Crick se interesó por dos problemas fundamentales de la biología sin resolver: cómo las moléculas hacen la transición de lo no vivo a lo vivo, y cómo el cerebro crea una mente consciente. Se dio cuenta de que su formación le capacitaba para investigar el primer tema y el campo de la biofísica. Fue en esta época de transición de Crick de la física a la biología cuando recibió la influencia de Linus Pauling y Erwin Schrödinger. En teoría, estaba claro que los enlaces covalentes en las moléculas biológicas podían proporcionar la estabilidad estructural necesaria para mantener la información genética en las células. Sólo quedaba como ejercicio de biología experimental descubrir exactamente qué molécula era la molécula genética. En opinión de Crick, la teoría de la evolución por selección natural de Charles Darwin, la genética de Gregor Mendel y el conocimiento de las bases moleculares de la genética, al combinarse, revelaban el secreto de la vida. Crick tenía la visión muy optimista de que la vida se crearía muy pronto en un tubo de ensayo. Sin embargo, algunas personas (como la investigadora y colega Esther Lederberg) pensaron que Crick era excesivamente optimista
Estaba claro que alguna macromolécula, como una proteína, era probable que fuera la molécula genética. Sin embargo, era bien sabido que las proteínas son macromoléculas estructurales y funcionales, algunas de las cuales llevan a cabo reacciones enzimáticas de las células. En la década de 1940, se encontraron algunas pruebas que apuntaban a otra macromolécula, el ADN, el otro componente principal de los cromosomas, como molécula genética candidata. En el experimento Avery-MacLeod-McCarty de 1944, Oswald Avery y sus colaboradores demostraron que se podía provocar una diferencia fenotípica heredable en las bacterias proporcionándoles una determinada molécula de ADN.
Sin embargo, se interpretaron otras pruebas que sugerían que el ADN era estructuralmente poco interesante y posiblemente sólo un andamiaje molecular para las moléculas de proteínas, aparentemente más interesantes. Crick estaba en el lugar adecuado, en el estado de ánimo adecuado, en el momento adecuado (1949), para unirse al proyecto de Max Perutz en la Universidad de Cambridge, y comenzó a trabajar en la cristalografía de rayos X de las proteínas. La cristalografía de rayos X ofrecía teóricamente la oportunidad de revelar la estructura molecular de grandes moléculas como las proteínas y el ADN, pero había entonces graves problemas técnicos que impedían que la cristalografía de rayos X fuera aplicable a moléculas tan grandes.
1949-1950Editar
Crick aprendió por sí mismo la teoría matemática de la cristalografía de rayos X. Durante el periodo de estudio de Crick sobre la difracción de rayos X, los investigadores del laboratorio de Cambridge intentaban determinar la conformación helicoidal más estable de las cadenas de aminoácidos en las proteínas (la hélice alfa). Linus Pauling fue el primero en identificar la proporción de 3,6 aminoácidos por vuelta de hélice de la hélice alfa. Crick fue testigo de los tipos de errores que sus colaboradores cometieron en sus intentos fallidos de hacer un modelo molecular correcto de la hélice alfa; estos resultaron ser lecciones importantes que podrían aplicarse, en el futuro, a la estructura helicoidal del ADN. Por ejemplo, aprendió la importancia de la rigidez estructural que los dobles enlaces confieren a las estructuras moleculares, lo cual es relevante tanto para los enlaces peptídicos en las proteínas como para la estructura de los nucleótidos en el ADN.
1951-1953: Estructura del ADNEditar
En 1951 y 1952, junto con William Cochran y Vladimir Vand, Crick colaboró en el desarrollo de una teoría matemática de la difracción de rayos X por una molécula helicoidal. Este resultado teórico coincidía con los datos de rayos X de las proteínas que contienen secuencias de aminoácidos en la conformación de hélice alfa. La teoría de la difracción helicoidal resultó ser también útil para comprender la estructura del ADN.
A finales de 1951, Crick comenzó a trabajar con James Watson en el Laboratorio Cavendish de la Universidad de Cambridge, Inglaterra. Utilizando la «Foto 51» (los resultados de difracción de rayos X de Rosalind Franklin y su estudiante de posgrado Raymond Gosling del King’s College de Londres, que les fueron entregados por Gosling y Wilkins, colega de Franklin), Watson y Crick desarrollaron juntos un modelo de estructura helicoidal del ADN, que publicaron en 1953. Por este trabajo y otros posteriores recibieron conjuntamente con Wilkins el Premio Nobel de Fisiología o Medicina en 1962.
Cuando Watson llegó a Cambridge, Crick era un estudiante de postgrado de 35 años (debido a su trabajo durante la Segunda Guerra Mundial) y Watson sólo tenía 23, pero ya había obtenido un doctorado. Compartían el interés por el problema fundamental de saber cómo se podía almacenar la información genética en forma molecular. Watson y Crick hablaban sin cesar del ADN y de la idea de que podría ser posible adivinar un buen modelo molecular de su estructura. Una pieza clave de información obtenida experimentalmente procedía de las imágenes de difracción de rayos X que habían obtenido Wilkins, Franklin y Gosling. En noviembre de 1951, Wilkins acudió a Cambridge y compartió sus datos con Watson y Crick. Alexander Stokes (otro experto en la teoría de la difracción helicoidal) y Wilkins (ambos en el King’s College) habían llegado a la conclusión de que los datos de difracción de rayos X del ADN indicaban que la molécula tenía una estructura helicoidal, pero Franklin cuestionó con vehemencia esta conclusión. Estimulados por sus discusiones con Wilkins y por lo que Watson aprendió al asistir a una charla dada por Franklin sobre su trabajo en el ADN, Crick y Watson produjeron y mostraron un primer modelo erróneo del ADN. Su prisa por producir un modelo de la estructura del ADN se debió en parte a que sabían que competían con Linus Pauling. Dado el reciente éxito de Pauling en el descubrimiento de la hélice Alfa, temían que Pauling pudiera ser también el primero en determinar la estructura del ADN.
Muchos han especulado sobre lo que podría haber ocurrido si Pauling hubiera podido viajar a Gran Bretaña como estaba previsto en mayo de 1952. Sin embargo, sus actividades políticas hicieron que el gobierno de los Estados Unidos restringiera su viaje y no visitó el Reino Unido hasta más tarde, momento en el que no se reunió con ninguno de los investigadores del ADN en Inglaterra. En cualquier caso, en ese momento estaba preocupado por las proteínas, no por el ADN. Watson y Crick no estaban trabajando oficialmente en el ADN. Crick estaba escribiendo su tesis doctoral; Watson también tenía otros trabajos, como intentar obtener cristales de mioglobina para experimentos de difracción de rayos X. En 1952, Watson realizó difracción de rayos X sobre el virus del mosaico del tabaco y encontró resultados que indicaban que tenía una estructura helicoidal. Tras haber fracasado una vez, Watson y Crick se mostraron algo reacios a volver a intentarlo y durante un tiempo se les prohibió realizar más esfuerzos para encontrar un modelo molecular del ADN.
De gran importancia para el esfuerzo de construcción de modelos de Watson y Crick fue la comprensión de Rosalind Franklin de la química básica, que indicaba que las espinas dorsales hidrofílicas que contienen fosfatos de las cadenas de nucleótidos del ADN debían colocarse de forma que interactuaran con las moléculas de agua en el exterior de la molécula, mientras que las bases hidrofóbicas debían empaquetarse en el núcleo. Franklin compartió este conocimiento químico con Watson y Crick cuando les señaló que su primer modelo (de 1951, con los fosfatos en el interior) era obviamente erróneo.
Crick describió lo que consideraba como el fracaso de Wilkins y Franklin a la hora de cooperar y trabajar para encontrar un modelo molecular del ADN como una de las principales razones por las que él y Watson finalmente hicieron un segundo intento para hacerlo. Para ello, pidieron y recibieron el permiso de William Lawrence Bragg y de Wilkins. Para construir su modelo de ADN, Watson y Crick hicieron uso de la información de imágenes inéditas de difracción de rayos X de Franklin (mostradas en reuniones y compartidas libremente por Wilkins), incluidas las cuentas preliminares de los resultados de Franklin/fotografías de las imágenes de rayos X que se incluyeron en un informe de progreso escrito para el laboratorio del King’s College de Sir John Randall de finales de 1952.
Es una cuestión de debate si Watson y Crick debían haber tenido acceso a los resultados de Franklin sin su conocimiento o permiso, y antes de que ella tuviera la oportunidad de publicar formalmente los resultados de su análisis detallado de sus datos de difracción de rayos X que se incluyeron en el informe de progreso. Sin embargo, Watson y Crick encontraron un fallo en su firme afirmación de que, según sus datos, la estructura helicoidal no era la única forma posible del ADN, por lo que se encontraron con un dilema. En un esfuerzo por aclarar esta cuestión, Max Ferdinand Perutz publicó posteriormente lo que había en el informe de progreso, y sugirió que no había nada en el informe que la propia Franklin no hubiera dicho en su charla (a la que asistió Watson) a finales de 1951. Además, Perutz explicó que el informe iba dirigido a un comité del Consejo de Investigación Médica (MRC) que se había creado para «establecer contacto entre los diferentes grupos de personas que trabajaban para el Consejo». Tanto el laboratorio de Randall como el de Perutz estaban financiados por el MRC.
Tampoco está clara la importancia de los resultados no publicados de Franklin en el informe de progreso para la construcción de modelos realizada por Watson y Crick. Después de que se recogieran las primeras imágenes crudas de difracción de rayos X del ADN en la década de 1930, William Astbury había hablado de pilas de nucleótidos espaciadas a intervalos de 3,4 angström (0,34 nanómetros) en el ADN. Una cita al anterior trabajo de difracción de rayos X de Astbury fue una de las ocho referencias en el primer artículo de Franklin sobre el ADN. El análisis de los resultados publicados por Astbury sobre el ADN y las mejores imágenes de difracción de rayos X recogidas por Wilkins y Franklin revelaron la naturaleza helicoidal del ADN. Fue posible predecir el número de bases apiladas dentro de una sola vuelta de la hélice del ADN (10 por vuelta; una vuelta completa de la hélice tiene 27 angströms en la forma A compacta, 34 angströms en la forma B más húmeda). Wilkins compartió esta información sobre la forma B del ADN con Crick y Watson. Crick no vio las imágenes de rayos X de la forma B de Franklin (Foto 51) hasta después de que se publicara el modelo de doble hélice del ADN.
Una de las pocas referencias citadas por Watson y Crick cuando publicaron su modelo de ADN fue a un artículo publicado que incluía el modelo de ADN de Sven Furberg que tenía las bases en el interior. Así pues, el modelo de Watson y Crick no fue el primer modelo de «bases dentro» que se propuso. Los resultados de Furberg también habían proporcionado la orientación correcta de los azúcares del ADN con respecto a las bases. Durante la construcción de su modelo, Crick y Watson aprendieron que una orientación antiparalela de las dos cadenas de nucleótidos funcionaba mejor para orientar los pares de bases en el centro de la doble hélice. El acceso de Crick al informe de progreso de Franklin de finales de 1952 es lo que hizo que Crick confiara en que el ADN era una doble hélice con cadenas antiparalelas, pero había otras cadenas de razonamiento y fuentes de información que también llevaron a estas conclusiones.
Al dejar el King’s College por el Birkbeck College, John Randall pidió a Franklin que abandonara su trabajo sobre el ADN. Cuando a Wilkins y a los supervisores de Watson y Crick les quedó claro que Franklin se iba al nuevo trabajo, y que Linus Pauling estaba trabajando en la estructura del ADN, estuvieron dispuestos a compartir los datos de Franklin con Watson y Crick, con la esperanza de que pudieran encontrar un buen modelo de ADN antes de que Pauling pudiera hacerlo. Los datos de difracción de rayos X de Franklin para el ADN y su análisis sistemático de las características estructurales del ADN fueron útiles para que Watson y Crick los guiaran hacia un modelo molecular correcto. El problema clave para Watson y Crick, que no pudo ser resuelto por los datos del King’s College, fue adivinar cómo se empaquetan las bases nucleotídicas en el núcleo de la doble hélice del ADN.
Otra clave para encontrar la estructura correcta del ADN fueron las llamadas proporciones de Chargaff, proporciones determinadas experimentalmente de las subunidades de nucleótidos del ADN: la cantidad de guanina es igual a la de citosina y la de adenina es igual a la de timina. Una visita de Erwin Chargaff a Inglaterra, en 1952, reforzó la relevancia de este importante hecho para Watson y Crick. La importancia de estas proporciones para la estructura del ADN no se reconoció hasta que Watson, persistiendo en la construcción de modelos estructurales, se dio cuenta de que los pares A:T y C:G son estructuralmente similares. En particular, la longitud de cada par de bases es la misma. Chargaff también señaló a Watson que, en el medio acuoso y salino de la célula, los tautómeros predominantes de las bases pirimidínicas (C y T) serían las configuraciones amina y ceto de la citosina y la timina, en lugar de las formas imino y enol que Crick y Watson habían supuesto. Consultaron a Jerry Donohue, quien confirmó las estructuras más probables de las bases nucleotídicas. Los pares de bases se mantienen unidos por enlaces de hidrógeno, la misma interacción no covalente que estabiliza la α-hélice de las proteínas. Las estructuras correctas eran esenciales para el posicionamiento de los enlaces de hidrógeno. Estos conocimientos llevaron a Watson a deducir las verdaderas relaciones biológicas de los pares A:T y C:G. Tras el descubrimiento de los pares A:T y C:G con enlaces de hidrógeno, Watson y Crick pronto tuvieron su modelo antiparalelo y de doble hélice del ADN, en el que los enlaces de hidrógeno en el núcleo de la hélice proporcionaban una forma de «descomprimir» las dos hebras complementarias para facilitar la replicación: el último requisito clave para un modelo probable de la molécula genética. A pesar de lo importantes que fueron las contribuciones de Crick al descubrimiento del modelo de ADN de doble hélice, declaró que sin la oportunidad de colaborar con Watson, no habría encontrado la estructura por sí mismo.
Crick intentó tímidamente realizar algunos experimentos sobre el emparejamiento de bases de nucleótidos, pero era más un biólogo teórico que un biólogo experimental. A principios de 1952 se produjo otro casi descubrimiento de las reglas de emparejamiento de bases. Crick había empezado a pensar en las interacciones entre las bases. Pidió a John Griffith que intentara calcular las interacciones atractivas entre las bases del ADN a partir de principios químicos y de la mecánica cuántica. La mejor estimación de Griffith fue que A:T y G:C eran pares atractivos. En aquel momento, Crick no conocía las reglas de Chargaff y no le dio mucha importancia a los cálculos de Griffith, aunque sí le hizo pensar en la replicación complementaria. La identificación de las reglas correctas de emparejamiento de bases (A-T, G-C) se consiguió gracias a que Watson «jugó» con modelos de cartón recortados de las bases de los nucleótidos, de forma muy parecida a como Linus Pauling había descubierto la hélice alfa de las proteínas unos años antes. El descubrimiento de la estructura de la doble hélice del ADN por parte de Watson y Crick fue posible gracias a su voluntad de combinar la teoría, la modelización y los resultados experimentales (aunque en su mayoría realizados por otros) para lograr su objetivo.
La estructura de la doble hélice del ADN propuesta por Watson y Crick se basaba en los enlaces «Watson-Crick» entre las cuatro bases que se encuentran con más frecuencia en el ADN (A, C, T, G) y el ARN (A, C, U, G). Sin embargo, investigaciones posteriores demostraron que las estructuras moleculares de triple y cuádruple cadena y otras más complejas del ADN requerían el emparejamiento de bases Hoogsteen. Todo el campo de la biología sintética comenzó con los trabajos de investigadores como Erik T. Kool, en los que se utilizan bases distintas de A, C, T y G en un ADN sintético. Además del ADN sintético, también se intenta construir codones sintéticos, endonucleasas sintéticas, proteínas sintéticas y dedos de zinc sintéticos. Utilizando ADN sintético, en lugar de haber 43 codones, si hay n bases nuevas podría haber hasta n3 codones. Actualmente se está investigando si los codones pueden ampliarse a más de 3 bases. Estos nuevos codones pueden codificar nuevos aminoácidos. Estas moléculas sintéticas pueden utilizarse no sólo en medicina, sino en la creación de nuevos materiales.
El descubrimiento se realizó el 28 de febrero de 1953; el primer artículo de Watson/Crick apareció en Nature el 25 de abril de 1953. Sir Lawrence Bragg, director del Laboratorio Cavendish, donde trabajaban Watson y Crick, dio una charla en la Escuela de Medicina del Hospital Guy de Londres el jueves 14 de mayo de 1953 que dio lugar a un artículo de Ritchie Calder en el News Chronicle de Londres, el viernes 15 de mayo de 1953, titulado «Why You Are You. El secreto más cercano de la vida». La noticia llegó a los lectores de The New York Times al día siguiente; Victor K. McElheny, al investigar su biografía, «Watson y el ADN: Making a Scientific Revolution», encontró un recorte de un artículo de seis párrafos del New York Times escrito desde Londres y fechado el 16 de mayo de 1953 con el titular «Se escanea la forma de la «unidad de vida» en la célula». El artículo se publicó en una de las primeras ediciones y luego fue retirado para dejar espacio a noticias consideradas más importantes. (El New York Times publicó posteriormente un artículo más largo el 12 de junio de 1953). El periódico universitario Varsity también publicó un breve artículo sobre el descubrimiento el sábado 30 de mayo de 1953. El anuncio original de Bragg sobre el descubrimiento en una conferencia sobre proteínas en Solvay, en Bélgica, el 8 de abril de 1953, no fue recogido por la prensa británica.
En una carta manuscrita de siete páginas dirigida a su hijo en un internado británico el 19 de marzo de 1953, Crick explicaba su descubrimiento, comenzando la carta «Mi querido Michael, Jim Watson y yo hemos hecho probablemente un descubrimiento muy importante…». La carta se sacó a subasta en Christie’s Nueva York el 10 de abril de 2013 con una estimación de entre 1 y 2 millones de dólares, y finalmente se vendió por 6.059.750 dólares, la mayor cantidad jamás pagada por una carta en subasta.
Sydney Brenner, Jack Dunitz, Dorothy Hodgkin, Leslie Orgel y Beryl M. Oughton, fueron algunas de las primeras personas que en abril de 1953 vieron el modelo de la estructura del ADN, construido por Crick y Watson; en ese momento trabajaban en el Departamento de Química de la Universidad de Oxford. Todos quedaron impresionados por el nuevo modelo de ADN, especialmente Brenner, que posteriormente trabajó con Crick en Cambridge en el Laboratorio Cavendish y en el nuevo Laboratorio de Biología Molecular. Según la difunta Dra. Beryl Oughton, más tarde Rimmer, todos viajaron juntos en dos coches una vez que Dorothy Hodgkin les anunció que iban a Cambridge a ver el modelo de la estructura del ADN. Orgel también trabajó más tarde con Crick en el Instituto Salk de Estudios Biológicos.
Poco después de la muerte de Crick, se ha alegado que había consumido LSD cuando se le ocurrió la idea de la estructura helicoidal del ADN. Aunque es casi seguro que consumió LSD, es poco probable que lo hiciera ya en 1953.
Biología molecularEditar
En 1954, a la edad de 37 años, Crick completó su tesis doctoral: «Difracción de rayos X: Polipéptidos y proteínas» y recibió su título. A continuación, Crick trabajó en el laboratorio de David Harker en el Instituto Politécnico de Brooklyn, donde continuó desarrollando sus habilidades en el análisis de los datos de difracción de rayos X para las proteínas, trabajando principalmente en la ribonucleasa y los mecanismos de la síntesis de proteínas. David Harker, el cristalógrafo de rayos X estadounidense, fue descrito como «el John Wayne de la cristalografía» por Vittorio Luzzati, un cristalógrafo del Centro de Genética Molecular de Gif-sur-Yvette, cerca de París, que había trabajado con Rosalind Franklin.
Tras el descubrimiento del modelo de doble hélice del ADN, el interés de Crick se centró rápidamente en las implicaciones biológicas de la estructura. En 1953, Watson y Crick publicaron otro artículo en Nature que decía: «por tanto, parece probable que la secuencia precisa de las bases sea el código que transporta la información genética».
En 1956, Crick y Watson especularon sobre la estructura de los virus pequeños. Sugirieron que los virus esféricos, como el virus del rabito del tomate, tenían una simetría icosaédrica y estaban formados por 60 subunidades idénticas.
Tras su breve estancia en Nueva York, Crick regresó a Cambridge, donde trabajó hasta 1976, momento en el que se trasladó a California. Crick participó en varias colaboraciones de difracción de rayos X, como una con Alexander Rich sobre la estructura del colágeno. Sin embargo, Crick se alejó rápidamente del trabajo continuado relacionado con su experiencia en la interpretación de los patrones de difracción de rayos X de las proteínas.
George Gamow estableció un grupo de científicos interesados en el papel del ARN como intermediario entre el ADN como molécula de almacenamiento genético en el núcleo de las células y la síntesis de proteínas en el citoplasma (el RNA Tie Club). Crick tenía claro que tenía que haber un código por el que una corta secuencia de nucleótidos especificara un aminoácido concreto en una proteína recién sintetizada. En 1956, Crick escribió un artículo informal sobre el problema de la codificación genética para el pequeño grupo de científicos del grupo de ARN de Gamow. En este artículo, Crick revisaba las pruebas que apoyaban la idea de que había un conjunto común de unos 20 aminoácidos utilizados para sintetizar proteínas. Crick propuso que había un conjunto correspondiente de pequeñas «moléculas adaptadoras» que se unirían por enlace de hidrógeno a secuencias cortas de un ácido nucleico, y también se unirían a uno de los aminoácidos. También exploró las numerosas posibilidades teóricas por las que secuencias cortas de ácido nucleico podrían codificar los 20 aminoácidos.
Durante los mediados y finales de la década de 1950, Crick estaba muy ocupado intelectualmente en resolver el misterio de cómo se sintetizan las proteínas. En 1958, el pensamiento de Crick había madurado y podía enumerar de forma ordenada todas las características clave del proceso de síntesis de proteínas:
- información genética almacenada en la secuencia de moléculas de ADN
- una molécula de ARN «mensajero» para llevar al citoplasma las instrucciones para fabricar una proteína
- moléculas adaptadoras («podrían contener nucleótidos») para hacer coincidir secuencias cortas de nucleótidos en las moléculas de ARN mensajero con aminoácidos específicos
- complejos ribonucleicos-complejos proteicos que catalizan el ensamblaje de los aminoácidos en proteínas según el ARN mensajero
Con el tiempo se demostró que las moléculas adaptadoras eran ARNt y los «complejos ribonucleicos-proteicos» catalíticos pasaron a denominarse ribosomas. Un paso importante fue la comprensión posterior (en 1960) de que el ARN mensajero no era el mismo que el ARN ribosómico. Sin embargo, nada de esto respondió a la cuestión teórica fundamental de la naturaleza exacta del código genético. En su artículo de 1958, Crick especuló, al igual que otros, que un triplete de nucleótidos podía codificar un aminoácido. Dicho código podría ser «degenerado», con 4×4×4=64 posibles tripletes de las cuatro subunidades de nucleótidos, mientras que sólo había 20 aminoácidos. Algunos aminoácidos podrían tener múltiples códigos de tripletes. Crick también exploró otros códigos en los que, por diversas razones, sólo se utilizaban algunos de los tripletes, produciendo «mágicamente» sólo las 20 combinaciones necesarias. Se necesitaban resultados experimentales; la teoría por sí sola no podía decidir la naturaleza del código. Crick también utilizó el término «dogma central» para resumir una idea que implica que el flujo de información genética entre macromoléculas sería esencialmente unidireccional:
ADN → ARN → Proteína
Algunos críticos pensaron que al utilizar la palabra «dogma», Crick daba a entender que se trataba de una regla que no se podía cuestionar, pero todo lo que quería decir realmente era que se trataba de una idea convincente sin muchas pruebas sólidas que la respaldaran. En su reflexión sobre los procesos biológicos que vinculan los genes del ADN con las proteínas, Crick hizo explícita la distinción entre los materiales implicados, la energía necesaria y el flujo de información. Crick se centró en este tercer componente (la información) y se convirtió en el principio organizador de lo que se conoció como biología molecular. Para entonces, Crick se había convertido en un biólogo molecular teórico muy influyente.
La prueba de que el código genético es un código de tripletes degenerado se obtuvo finalmente a partir de experimentos genéticos, algunos de los cuales fueron realizados por Crick. Los detalles del código procedían sobre todo de los trabajos de Marshall Nirenberg y otros que sintetizaron moléculas de ARN sintéticas y las utilizaron como plantillas para la síntesis de proteínas in vitro. Nirenberg anunció por primera vez sus resultados a una pequeña audiencia en Moscú en una conferencia de 1961. La reacción de Crick fue invitar a Nirenberg a dar su charla ante un público más amplio.