento se interpretó como bactericida.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Identificación de las bacterias mediante pruebas bacteriológicas y bioquímicas: Los cuatro aislados se cultivaron en medio Man, Rogosa y Sharpe (MRS) a pH 6,5. Todos los aislados se produjeron de forma pequeña, irregular y redonda con color crema blanquecino brillante o pardo que eran morfológicamente similares a Lactobacillus spp.

Luego todos los aislados se examinaron bajo el microscopio de campo brillante para observar sus características microscópicas. Estos aislados resultaron ser bacterias grampositivas, con forma de varilla corta y mediana que no forman esporas (Fig. 1a-d), lo que indica que son miembros de Lactobacillus spp. (Thamaraj y Shah, 2003).

Además, se realizaron algunas pruebas bioquímicas como la prueba de la catalasa, la prueba de la oxidasa, la prueba del indol, la prueba del rojo de metilo (MR), la prueba de Voges Proskauer (VP), la prueba de la utilización del citrato y los patrones de fermentación de los carbohidratos, tal como se indica en el manual de bacteriología sistemática de Bergeys (Hensyl, 1994).

Los aislados resultaron negativos a la catalasa y la oxidasa y en las pruebas IMViC (indol, metil-rojo, voges proskauar, utilización de citrato) todos los aislados también resultaron negativos, por lo que podrían confirmar que los aislados eran Lactobacillus spp. (Dhanasekaran et al., 2010).

En este estudio, los cuatro aislados fueron capaces de fermentar 11 carbohidratos diferentes, es decir, glucosa, sacarosa, fructosa, lactosa, xilosa, ribosa, galactosa, maltosa, manitol, ramnosa y dextrosa, lo que indica que son capaces de crecer en una variedad de hábitats utilizando diferentes tipos de carbohidratos. Los resultados resumidos de todas las pruebas bacteriológicas y bioquímicas se presentan en la Tabla 1. Todos estos resultados son relevantes para los hallazgos de Chowdhury et al. (2012).

Identificación molecular a través de la PCR específica de género: En este estudio, se utilizó un cebador específico de género preparado mediante el análisis de las similitudes entre las secuencias de nucleótidos de la región espaciadora entre los genes del ARN ribosomal 16 y 23S de Lactobacillus (Dubernet et al., 2002). La especificidad de este cebador específico de género combinado con un cebador universal se probó contra 23 cepas de Lactobacillus de origen variado. Los productos de la PCR se pasaron por electroforesis en gel en agarosa al 1% y se visualizaron con transiluminador UV. Se encontró una banda nítida esperada de 200 pb de amplicón para cada muestra (M1, M2, M3 y S2) que corresponde a la región del espaciador intergénico del ARNr 16-23S de Lactobacillus spp. (Dubernet et al., 2002). Así pues, los 4 aislados se confirmaron a nivel de género como Lactobacillus spp. El control negativo sin plantilla no dio ninguna banda, lo que sugiere que los 4 productos de la PCR correspondían al ADN de la plantilla (Fig. 2).

Análisis de las características probióticas: Las bacterias probióticas producen una variedad de sustancias con propiedades antibacterianas que incluyen ácido orgánico, H2O2, bacteriocinas que afectan al metabolismo bacteriano o a la producción de toxinas (Rafter, 2003; Rolfe, 2000; Vandenbergh, 1993).

Para ello, deben ser capaces de resistir con las condiciones desfavorables en el intestino como el NaCl y la sal biliar.

Test de tolerancia al NaCl: El aislado Lactobacillus spp. de los yogures fue capaz de tolerar el 1-9% de NaCl. Para determinar la tolerancia al NaCl de los aislados, se midió la densidad óptica a 560 nm y se trazaron los datos. Los aislados M1, M2, M3 y S2 crecieron bien en una concentración de NaCl del 1%. El crecimiento máximo (DO) de los aislados M1, M2, M3 y S2 se encontró en 1,420, 2,143, 1,662 y 2,207, respectivamente, en el 1% de NaCl (Fig. 3). La alta tolerancia a la sal es una propiedad deseable para que el organismo se utilice como probiótico.

Se sabe que el NaCl es una sustancia inhibidora que puede inhibir el crecimiento de ciertos tipos de bacterias. En este estudio, los resultados mostraron que Lactobacillus spp., aislados de yogures fueron capaces de tolerar entre el 1 y el 9% de NaCl y se observó un crecimiento óptimo al 1-5% de NaCl (Hoque et al., 2010).

Test de tolerancia a la sal biliar: Lactobacillus spp. aislado, fue capaz de sobrevivir en 0,05, 0,1, 0,15 y 0,3% de ácido biliar. El Lactobacillus spp. aislado también fue capaz de multiplicarse en las concentraciones de ácido biliar mencionadas. Se midió la densidad óptica a 560 nm y se trazaron los datos. Todos los aislados crecen bien en una concentración de sal biliar del 0,05%. Los crecimientos máximos (DO) de los aislados M1, M2, M3 y S2 se encontraron en 1,741, 2,213, 1,758 y 2,125, respectivamente. La tasa de crecimiento disminuyó con el aumento del nivel de concentración de sales biliares (Fig. 4).

En este experimento se utilizó una concentración de bilis de entre el 0,05 y el 0,3% que puede encontrarse en el tracto intestinal humano y la concentración máxima de bilis que está presente en el hombre sano es del 0,3% (Graciela y Maruia, 2001). Se ha informado de que, antes de seleccionar una bacteria probiótica para el consumo humano, ésta debe ser tolerable a una concentración de bilis del 0,3% (Gilliland et al., 1984). Basándose en el resultado, se sugiere que estas cepas pueden ser potenciales para su uso como organismo probiótico porque todos los aislados fueron resistentes y capaces de crecer en una concentración de sal biliar del 0,3%.

Determinación del pH óptimo para el crecimiento: El Lactobacillus spp. aislado, procedente de los yogures fue capaz de crecer en rangos de pH de 4,0-8,0. Se midió la densidad óptica a 560 nm y se trazaron los datos. El crecimiento máximo (DO) de los aislados M1, M3 y S2 fue de 2,201, 2,0619 y 2,237, respectivamente, a pH 6,0, mientras que el crecimiento máximo de los aislados M2 fue de 2,259 a pH 6,5 (Fig. 5). Los aislados fueron capaces de crecer a pH entre 4,0 y 8,0 pero el crecimiento óptimo se observó a pH entre 5,0 y 6,5 cuando se cultivaron en caldo MRS a 37°C. De este estudio se puede concluir que la tasa de crecimiento de Lactobacillus spp, disminuye en cierta etapa cuando aumenta la concentración de pH (Chowdhury et al., 2012).

Cuantificación del ácido orgánico y determinación del valor del pH: Para la cuantificación del ácido orgánico, se utilizó el método de valoración.

Cuantificación del ácido orgánico = V×N×D

donde, V es el volumen de NaOH, N es la fuerza del NaOH y D es el factor de dilución. El resultado de la producción de ácido orgánico se presenta en la Tabla 2.

Este estudio indica que la producción de ácido orgánico aumentó con el tiempo de incubación, pero al mismo tiempo el pH del medio disminuyó con el aumento de la producción de ácido. A partir de los resultados (Tabla 2), se observó la mayor acidez (1,9%) y el menor pH (3,64) tras 72 horas de incubación a 37°C para el Lactobacillus probiótico aislado del yogur de Bogra. Otras bacterias probióticas aisladas de yogur de diferentes supermercados de Chittagong mostraron la mayor acidez (1,83, 2,11 y 2,11%) y el menor pH (3,9, 3,68 y 3,65), respectivamente, tras 72 horas de incubación.

Hay una variación menor en la producción de ácido orgánico por parte de los lactobacilos debido a sus diferencias regionales, lo que indica que estos aislados dependen ligeramente del clima y del entorno (Hoque et al., 2010).

Control de la interferencia con bacterias patógenas: Se sabe que los probióticos, incluidos Lactobacillus, Bifidobacterium y Streptococcus spp., son inhibidores del crecimiento de una amplia gama de patógenos intestinales en el ser humano. Además de los efectos favorables contra la enfermedad causada por un desequilibrio de la microflora intestinal, Dunne et al. (2001) y Wollowski et al. (2001) informan de varias observaciones experimentales de bacterias contra el desarrollo de tumores de colon.

En este estudio, se examinaron los 4 aislados seleccionados según su actividad antibacteriana contra diferentes bacterias patógenas como Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli y Shigella sonnei asociadas a enfermedades de origen alimentario. La comparación de su inhibición (en mm) contra 8 patógenos de prueba se muestra en la Tabla 3.

Los resultados experimentales mostraron que la mayor actividad inhibitoria del aislado M1 se demostró contra Bacillus cereus (51,20±1,22 mm) y la menor zona de inhibición fue (23,46±1,00 mm) contra Shigella sonnei después de 72 horas de incubación. El diámetro más alto de la zona de inhibición del aislado M2 se mostró contra E. coli (38,43±1,00 mm) y la zona más baja (20,10±1,00 mm) contra Bacillus megaterium después de 72 horas de incubación. Del mismo modo, el diámetro más alto de la zona de inhibición del aislado M3 se mostró contra P. aeruginosa (42,90±1,20 mm) y la zona más baja (17,83±1,10 mm) contra S. aureus. Por último, en el aislado S2 se observó la zona más alta contra E. coli (43,80±1,20 mm) y la más baja (21,63±1,10 mm) contra S. aureus tras 72 horas de incubación. Los resultados relacionados con Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae y Escherichia coli fueron relevantes para los hallazgos de Chowdhury et al. (2012).

En el presente estudio, los aislados M1, M2, M3 y S2 mostraron resultados satisfactorios en cuanto a la actividad bactericida y bacteriostática. El aislado M1 fue bactericida para Bacillus megaterium, Vibrio cholera, Shigella sonnei y bacteriostático para Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, P. aeruginosa, S. aureus y E. coli. El aislado M2 fue bactericida para Bacillus cereus, Shigella sonnei y bacteriostático para Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae y Escherichia coli. El aislado M3 fue bactericida para Shigella dysenteriae, Bacillus megaterium y Staphylococcus aureus y bacteriostático para Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Escherichia coli y Shigella sonnei y el aislado S2 fue bactericida para Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae y Shigella sonnei y bacteriostático para Bacillus megaterium y Escherichia coli.

CONCLUSIÓN

En este estudio se aislaron e identificaron Lactobacillus spp, fueron aislados e identificados a partir de yogures regionales selectivos. Para la identificación de las bacterias se realizaron varias pruebas bacteriológicas y bioquímicas. Además, se llevó a cabo una PCR utilizando los cebadores específicos del género (LbLMA-rev) y universales (cebador R16-1) correspondientes a la región del espaciador intergénico del ARNr 16-23S de Lactobacillus spp. para confirmar la identificación bacteriológica. Los Lactobacillus spp. aislados eran capaces de tolerar sustancias inhibidoras como el NaCl (1-9%) y la sal biliar (0,05-0,3%) y también eran capaces de sobrevivir en condiciones alcalinas (pH 8,0). Todos estos aislados (M1, M2, M3 y S2) fueron capaces de utilizar carbohidratos como glucosa, xilosa, sacarosa, fructosa, galactosa, lactosa, maltosa, ribosa, ramnosa, manitol y dextrosa. Además, el Lactobacillus spp. aislado, de los 4 aislamientos (M1, M2, M3 y S2) fue capaz de producir ácido orgánico en la leche. Esta investigación indica que existe una pequeña variación en la producción de ácido orgánico por Lactobacillus debido a su variación regional. La presencia de actividades antibacterianas de los 4 aislados (M1, M2, M3 y S2) contra ocho bacterias patógenas humanas comunes resultó satisfactoria y los aislados producen bacteriocina extracelularmente. Un probiótico debe ser capaz de inhibir los organismos patógenos y debe ser capaz de tolerar las duras condiciones del intestino humano, como la alta salinidad, el bajo pH y la alta concentración de sales biliares. Todos los Lactobacillus spp. aislados cumplían estos criterios y, por tanto, pueden considerarse como probióticos potenciales para la salud humana.