Abstract

La infección del tracto urinario (ITU) es un problema mundial. La mayoría de las investigaciones sobre ITU se centran en la etiología de los gramnegativos. Se descubrió que las enterobacterias son la infección más prevalente de las ITU, constituyendo más del 80% de todos los casos notificados. Las principales bacterias grampositivas en los casos de ITU son Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis y Streptococcus agalactiae. Los patógenos grampositivos se notificaron en múltiples países tanto en las ITU no complicadas como en las complicadas. La terapia antibiótica de las bacterias grampositivas es completamente diferente a la de los patógenos gramnegativos de la ITU. Sin embargo, los síntomas asociados a la ITU causada por grampositivos y gramnegativos son muy similares. Si no se realiza un diagnóstico adecuado, existe una gran posibilidad de obtener un diagnóstico erróneo y la consiguiente terapia antibiótica. Los estudios disponibles sobre la etiología y la sensibilidad a los antibióticos son muy limitados en Bangladesh. Nuestro objetivo es buscar en esta área de investigación la forma de llenar el vacío. Este estudio ha detectado un 8,2% de bacterias grampositivas en pacientes con ITU. La prevalencia muestra la armonía con los informes publicados anteriormente. Se observó que los hombres y las mujeres estaban igualmente infectados por patógenos de ITU grampositivos. La mayoría de las publicaciones anteriores muestran que las mujeres son más vulnerables a las bacterias gramnegativas de las ITU. Nuestros hallazgos no parecen indicar que los hombres sean igualmente vulnerables a las bacterias grampositivas en comparación con las mujeres. Otros estudios con más tamaños de muestra pueden justificar los resultados preliminares. Los análisis de antibiogramas mostraron que la amikacina y la gentamicina son los antibióticos más eficaces contra nuestros aislados probados. Por el contrario, la nitrofurantoína resultó ser el fármaco más ineficaz en este estudio. Los hallazgos del estudio podrían ayudar a prescribir antibióticos a partir de este estudio basado en la evidencia.

Palabras clave

uropatógeno, ITU, resistencia antimicrobiana, tratamiento empírico, Bangladesh

Abreviaturas

API: Índice de perfil analítico; CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute; CLED: Agar con deficiencia de cisteína, lactosa y electrolitos; MDR: Multi Drug Resistant; MHA: Muller Hinton Agar; PBS: Phosphate Buffered Saline; UTI: Urinary Tract Infection

Introducción

La infección del tracto urinario (UTI) es una de las enfermedades infecciosas más comunes. Los principales agentes causantes de las ITU son Escherichia coli y otras Enterobacteriaceae. Las proporciones restantes se asocian a una variedad de organismos, como las bacterias Gram-positivas Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B, GBS) y otros organismos aislados con menor frecuencia . Las bacterias uropatógenas grampositivas más frecuentes son Staphylococcus saprophyticus y Enterococcus facecalis. Los uropatógenos grampositivos fueron notificados en múltiples países tanto en ITU no complicada como complicada . No se han realizado estudios exclusivos en la población de Bangladesh para buscar la etiología de la ITU por grampositivos. Sin un diagnóstico adecuado, existe una gran posibilidad de recibir una medicación errónea e inapropiada y los consiguientes efectos secundarios adversos del tratamiento asociado. Las bacterias grampositivas se encuentran con más frecuencia como agentes etiológicos de la ITU entre las mujeres embarazadas y los ancianos. Además, las ITU complicadas suelen producirse en entornos nosocomiales y/o institucionales y estas personas corren un mayor riesgo de padecer una ITU grampositiva y polimicrobiana . Representa una gran proporción del consumo de antibióticos, tiene un gran impacto socioeconómico y puede contribuir a la resistencia bacteriana. Los médicos se enfrentan a menudo a problemas a la hora de elegir el antibiótico adecuado para el tratamiento empírico de las ITU. En Bangladesh, el uso indiscriminado de antibióticos conlleva muchos resultados adversos para los pacientes con ITU desde el punto de vista clínico, con una amplia carga económica. Este estudio tenía como objetivo evaluar el perfil de susceptibilidad de los uropatógenos grampositivos frente a diferentes antibióticos prescritos. Nuestro estudio había racionalizado la necesidad de un seguimiento continuo de los pacientes infectados por el tracto urinario para una mejor comprensión de su epidemiología actual por cepas bacterianas gram-positivas en la población de Bangladesh.

Métodos y materiales

Recogida de datos

Se registraron mediante un cuestionario estructurado la información sociodemográfica de los pacientes, los antecedentes de tratamiento (si los pacientes fueron tratados con una terapia antimicrobiana) y cualquier información clínica relevante (cálculos renales, embarazo, uso reciente de catéter).

Diseño del estudio y recogida de muestras

Se realizó un estudio transversal entre julio de 2018 y diciembre de 2018 para buscar aislados bacterianos grampositivos de pacientes que tuvieran infección del tracto urinario. Este estudio se diseñó sobre la base de las investigaciones de laboratorio de las muestras de orina recogidas de los pacientes con ITU que asisten a diferentes hospitales comunitarios en el área de Savar. Para la planificación, se pidió a los probables pacientes de ITU que acudieron al Hospital Gonosastha y al Colegio Médico Enam de Savar, Dhaka, que participaran en este estudio. El estudio incluyó a los pacientes con consentimiento que tenían evidencia clínica de ITU con síntomas de menos de siete días que se presentaban en el departamento de consultas externas de los hospitales y a los que habían sido ingresados durante menos de 48 horas.

Aislamiento e identificación bacteriana

Para aislar el patógeno de la ITU, se recogieron muestras de orina de flujo medio limpias en tubos de vidrio estériles y se inocularon en un medio de cultivo diferencial, agar con cisteína, lactosa y deficiencia de electrolitos (CLED) (Lyophilchem, Italia). A los pacientes se les explicó de antemano el procedimiento estándar de toma de muestras a medio camino para evitar la contaminación con bacterias comensales. Para evitar resultados falsos positivos, las muestras de orina se sembraron dentro de las 2 horas siguientes a la recogida. El uso del agar CLED ofrece la ventaja de soportar el crecimiento de la mayoría de los uropatógenos potenciales, incluidos los cocos grampositivos, como Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus y Enterococcus spp. Paralelamente, se inoculó el agar salino de manitol (MSA) para centrarse en el crecimiento de las ITU grampositivas. Los cultivos de orina se incubaron durante la noche a 35ºC-37ºC en aire ambiente. Se realizaron cultivos de orina cuantitativos y se consideraron recuentos de colonias de 102 ó 103 UFC/mL para definir una probable infección de ITU en los respectivos pacientes. Los recuentos de colonias inferiores a 102 UFC/mL se consideraron una posible contaminación. Las colonias bacterianas purificadas se identificaron mediante tinción de Gram, procedimientos bioquímicos convencionales y un kit de pruebas bioquímicas rápidas (API 20E, BioMe’rieux, Durham, NC) que consistía en un conjunto de paneles cromogénicos, baterías de carbohidratos y sustratos enzimáticos. La identificación bacteriana se validó además mediante el genotipado utilizando el ARNr 16S de los aislados en parte.

Evaluación de la sensibilidad antimicrobiana

Los aislados se sometieron a una prueba de sensibilidad a los antibióticos in vitro mediante el método estándar de difusión de discos de Kirby-Bauer y la zona de inhibición se interpretó siguiendo las recomendaciones del CLSI (Clinical amp; Laboratory Standards Institute-2010). Se colocaron seis discos de antibióticos betalactámicos, nitrofurantoína y fluoroquinolona sobre el césped bacteriano y se incubaron a 37ºC para determinar el patrón de sensibilidad. Las bacterias sensibles dieron una zona clara alrededor del disco de antibiótico y se midió el diámetro de la zona para compararlo con el estándar.

Detección de genes resistentes a la β-lactamasa y a la quinolona

Los aislados que mostraban fenotipo resistente se sometieron a PCR para la detección del gen blaTEM y qnrS. Se prepararon un total de seis lisados bacterianos. La PCR se llevó a cabo en un tubo de PCR que contenía lisado bacteriano como plantilla de ADN (1 µl) con un volumen final de 12 µl que contenía premezcla de ADN 2x (6 µl), 5 pmol de cada cebador (1 µl) y agua desionizada (4 µl). La PCR se llevó a cabo en un termociclador y las condiciones de los ciclos para bla TEM y qnrS fueron: desnaturalización inicial a 94°C durante 5 minutos, seguida de 32 ciclos de amplificación con desnaturalización a 94°C durante 30 s, recocido a 50°C durante 30 s (blaTEM) y 55°C durante 30 s (qnrS) y extensión a 72°C durante 1min, terminando con una extensión final a 72°C durante 7 min. Los productos de la PCR del tamaño esperado se purificaron y secuenciaron utilizando los mismos cebadores utilizados para generar los productos de la PCR.

Análisis estadísticos

Como se ha descrito, para la recogida de datos se utilizó la versión validada del cuestionario en bangla. Los formularios de recogida de datos cumplimentados fueron revisados de nuevo por los supervisores de la recogida de datos. El 10% de los análisis de laboratorio seleccionados al azar fueron realizados dos veces por diferentes investigadores para garantizar la autenticidad de los datos de laboratorio y evaluar los sesgos entre investigadores. Los datos verificados se introdujeron y posteriormente se analizaron mediante el editor de datos estadísticos IBM SPSS (versión 21). Los datos que faltaban se excluyeron del análisis bivariante. Las estadísticas descriptivas se presentaron como frecuencia, porcentaje y media, cuando procedía, junto con la desviación estándar. La susceptibilidad antimicrobiana de las bacterias de la prueba se evaluó mediante una escala de clasificación categórica de tres tipos: susceptible (antibiótico indicado como totalmente eficaz), intermedio (indicado como parcialmente eficaz) y resistente (indicado como no eficaz). Para comprobar la asociación entre datos categóricos, se utilizó la prueba de chi-cuadrado de Pearson, y se aplicó la corrección de continuidad de Yate cuando procedía. Así se calculó la exposición de los antimicrobianos a la adquisición del gen resistente a los antibióticos. Se calculó el coeficiente de correlación para comprobar la fuerza de la asociación. Se realizaron pruebas t de muestras independientes cuando se compararon las medias de las variables continuas. Un valor p de dos colas inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Resultados

Demografía de la población de estudio

Nos acercamos a los pacientes que acudieron a los médicos del Gonosatha Medical College con sus complicaciones asociadas a la IU. Incluimos en este estudio a 147 pacientes que presentaban síntomas clínicos graves. De ellos, 36 (24,5%) eran hombres y los 111 restantes (75,5%) eran mujeres. Por lo tanto, casi el triple de los pacientes con ITU eran mujeres en comparación con el sexo opuesto (Figura 1). La prueba de Chi-cuadrado mostró que el sexo femenino se asociaba a un número significativamente mayor de ITU (p = 0,04). La distribución por edades de los casos de nuestro estudio va desde menos de un año hasta más de 70 años. Sin embargo, la infección por ITU más frecuente se produjo en el grupo de edad entre 21 y 30 años. En la tabla 1 se describe la distribución general de los casos por edades. Un total de cinco de los 12 Staphylococcus spp (42%) se identificaron en el grupo de edad de 21 a 30 años. No se observó ninguna otra tendencia en la distribución por edades de la infección por grampositivos en la ITU.

Figura 1. Distribución de bacterias grampositivas y gramnegativas entre hombres y mujeres. Las mujeres presentaron un número significativamente mayor de ITU que los hombres, causadas por bacterias gramnegativas. En el caso de la infección urinaria por bacterias grampositivas, los hombres y las mujeres mostraron igual vulnerabilidad

Tabla 1. Edad-distribución de los pacientes del estudio de ITU

Aislamiento e identificación de patógenos gram-positive UTI pathogens

Examinamos 147 muestras de orina de pacientes clínicamente sintomáticos. El medio de cultivo CLED produjo colonias de diferente color para diferentes patógenos de ITU. El Staphylococcus aureus grampositivo produce colonias amarillas y el Staphylococcus saprophyticus genera colonias de color blanco a amarillento, y el Enterococcus spp produce allí colonias incoloras a amarillas. Las bacterias gramnegativas producen otros colores diferentes. Por lo tanto, la identificación de las bacterias de la ITU mediante la observación de los colores de las colonias en el CLED puede ser presuntiva, pero es difícil de concluir. Subcultivamos las probables colonias Gram-positivas del medio de cultivo CLED en Agar Salino Manitol (MSA) y las incubamos durante la noche a 37°C. Las colonias de crecimiento en MSA se mostraron de color blanco-amarillento y rosa. Las bacterias procedentes del MSA se sometieron a la tinción de Gram y se comprobó que eran grampositivas. Las bacterias grampositivas preliminares que se han identificado en este estudio son de la especie Staphylococcus. El análisis del índice de perfil analítico (API) y/o la secuenciación del ADN 16sRNA pueden realizarse para identificar la etiología a nivel de especie. Hemos detectado 12 patógenos de ITU grampositivos, lo que supone el 8,2% de la población total de patógenos.

Patrón de resistencia antimicrobiana de los aislados grampositivos de ITU

El experimento de difusión en disco produjo zonas claras de césped bacteriano en agar Muller-Hinton (MH), lo que indica la susceptibilidad de los respectivos antibióticos impregnados en él. Por el contrario, los aislados resistentes no permitieron una zona clara ni siquiera en presencia del disco de antibiótico. En nuestra evaluación se observó una tendencia mixta de la susceptibilidad frente a los antibióticos probados. La mayor resistencia se encontró contra la nitrofurantoína (91,7%), seguida de la amoxicilina (83%) y la ofloxacilina (50%). Tanto la gentamicina como la amikacina resultaron ser fármacos muy eficaces, en los que sólo se encontró un 8,3% de resistencia (Figura 2).

Figura 2. Prevalencia de la resistencia a los antibióticos entre las bacterias grampositivas de la ITU.
AMC: Amoxicilina; LOM: Lomefloxacina; OFX: Ofloxacina; CN: Gentamicina; AK: Amikacina; F: Nitrofurantoína. La amikacina y la gentamicina resultaron ser los antibióticos más eficaces contra las bacterias Gram-positivas de las ITU. La nitrofurantoína resultó ser el menos eficaz de los antibióticos probados.

Genes resistentes a los antibióticos en uropatógenos grampositivos

Preparamos muestras de ADN de los 12 aislados grampositivos mediante el método de ebullición por calor. Las paredes celulares de las bacterias grampositivas suelen ser mucho más rígidas que las bacterias gramnegativas, lo que puede afectar a la liberación de ADN en los métodos de ebullición por calor. En el presente análisis, examinamos el anillo betalactámico que contiene el gen resistente a los antibióticos bla-TEM y encontramos dos aislamientos (2/6, 33%) positivos. Del mismo modo, comprobamos el gen resistente a los antibióticos del grupo de las fluoroquinolonas qnr-S y encontramos tres aislados positivos (3/6, 50%).

Discusión

Las infecciones del tracto urinario representan una de las enfermedades más comunes encontradas en la práctica médica, causando una importante morbilidad asociada y ocurriendo desde neonatos hasta ancianos . La prevalencia de las infecciones puede diferir con la edad, el sexo y ciertos factores predisponentes. La mayoría de las infecciones urinarias notificadas fueron causadas por bacterias gramnegativas, principalmente Enterobacteriaceae. También hubo fuertes evidencias contra la infección de ITU por bacterias grampositivas. Se buscó examinar la prevalencia de los patógenos grampositivos de la ITU en la población de Bangladesh. Los tratamientos empíricos para la infección urinaria basados en criterios de gravedad y síntomas clínicos suponen un gran reto . Como la terapia antibiótica de las bacterias grampositivas es completamente diferente a la de los patógenos gramnegativos de la ITU, existe una gran posibilidad de obtener un tratamiento equivocado mediante un enfoque empírico. Por lo tanto, el diagnóstico correcto con pruebas específicas de susceptibilidad a los antibióticos es imperativo para establecer cualquier administración de tratamiento. Como la ITU es una enfermedad común adquirida en la comunidad en Bangladesh, un porcentaje significativo de la población se infecta con esta enfermedad cada año. El estudio se diseñó para comprobar las susceptibilidades antimicrobianas de los patógenos grampositivos de las ITU. Detectamos alrededor de un 8,2% de etiologías de ITU grampositivas, en particular, Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus y Enterococcus spp. que adjuntaban informes publicados anteriormente.

Comúnmente, la infección por ITU se registró mucho más en las mujeres que en los hombres . De forma improbable, encontramos que la mitad de las infecciones por grampositivos se registraron en varones. Los resultados preliminares mostraron que los varones son más vulnerables a las infecciones por grampositivos en comparación con la situación general. La distribución por edades de los casos de nuestro estudio va desde menos de un año hasta más de 70 años. Sin embargo, la infección por grampositivos más frecuente se produjo en el grupo de edad de entre 21 y 30 años, tal y como se ha confirmado en otros estudios.

La resistencia a los antibióticos entre los uropatógenos se ha convertido en un problema de salud pública en Bangladesh. En este estudio, se determinaron los perfiles de susceptibilidad a los antibióticos de los patógenos grampositivos de las ITU con seis discos de antibióticos diferentes mediante la prueba de difusión de discos. El mayor porcentaje de resistencia se observó contra la nitrofurantoína, mientras que el menor porcentaje de resistencia se encontró contra la amikacina y la gentamicina. Menos del 10% de los uropatógenos grampositivos aparecieron resistentes contra esos dos antibióticos del grupo de los aminoglucósidos. Los resultados respaldan a los aminoglucósidos como fármacos de elección para los patógenos grampositivos de las ITU. Entre los antibióticos del grupo de las quinolonas, el mayor porcentaje de resistencia lo presentó la lomefloxacina de segunda generación (75%). Los resultados de nuestro antibiograma mostraron que la nitrofurantoína no era un fármaco muy eficaz para las bacterias grampositivas de la ITU. El antiguo antibiótico betalactámico, la amoxicilina, era débilmente funcional contra los patógenos de la ITU grampositiva. Los antibióticos fluoroquinolonas, ofloxacilina y lomefloxacina, resultaron ser moderadamente eficaces.

Se analizaron los aislados para detectar genes AMR seleccionados mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), utilizando cebadores específicos para la detección de bla-TEM y qnrS. Alrededor del 33% de los aislados fueron positivos para bla-TEM y el 50% para qnrS. Se detectaron genes resistentes a los antibióticos y mostraron armonía con el patrón de susceptibilidad fenotípica. Aunque se investigó con la máxima sinceridad y dedicación para llevar a cabo el estudio, éste no pudo superar las limitaciones, ya que el tamaño de la muestra no era lo suficientemente grande. A pesar de esta limitación, es de esperar que este hallazgo del estudio ayude a los clínicos a decidir la prescripción de antibióticos a partir del estudio basado en la evidencia. El clínico debería ocuparse del diagnóstico específico antes de prescribir una terapia antibiótica empírica, especialmente en el caso de la ITU masculina.

Declaración ética

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética y Revisión de la Investigación de la Universidad de Jahangirnagar, Facultad de Ciencias Biológicas, y se obtuvo el consentimiento verbal de los pacientes de ITU y de los médicos.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a los respectivos pacientes y médicos su cooperación. Los autores agradecen la contribución del personal del laboratorio general, Departamento de Microbiología, Universidad de Jahangirnagar.

Divulgación

Este trabajo fue apoyado en parte por el Grant for Advance Research (GARE), del Ministerio de Educación y el Ministry of Science and Technology Research Grant, Bangladesh, al Dr. Md. Salequl Islam.

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