Modelo discreto

El crecimiento de una colonia microbiana que consume un nutriente que se difunde se representa utilizando el modelo basado en celosía introducido por Matsuura23, cuyos detalles se dan en la sección 3. Brevemente, consideramos una red rectangular con L x y L y en las direcciones x e y, respectivamente. El número de celdas ocupadas se denota ν con la correspondiente densidad de celdas ρ = ν/(L x L y ). Cada elemento de la red rectangular puede albergar como máximo una célula, pero puede contener cualquier número entero no negativo de partículas nutritivas, independientemente de que haya también una célula en ese sitio. En cada paso de tiempo, las células de levadura pueden absorber una partícula nutritiva situada en el mismo sitio y producir una única célula hija en un sitio adyacente en una dirección cardinal, mientras que las partículas nutritivas pueden dar s pasos, de nuevo en las direcciones cardinales. Como condición inicial, las células se siembran dentro de la red en un patrón prescrito, mientras que un número de partículas de nutrientes se colocan uniformemente al azar dentro del dominio para dar una concentración inicial media especificada c0. Los límites del dominio se tratan como paredes sólidas, replicando el comportamiento experimental dentro de una placa de Petri. Es importante destacar que los patrones producidos por este modelo son el resultado de la interacción entre las células y el nutriente únicamente, de modo que cualquier morfología no uniforme producida por el modelo puede atribuirse por completo a la DLG.

Morfologías características de la DLG

Matsushita &Fujikawa12 utilizó una colonia de células de B. subtilis para ilustrar tres fenómenos clave que surgen debido a la DLG: (I) el «cribado» de las ramas más cortas por las más largas; (II) la repulsión entre colonias vecinas; y (III) el crecimiento dirigido hacia una fuente de nutrientes (Fig. 2). Se ha demostrado previamente que estas características surgen debido a la DLG por sí sola, utilizando un modelo de crecimiento de la colonia basado en un entramado similar al utilizado aquí30. Primero confirmamos que el modelo discreto descrito anteriormente puede reproducir este comportamiento antes de utilizar este modelo para cuantificar los patrones producidos.

Resultados experimentales de Matsushita &Fujikawa12 (fila superior) con las correspondientes simulaciones del modelo (fila inferior). Se muestran (a) las ramas más grandes que filtran las ramas más pequeñas de los nutrientes (fenómeno I), (b) dos colonias sembradas juntas que parecen repelerse entre sí (fenómeno II), y (c) una sola colonia que crece hacia la fuente de nutrientes en el lado derecho de la placa de Petri (fenómeno III). Las simulaciones de (d) las ramas de cribado, (e) dos colonias muy próximas y (f) el crecimiento con el nutriente en el lado derecho se calculan utilizando el modelo basado en celosía. Las células semilla están marcadas con un punto rojo. Las simulaciones se han calculado en celosías de dimensiones L x = L y = 200 con parámetros s = 3 y c0 = 1, que dan como resultado un valor de Δ del mismo orden de magnitud que en los experimentos. Las figuras 2(a), 2(b) y 2(c) se han reimpreso de Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 168, Mitsugu Matsushita e Hiroshi Fujikawa, Diffusion-limited growth in bacterial colony formation, 498-506, 1990, con permiso de Elsevier.

La interacción entre las células y el nutriente puede cuantificarse a grandes rasgos comparando la tasa relativa de propagación de estas dos cantidades. El crecimiento de la colonia se mide calculando la tasa media de cambio del área de la colonia Δ m cuando se ve desde arriba, que tiene las mismas unidades que la difusividad. Esta cantidad se calcula fácilmente a partir de una imagen experimental o de datos simulados, como los producidos por el modelo discreto. La difusión del nutriente Δ n se toma como la difusividad de la glucosa, ya que ésta se utiliza comúnmente como fuente de nutrientes y hay poca diferencia entre la difusividad de diferentes nutrientes. Se sabe que la difusividad de la glucosa en el agua es aproximadamente \({D}_{0}=4,03 veces {10}^{-2})mm2 min-1, basándose en observaciones experimentales36. Para la glucosa en un gel de agar de baja densidad, la difusividad viene dada por

donde w es el porcentaje en peso del agar37. Suponiendo que w = 0,3%, la difusividad es de 4,01×10-2 mm2 min-2, que es el valor utilizado para el resto de este estudio. La difusividad cambia poco con la cantidad de agar, y por lo tanto w tiene un impacto insignificante en los resultados. A partir de estas cantidades, calculamos la relación

que proporciona una medida adimensional de las tasas relativas de difusión. En valores pequeños de Δ, el nutriente se difunde en una escala de tiempo más rápida que el crecimiento celular, lo que significa que cualquier variación local en la concentración de nutrientes se disipará sin influir en la morfología de la colonia. Un valor de Δ que sea 1 o mayor indica que el crecimiento celular se produce a un ritmo al menos tan grande como la difusión de nutrientes, y las variaciones locales en la concentración de nutrientes pueden tener un impacto en la morfología de la colonia. De las tres imágenes experimentales, sólo la imagen del crecimiento dirigido tiene suficiente información proporcionada tanto en la escala como en el tiempo requerido para calcular Δ. A partir de esta imagen encontramos que Δ ≈ 0,23. Al establecer s = 3 y c0 = 1 en el modelo se obtienen soluciones con valores de Δ entre 0,3 y 0,5, que son del mismo orden de magnitud que los resultados experimentales y, por tanto, proporcionan una comparación adecuada. Estos valores de los parámetros se utilizan para el resto de esta subsección. El comportamiento en cada uno de los tres casos se cuantifica además mediante índices espaciales, descritos a continuación, de forma similar al enfoque de Binder et al.38. Cada simulación utiliza un entramado con dimensiones L x = L y = 200, que es lo suficientemente grande como para producir características con suficiente resolución sin dejar de ser eficiente desde el punto de vista computacional.

Para examinar el cribado de ramas (fenómeno I), el nutriente se siembra uniformemente al azar en todo el dominio y se coloca una única celda en el centro del entramado. La simulación se ejecuta hasta que la densidad total de células alcanza 0,2, lo que se ilustra con la colonia representativa que se muestra en la Fig. 2. Esta colonia presenta grandes ramas que emanan del lugar de la célula central inicial, con ramas más cortas entre ellas que han sido protegidas de los nutrientes por las ramas más grandes, y muestra un crecimiento no uniforme significativo. Esto coincide con el comportamiento observado por Matsushita & Fujikawa12. La morfología puede cuantificarse contando primero los ángulos de cada célula medidos en sentido contrario a las agujas del reloj desde algún ángulo de referencia con el origen situado en el centro de la masa. Los recuentos se escalan por los valores esperados para las células distribuidas uniformemente al azar, y el índice angular de crecimiento no uniforme I θ se define como la desviación estándar de los recuentos escalados, de modo que los valores mayores de I θ indican mayores niveles de crecimiento no uniforme. La imagen experimental tiene un índice de 0,18, mientras que la simulación tiene un índice de 0,2, lo que indica que los dos están en estrecha concordancia.

Para el caso de las colonias que se repelen (fenómeno II), el nutriente se coloca de nuevo uniformemente al azar a través del dominio. Se colocan dos celdas semilla centradas verticalmente dentro del dominio, cada una a un octavo de la anchura del dominio en sentido horizontal, de modo que las celdas estén separadas por un cuarto de la anchura total del dominio. La simulación se calcula hasta que la densidad total de células alcanza 0,2. Una simulación típica se muestra en la Fig. 2, en la que se muestra la separación entre las dos colonias observadas por Matsushita & Fujikawa12. Las colonias que se repelen pueden cuantificarse contando el número total de células ν y el número de células ν c entre las dos células semilla al final de la simulación. El índice de repulsión se define entonces como I c = 1 – ν c /ν, que se aproxima a 0,5 cuando las dos colonias crecen uniformemente, es menor que 0,5 cuando se forma una brecha y es mayor que 0,5 cuando las colonias muestran una preferencia de crecimiento entre sí. Las ubicaciones de las células semilla de cada colonia en la imagen experimental se aproximan trazando líneas a lo largo de las ramas e identificando dónde se cruzan. La imagen experimental y la simulación tienen índices de 0,19 y 0,27, respectivamente, lo que sugiere que ambas producen patrones de crecimiento similares con una diferencia significativa entre las dos colonias.

El crecimiento dirigido (fenómeno III) se simula colocando inicialmente todos los nutrientes en la columna más a la derecha del dominio, con una sola célula colocada en el centro del dominio. A continuación, se calcula la simulación hasta que la densidad celular llega a 0,1. En la Fig. 2 se muestra una colonia típica, que se asemeja mucho al resultado experimental de Matsushita & Fujikawa12. Para medir el sesgo hacia un lado del dominio calculamos la proporción I b de células en el lado derecho del dominio en relación con el número total de células, de modo que I b ∈ . Los valores del índice I b cercanos a 0,5 indican poco sesgo, mientras que I b < 0,5 indica sesgo hacia el lado derecho e I b < 0,5 indica sesgo hacia la izquierda. La imagen experimental tiene un índice de 0,92, que coincide con el índice de simulación de 0,93. En ambos casos los índices indican un gran sesgo de crecimiento hacia la ubicación inicial del nutriente.

Como encontraron Ginovart et al.30, las buenas coincidencias cualitativas entre las imágenes experimentales y las simulaciones muestran que la DLG por sí sola puede producir el cribado, la repulsión y el crecimiento dirigido de las colonias de B. subtilis. Hemos reforzado aún más esta comparación mediante el uso de una comparación cuantitativa entre los experimentos y un modelo matemático. Así, esperamos que estos fenómenos estén presentes cuando la DLG influye en la morfología, mientras que la ausencia de estas características sugiere que otros mecanismos son responsables del patrón de crecimiento. El acuerdo entre el modelo discreto y el modelo propuesto por Ginovart et al. demuestra que el modelo discreto empleado aquí proporciona una representación satisfactoria de la DLG y, por lo tanto, puede utilizarse para cuantificar este comportamiento.

Inducción de la DLG

Habiendo demostrado que el modelo discreto es capaz de reproducir el comportamiento de la DLG, aquí cuantificamos la dependencia de estos fenómenos de los parámetros del modelo para predecir cuándo aparecerán los efectos de la DLG. Las colonias se simulan de nuevo en un entramado de dimensiones L x = L y = 200 utilizando las mismas tres condiciones iniciales y los mismos criterios de parada que en la subsección anterior. Las simulaciones se repiten 50 veces para cada par de pasos de nutrientes s = 1, 5, …, 37 y concentraciones iniciales c0 = 1, 2, …, 7. Para cada par de parámetros calculamos el índice medio correspondiente a lo largo de las 50 realizaciones.

Para examinar el cribado de ramas (fenómeno I), consideramos las colonias crecidas a partir de una sola célula en un campo de nutrientes uniforme, con los correspondientes valores de índice medio \({\bar{I}_{theta }\) a lo largo de las 50 realizaciones mostradas en la Fig. 3. Los valores más grandes de \bar{I}_{theta}} surgen cuando tanto s como c0 son pequeños, lo que se debe a dos factores. En primer lugar, debido a que la difusividad de los nutrientes, efectivamente s, es pequeña en relación con la tasa de crecimiento celular, las fluctuaciones en los niveles de nutrientes se desarrollan a través del dominio. En segundo lugar, la baja concentración inicial de nutrientes c0 significa que estas fluctuaciones crean regiones en las que el nivel de nutrientes es demasiado bajo para soportar el crecimiento celular. Cuando s o c0 son mayores, al menos una de estas condiciones no puede producirse y el valor de \ {\bar{I}_{\theta }\} se hace menor, lo que indica que la DLG ya no tiene una influencia significativa en la colonia. Así, estos resultados indican que los patrones no uniformes sólo pueden producirse cuando tanto la difusividad de los nutrientes, en relación con la tasa de crecimiento celular, como la concentración de nutrientes son pequeñas.

Medidas de los efectos de la DLG en colonias microbianas simuladas. Todas las simulaciones se calculan con el modelo basado en celosía utilizando un rango de pasos de nutrientes s y concentraciones iniciales de nutrientes c0. Se muestra (a) el índice medio \ {\bar{I}_{theta}} para el cribado de ramas (fenómeno I), (b) el índice medio \ {\bar{I}_{c}} para las colonias repelentes (fenómeno II), y (c) el índice medio \ {\bar{I}_{b}} para el crecimiento dirigido (fenómeno III).

Se observa un comportamiento similar para el caso de repulsión (fenómeno II), tal y como se desprende del índice medio \({\bar{I}_{c}} representado en la Fig. 3. Los mayores valores del índice se encuentran en valores pequeños de s y c0, lo que ocurre por las mismas razones que para \({\bar{I}_{theta }\).

El comportamiento para el crecimiento dirigido (fenómeno III) es diferente, como se ve en el índice medio \({\bar{I}_{b}) mostrado en la Fig. 3. A valores pequeños de s, el índice \({\bar{I}_{b}\) es grande y varía poco con c0. A medida que s aumenta, el índice ({\bar{I}_{b}} disminuye y muestra una mayor dependencia de c0, con valores mayores de \bar{I}_{b}} a valores más bajos de c0. El rango de valores de los parámetros en los que se puede observar el crecimiento dirigido es mucho mayor que para los otros dos fenómenos DLG. Por lo tanto, si el crecimiento dirigido no se produce, tampoco lo harán las otras dos características y, por lo tanto, el crecimiento dirigido proporciona una primera comprobación útil de la DLG que es sencilla de medir. Esta característica se utilizará para comprobar la existencia de DLG a lo largo del resto de este trabajo.

Modelo de continuidad

La aparición del fenómeno DLG depende tanto de la concentración de nutrientes como de las difusividades de las dos especies. Mientras que los índices miden la dependencia de estos fenómenos del número de pasos discretos de nutrientes s y de la concentración inicial de nutrientes c0, el valor de Δ sólo pudo calcularse a partir de los datos simulados en lugar de especificarse como entrada al modelo. Sin embargo, al considerar los datos experimentales, es natural caracterizar la dispersión relativa de las células y el nutriente utilizando Δ, ya que puede medirse fácilmente a partir de imágenes experimentales. Aquí introducimos un sistema determinista de ecuaciones de reacción-difusión que modela la densidad celular y la concentración de nutrientes y permite la especificación de las difusividades relativas de cada cantidad, lo que equivale a establecer Δ. Aunque este modelo no es adecuado para capturar las características finas observadas en la Fig. 2, es capaz de replicar el crecimiento dirigido hacia una fuente de nutrientes (fenómeno III), que se encontró que surgió en el mayor rango de parámetros. Por lo tanto, nos centramos en este aspecto de la DLG, que actúa como una señal fácilmente medible de que la DLG está ocurriendo.

Consideramos un dominio unidimensional, que es suficiente para ilustrar el comportamiento general del modelo29,32,39. Utilizando la posición adimensional x, el tiempo t, la densidad celular n(x,t) y la concentración de nutrientes g(x, t), descritas en la sección 3, las ecuaciones de gobierno se reducen a

El parámetro D = D m /D n es la relación entre la difusividad celular D m y la del nutriente D n . Esto es similar a la definición de Δ (2), utilizando la difusividad celular en lugar de la tasa de cambio medida en el área de la colonia. El primer término del lado derecho de ambas ecuaciones representa la contribución de la difusión, mientras que los segundos términos representan el consumo de nutriente y el crecimiento de nuevas células, respectivamente, siendo c la cantidad adimensional de nutriente consumido por nueva célula.

Como condiciones iniciales, las células se colocan en el centro del dominio con el nutriente sesgado hacia la derecha según

donde N puede interpretarse como una concentración adimensional de nutrientes. Para ilustrar el comportamiento general, las condiciones iniciales para N = 1 se muestran en la Fig. 4.

Resultados del modelo de reacción-difusión unidimensional. (a) La condición inicial para N = 1 muestra las células concentradas en el centro del dominio con el nutriente a la derecha. (b) Los valores máximos de I b hasta el tiempo t = 1, representados frente al logaritmo de base 10 de D y N, sugieren que la DLG sólo se produce en determinados valores de los parámetros. Se muestran dos ejemplos representativos marcados. (c) En el mayor valor de I b cuando D = 10-6 y N = 1, las células siguen siendo casi simétricas en torno a x = 0, mientras que la concentración de nutrientes se ha vuelto efectivamente uniforme. (d) Utilizando D = 10-0,5 y N = 105 se produce un sesgo significativo hacia el lado derecho, donde el nutriente estaba inicialmente concentrado.

Tomando como fijos los valores típicos de los parámetros dados en la sección 3, el valor de N sólo varía debido a la concentración física del nutriente. Considerando un medio que sólo contiene nutrientes, que representa una concentración máxima, encontramos que el valor de N no puede ser mayor que aproximadamente 105. Así, las soluciones se calculan para 1 ≤ N ≤ 105. Mientras que las observaciones experimentales típicas sugieren que 10-3 ≤ D ≤10-1, consideramos valores para 10-6 ≤ D ≤103 a fin de proporcionar un examen teórico de cómo cambia el comportamiento con D. Para diferentes valores de estos parámetros, calculamos el valor máximo de I b observado hasta el tiempo t = 1. Esto corresponde a aproximadamente 119 días de crecimiento, que, aunque es mayor que los tiempos experimentales típicos, asegura que el valor máximo de I b se observa durante la simulación. Los índices I b calculados se representan en la Fig. 4 utilizando una escala logarítmica en base 10 para ambos ejes. Para log(N) < 1, hay poco o ningún sesgo en el crecimiento de las células, medido por I b . Para valores mayores de N, la cantidad de sesgo observado depende del valor de D, con el máximo que se produce cerca de (D,N) = (1, 105). Este valor de D corresponde a difusividades de células y nutrientes de igual magnitud y alrededor de este valor es posible observar un sesgo en el crecimiento para valores de N tan pequeños como 101,5. En condiciones experimentales típicas, N tiene un orden de magnitud 2, lo que indica que es más probable que se observen efectos de DLG cuando D está cerca de la unidad.

El rango de comportamiento se ilustra aún más considerando las distribuciones de dos ejemplos contrastantes. En cada caso, se muestra la solución en el momento correspondiente al máximo sesgo de la célula. Para D = 10-6 y N = 1, mostrados en la Fig. 4, la concentración de nutrientes se ha vuelto efectivamente uniforme antes de que la densidad celular pueda desarrollar cualquier sesgo obvio hacia el lado derecho, donde el nutriente estaba inicialmente concentrado. Por el contrario, tomando D = 10-0,5 y N = 105, también representado en la Fig. 4, las células muestran una preferencia obvia hacia el lado derecho del dominio.

El análisis del modelo continuo sugiere que, si \(D\ll 1\), entonces el crecimiento dirigido, y por lo tanto cualquier efecto DLG, sólo ocurrirá en valores de N al menos tan grandes como 103. Dado que las estimaciones indican que N tiene un orden de magnitud 2, esto sugiere que la DLG sólo se observará cuando D se acerque a la unidad, como resulta evidente en la Fig. 4. Esto también puede ilustrarse utilizando parámetros físicos. Utilizando los valores de los parámetros dados en la sección 3, los microbios con difusividad \({D}_{m}=3\times {10}^{-2})mm2 min-1 colocados en un entorno con una concentración inicial máxima de nutrientes \({N}_{0}\mathrm{=3,8}\times {10}^{-3})g mm-2 corresponderían aproximadamente a los valores adimensionales D = 0,75 y N = 104. A partir de la Fig. 4, cabría esperar que esta especie creciera hacia una fuente de nutrientes y, por tanto, mostrara un comportamiento DLG. Si los mismos microbios se colocaran en un entorno con una concentración máxima de nutrientes \({N}_{0}\mathrm{=3,8}\times {10}^{-6}\)g mm-2, el valor de N bajaría a 10 y ya no se observaría un crecimiento sesgado. Los resultados de esta sección proporcionan, por tanto, un marco para identificar cuándo se espera que ocurra la DLG basándose únicamente en las estimaciones de D y N.

Comparaciones experimentales

Habiendo examinado las predicciones del modelo, ahora las utilizamos para identificar el mecanismo de crecimiento dominante en las colonias microbianas. Consideramos los tres ejemplos experimentales representativos mostrados en la Fig. 1: dos colonias de la bacteria B. subtilis y una colonia de S. cerevisiae. Como no conocemos el valor adecuado de la relación de difusión D, requerida por el modelo de reacción-difusión, el crecimiento se caracteriza en cambio por la difusión relativa Δ (2). Este parámetro representa la relación entre la tasa media de cambio del área de la colonia, vista desde arriba, y la difusividad de la glucosa y puede medirse a partir de las imágenes. Como el nutriente se distribuye uniformemente y sólo se cultiva una única colonia, se espera que cualquier DLG en estos ejemplos se manifieste como un crecimiento irregular con cribado de ramas (fenómeno I).

Los valores calculados de las tasas de crecimiento Δ m se dan en la Tabla 1, junto con las correspondientes tasas relativas Δ. Estos valores indican que las colonias de B. subtilis crecen dos órdenes de magnitud más rápido que la colonia de levadura y un orden de magnitud más lento que la difusividad de la glucosa. El uso de valores típicos para la concentración inicial de nutrientes sugiere que los experimentos corresponden a un valor de N que tiene un orden de magnitud 2. Hacer coincidir esta estimación y los valores de Δ con los resultados del modelo de la Fig. 4 indica que B. subtilis corresponde a un régimen en el que se producirá un crecimiento dirigido debido a la DLG. Como esta estimación se realizó midiendo la tasa de proliferación celular p dentro de una colonia de S. cerevisiae, que probablemente sea menor que el valor correspondiente para las bacterias, se espera que sea una subestimación de N y que un valor mayor de N aumente la probabilidad de observar DLG. Por el contrario, la colonia de S. cerevisiae tiene un Δ de orden de magnitud -3, lo que indica que el nutriente se difunde en una escala de tiempo mucho más rápida que la del crecimiento celular. En consecuencia, se espera que cualquier variación local en la concentración de nutrientes se disipe antes de influir en la morfología de la colonia. Esto indica que la morfología no está influenciada por la DLG. Así pues, a pesar del gran parecido entre las formas de las colonias de bacterias y de levaduras en entornos con pocos nutrientes, estas dos morfologías se deben a fenómenos diferentes. Las colonias bacterianas crecen en una escala de tiempo lo suficientemente rápida como para que la difusión de nutrientes pueda limitar el crecimiento, dando lugar a un patrón irregular. El crecimiento mucho más lento de las colonias de levadura significa que la DLG no puede producirse y, en su lugar, las morfologías no uniformes de las colonias que surgen en entornos con pocos nutrientes deben deberse únicamente al crecimiento pseudohifal.

Intentamos confirmar aún más estos resultados probando el crecimiento dirigido (fenómeno III) en colonias de S. cerevisiae, imitando el montaje utilizado por Matsushita &Fujikawa12 y en las simulaciones40. Se llenó una placa de Petri con dextrosa sintética de bajo amonio (SLAD) y se colocó el nutriente en el centro de la placa. Se sembraron células de levadura a diferentes distancias del centro y se fotografiaron tras 16 días de crecimiento. En la sección 3 se ofrecen más detalles del experimento. Se utilizaron tanto la glucosa como el sulfato de amonio como nutrientes limitados, y en la Fig. 5 se muestran imágenes representativas de cada uno de ellos. Las imágenes están orientadas de manera que el centro de la placa de Petri, donde se colocó el nutriente, está en el lado derecho. La difusividad del amonio en el agua es de aproximadamente 9,84×10-2 mm2 min-1 41. Como esto es del mismo orden de magnitud que la difusividad de la glucosa, se espera que cada fuente de nutrientes dé lugar a un valor similar de Δ. Ninguna de las colonias muestra un sesgo notable en el crecimiento en ninguna dirección, y ambas producen índices de sesgo I b casi exactamente iguales a 0,5. Las difusividades efectivas Δ m y las difusividades adimensionales Δ de cada ensayo se indican en la Tabla 2. En ambos casos Δ tiene un orden de magnitud -3, lo que indica que no debería observarse un crecimiento dirigido y coincide con los resultados de los experimentos anteriores.

Imágenes de los experimentos de crecimiento dirigido utilizando S. cerevisiae. Las imágenes están orientadas de manera que el nutriente correspondiente se encuentra en el lado derecho de la colonia, como indica el texto vertical. Las colonias se cultivaron en (a) SLAD-G con glucosa añadida a la derecha y (b) SLAD-N con sulfato de amonio añadido a la derecha. Las barras de escala representan 5 mm.

Una prueba más del modo de crecimiento la proporciona el comportamiento cerca del borde de las colonias. Hay claros signos de crecimiento no uniforme alrededor del límite de la colonia cultivada en SLAD-N pero no en la colonia cultivada en SLAD-G. Si este patrón se debiera a la DLG, esperaríamos un comportamiento similar en ambos medios. Sin embargo, se sabe que las levaduras diploides, como la cepa AWRI796 utilizada en este experimento, cambian a un crecimiento pseudohifal cuando se les priva de nitrógeno2, como el SLAD-N. Esto sugiere que el crecimiento no uniforme observado en las colonias de levadura, como se muestra en la Fig. 1, se debe al crecimiento pseudohifal y no a la DLG.