Abstract
Antecedentes. La detección temprana de la bacteriemia Gram-positiva y el tratamiento antimicrobiano adecuado a tiempo son necesarios para disminuir la mortalidad de los pacientes. El propósito de nuestro estudio fue evaluar el rendimiento del ensayo de hemocultivo Gram-positivo Verigene (BC-GP) en dos entornos sanitarios especiales y determinar el impacto potencial de las pruebas rápidas de hemocultivo para la bacteriemia Gram-positiva dentro del sistema sanitario japonés. Además, el estudio incluyó cultivos de sangre simulados, que incluían una biblioteca de aislados de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) y enterococos resistentes a la vancomicina (ERV) bien caracterizados que reflejaban diferentes regiones geográficas de Japón. Métodos. Se realizaron un total de 347 ensayos BC-GP en cultivos de sangre clínicos y simulados. Los resultados de BC-GP se compararon con los obtenidos por métodos de referencia para la identificación del género/especie y la detección de genes de resistencia mediante metodologías moleculares y MALDI-TOF MS. Resultados. Para la identificación y detección de genes de resistencia en dos sitios clínicos y cultivos de sangre simulados, la concordancia general de BC-GP con los métodos de referencia fue de 327/347 (94%). El tiempo para la identificación y la detección de la resistencia a los antimicrobianos mediante BC-GP fue significativamente más corto en comparación con las pruebas de rutina, especialmente en el hospital de cardiología, que no ofrece servicios de microbiología clínica los fines de semana y los días festivos. Conclusión. El BC-GP generó una identificación y detección precisa de marcadores de resistencia en comparación con los métodos rutinarios de laboratorio para organismos Gram-positivos en entornos clínicos especializados proporcionando resultados más rápidos que las pruebas rutinarias actuales.
1. Introducción
Las bacterias grampositivas son los microorganismos más predominantes asociados a la sepsis en entornos sanitarios y la causa más prevalente de bacteriemia en pacientes con trasplante de células madre hematopoyéticas . La bacteriemia enterocócica se asocia a un mayor riesgo de mortalidad en pacientes con trasplante de células madre hematopoyéticas, independientemente de la sensibilidad a la vancomicina . En las unidades de cardiología, la endocarditis infecciosa, el aneurisma infeccioso, las infecciones del torrente sanguíneo relacionadas con los catéteres o las infecciones del sitio quirúrgico después de las cirugías cardíacas son las principales infecciones de las que los microorganismos causantes más comunes son los cocos Gram-positivos . En ambas unidades médicas, la detección precoz de los Gram positivos y de los marcadores de resistencia es muy importante para la gestión de la atención al paciente, la administración de antibióticos y la prevención de la propagación de microorganismos resistentes.
Como la intervención temprana con terapia antimicrobiana se asocia a un mejor pronóstico y cada hora de retraso se asocia a un aumento de la mortalidad, el diagnóstico rápido es fundamental . El ensayo de hemocultivo Gram-positivo Verigene (BC-GP) (Nanosphere, Inc., Northbrook, IL) es un sistema de microarray de muestra a resultado para la identificación de bacterias Gram-positivas comunes y de los principales marcadores de resistencia directamente a partir de un hemocultivo positivo. Aunque varios estudios han evaluado previamente el rendimiento del BC-GP, que oscila entre el 92 y el 99% de acuerdo con la metodología convencional, una limitación de los informes anteriores ha sido que muchos de los estudios han sido de los Estados Unidos, así como de países fuera de Japón, con sólo un informe publicado de alcance limitado en Japón.
La variación genética entre los linajes bacterianos que circulan en diferentes regiones geográficas del mundo puede afectar a la sensibilidad de los ensayos moleculares basados en sondas de oligonucleótidos para detectar organismos o marcadores de resistencia. Estudios realizados en Hong Kong y Bélgica han informado de un menor rendimiento de la BC-GP.
El objetivo de este estudio era determinar el posible impacto en el manejo y el resultado de los pacientes de la BC-GP en entornos hospitalarios especializados dentro del entorno sanitario japonés, que se enfrenta a una serie de retos. El creciente envejecimiento de la población y la carga que conlleva el aumento de los costes globales de la atención sanitaria han supuesto un reto para la infraestructura sanitaria. A pesar de que el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) representa más del 90% de las infecciones hospitalarias causadas por bacterias resistentes en Japón, la externalización de las pruebas de microbiología clínica o la ausencia de cobertura durante el fin de semana es habitual en muchos centros sanitarios como parte de la contención de costes. Este trabajo representa la primera evaluación exhaustiva de BC-GP en Japón para validar su rendimiento clínico. El estudio de hemocultivo simulado incluye una biblioteca de SARM bien caracterizados asociados a la atención sanitaria (SARM-AH), SARM adquiridos en la comunidad (SARM-AH) y cepas de enterococos resistentes a la vancomicina (ERV) que circulan en Japón.
2. Métodos
El CB-GP se evaluó en el Hospital Toranomon (TH) y en el Instituto del Corazón Sakakibara (SHI), de acuerdo con los protocolos de estudio aprobados por la junta de revisión institucional de cada centro, durante el 26 de junio de 2012 y el 6 de marzo de 2013. El TH es un hospital universitario general con 1168 camas y una unidad de cuidados hematológicos de 123 camas para el trasplante de células madre hematopoyéticas que realiza entre 140 y 160 trasplantes de células madre hematopoyéticas al año. El laboratorio de microbiología del hospital funciona diariamente en horario diurno. El SHI es un hospital universitario de 320 camas especializado en enfermedades cardiovasculares con un volumen de trabajo de más de 1.500 cirugías a corazón abierto al año. El laboratorio de microbiología del hospital está gestionado por un laboratorio comercial externo de referencia. El laboratorio de microbiología funciona durante el turno de día en días laborables y cierra los fines de semana y los días festivos.
Los cultivos de sangre se realizaron en el SHI utilizando frascos BacT/ALERT FA y la monitorización con BacT/ALERT 3D (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francia). En TH se utilizaron frascos BACTEC Plus y monitorización con BACTEC 9240 y FX (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Sólo se incluyó en el estudio un frasco de hemocultivo positivo con cocos o bacilos Gram positivos por paciente. Se almacenaron dos ml de medio de hemocultivo positivo a -85C para volver a realizar las pruebas.
La identificación microbiológica rutinaria y las pruebas de susceptibilidad de los aislados se realizaron utilizando pruebas de identificación convencionales como la solubilidad en la bilis, la susceptibilidad al disco de optoquina y el sistema MicroScan WalkAway (Beckman Coulter, Pasadena, CA) en el TH y el sistema Vitek 2 (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francia) en el SHI. El cribado de la cefoxitina para detectar la resistencia a la meticilina se realizó de acuerdo con las directrices del CLSI. También se utilizó una prueba de aglutinación de látex para la detección de la proteína de unión a la penicilina PBP2a.
La prueba BC-GP se realizó en cultivos de sangre positivos que mostraban organismos Gram-positivos según las instrucciones del fabricante. Brevemente, se pipeteó una muestra bien mezclada de 350 μl del medio de cultivo de sangre en el pozo de muestra de la bandeja de extracción nucleica BC-GP, y se colocó en el Verigene Processor SP para su procesamiento y análisis por el Verigene Reader.
Se realizó una evaluación para determinar la diferencia de tiempo entre la notificación de los resultados utilizando BC-GP y los resultados de identificación y susceptibilidad antimicrobiana basados en cultivos para 139 caldos de cultivo de sangre positivos. Para los resultados basados en el cultivo, el tiempo requerido hasta la generación del informe final fue el tiempo transcurrido entre la lectura de la tinción de Gram y la introducción de los resultados finales de identificación y susceptibilidad en el sistema de información del laboratorio. En el caso de la BC-GP, el tiempo hasta la obtención del resultado fue el tiempo transcurrido entre la lectura de la tinción de Gram y la introducción de los resultados de la BC-GP en el sistema de información del laboratorio.
Se construyó un conjunto de desafío de 208 hemocultivos simulados utilizando cepas tipo, de referencia y clínicas de diferentes regiones geográficas de Japón para evaluar la BC-GP. Las cepas clínicas incluían organismos que presentaban desafíos para los sistemas de identificación comerciales en estudios clínicos anteriores en el TH y el SHI. Además, también se probó una biblioteca de cepas bien caracterizadas de HA-MRSA, CA-MRSA y VRE de Japón. Se realizaron estudios de hemocultivos simulados en el Laboratorio Médico Miroku (ciudad de Saku, prefectura de Nagano, Japón). Doscientas ocho cepas se ajustaron a una turbidez de aproximadamente 100 UFC/ml en solución salina estéril. Se inocularon 300 μl en frascos BACTEC Plus Aerobic/F que contenían de 8 a 10 ml de sangre humana completa (tipo de sangre O, Tennessee Blood Services, Memphis, TN) para obtener un inóculo final de 30 UFC/botella. También se inoculó un frasco BACTEC Plus Anaerobic/F para S. pneumoniae y el grupo S. anginosus. Cada frasco se incubó en el sistema BACTEC hasta que se generó una señal positiva. Si el BC-GP generaba resultados negativos, se volvió a realizar una dilución de 11 veces del medio de hemocultivo utilizando agua destilada estéril.
Cada uno de los aislados de hemocultivo positivos en los dos centros hospitalarios se almacenó en leche desnatada al 10% (Difco) a -85C. La identificación de las especies se confirmó mediante espectrometría de masas por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) (Microflex LT con software Biotyper ver. 3.0; Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania) para todas las cepas. Si el organismo no se identificaba a nivel de especie mediante MALDI-TOF MS (valor de puntuación < 2,0) o se identificaba como Micrococcus, Listeria, Staphylococcus distinto de S. aureus, Streptococcus distinto de S. pyogenes y S. agalactiae, se realizaban pruebas de confirmación mediante secuenciación directa por PCR de 16S rDNA o sodA en la Universidad de Juntendo o en la Universidad Médica Femenina de Tokio. Se realizó una PCR específica para detectar mecA en todos los estafilococos y vanA, vanB en todos los enterococos. Los métodos utilizados para la tipificación de SCCmec de SARM adquiridos en la comunidad o asociados a la asistencia sanitaria utilizados para caracterizar las cepas se han descrito previamente.
La concordancia se determinó en comparación con los resultados de los métodos de referencia. Había concordancia si la detección del objetivo BC-GP coincidía con el método de referencia a nivel de género o de especie. Los intervalos de confianza del noventa y cinco por ciento (IC del 95%) y la prueba pareada se determinaron utilizando GraphPad StatMate (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).
3. Resultados
En este estudio, la concordancia global de identificación entre la BC-GP y el método de referencia fue de 327/347 (94%) para los cultivos de sangre prospectivos en dos centros clínicos y los cultivos de sangre simulados. La concordancia combinada entre la PCR y la BC-GP para la detección de mecA fue de 71/73 (97%) para los hemocultivos prospectivos y los hemocultivos simulados.
La precisión de identificación combinada de ambos centros hospitalarios fue de 129/139 (93%). Para los cultivos monomicrobianos, la precisión de identificación fue de 121/124 (98%). La concordancia entre la PCR y la BC-GP para la positividad de mecA fue de 51/53 (96%). La tabla 1 muestra los resultados de la TH. En general, 96/104 (92%) organismos fueron identificados correctamente por BC-GP a nivel de especie o género, incluyendo la detección de genes de resistencia. Como se muestra en la Tabla 2, la concordancia total de BC-GP con el método de referencia en SHI fue de 33/35 (94%) organismos.
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| Cultivo polimicrobiano de meticilina-sensible a la meticilina y resistente a la meticilina S. epidermidis. Cultivo polimicrobiano con E. faecium. Identificado correctamente como Staphylococcus, pero no como S. epidermidis, S. aureus o S. lugdunensis. Cultivo polimicrobiano con S. tigurinus. El «grupo S. anginosus» identificado por el ensayo BC-GP se define como «correctamente identificado» para cada especie. Identificado como S. pneumoniae. Cultivo polimicrobiano con S. epidermidis resistente a la meticilina. Cultivo polimicrobiano con Escherichia coli. |
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| Identificado a nivel de género, pero no a nivel de especie. El «grupo S. anginosus» identificado por el ensayo BC-GP se define como «correctamente identificado» para cada especie. Cultivo polimicrobiano con S. epidermidis. |
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BC-GP informa de la presencia de mecA sólo para S. aureus y S. epidermidis. En este estudio, de las 102 cepas estafilocócicas, 72 eran S. aureus o S. epidermidis. Los resultados discordantes se debieron a organismos mecA S. epidermidis no detectables en cultivos polimicrobianos que contenían tanto S. epidermidis mecA positivo como mecA negativo. De las 30 especies de Staphylococcus distintas de S. epidermidis y S. aureus, 21 (70%) fueron positivas para mecA, incluidas 2 S. lugdunensis, que no pudieron ser notificadas como positivas para mecA por BC-GP.
La tabla 3 muestra la diferencia de tiempo entre la generación de los resultados de BC-GP y la identificación final basada en cultivos y los resultados de susceptibilidad antimicrobiana en ambos hospitales. Los resultados de la BC-GP estuvieron disponibles en una media de 28,2 a 51,0 horas antes de la identificación final basada en cultivos y los resultados de susceptibilidad en el TH. En el SHI, la BC-GP generó resultados una media de 34,5 a 196,6 horas antes. Al comparar el tiempo hasta la identificación final basada en el cultivo y los resultados de susceptibilidad en TH y SHI, con la excepción de S. aureus, los resultados para S. epidermidis y estafilococos coagulasa-negativos distintos de S. epidermidis, enterococos y estreptococos requirieron un tiempo significativamente () mayor en SHI (83,3, 123,6, 159,1 y 199,1 horas, respectivamente) en comparación con TH (40,8, 53,9, 36,1 y 53,5 horas, respectivamente).
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| La diferencia de tiempo entre el resultado de la BC-GP y los resultados finales de identificación y susceptibilidad basados en cultivos. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Usando cultivos de sangre Gram-positivos simulados, BC-GP identificó correctamente 198/208 (95%) de los organismos (Tabla 4). Seis estreptococos (3%) fueron identificados incorrectamente o sólo a nivel de género por BC-GP. Con respecto a los 4 frascos de hemocultivo falsos negativos por BC-GP, 1 S. pyogenes fue correctamente identificado y 1 S. mitis generó una señal positiva del género Streptococcus/S. pneumoniae tras una dilución de 11 veces del medio de hemocultivo. El gen mecA se detectó en 20/20 (100%) organismos de SARM que representaban cepas adquiridas en la comunidad (SCCmec tipo IIa, IV y V) y asociadas a la asistencia sanitaria (SCCmec tipo I, IIb, III y no tipable) mediante BC-GP. BC-GP detectó 14/14 (100%) genes vanA y 20/20 (100%) genes vanB en cepas VRE bien caracterizadas de estudios anteriores en Japón.
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| No se detectó inicialmente, pero positivo con una muestra de hemocultivo diluida 11 veces. Streptococcus sp. perteneciente al grupo S. anginosus se identifica como S. anginosus por BC-GP. Señal positiva para Streptococcus, pero sin señal para el grupo S. anginosus. Señal positiva para Streptococcus, pero sin señal para S. pneumoniae. Mis identificados como S. pneumoniae. |
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4. Discusión
El rendimiento de BC-GP observado en nuestro estudio fue similar al de informes anteriores . Dado que los servicios de microbiología clínica están subcontratados o no funcionan durante los turnos libres durante los días laborables y están cerrados los fines de semana y los días festivos en muchos hospitales de Japón, las pruebas de diagnóstico rápido tienen un potencial significativo para impactar en la atención al paciente al disminuir drásticamente el tiempo para la identificación del organismo y los resultados de susceptibilidad antimicrobiana.
El BC-GP detecta mecA en todos los estafilococos basándose en la medición de la intensidad de la señal; sin embargo, la notificación está restringida a S. aureus y S. epidermidis basándose en un algoritmo en el que sólo se notifica mecA cuando S. aureus o S. epidermidis es detectado por el BC-GP. Las futuras versiones de BC-GP deberían considerar la modificación del algoritmo para permitir la notificación de la detección de mecA para estafilococos distintos de S. aureus o S. epidermidis, ya que el 70% de las 30 cepas que no eran de S. aureus ni de S. epidermidis en nuestro estudio eran resistentes a la meticilina. Aunque S. epidermidis es el principal patógeno estafilocócico coagulasa-negativo, otros estafilococos como S. lugdunensis y S. haemolyticus son patógenos importantes en el entorno sanitario.
Los hemocultivos positivos a los polimicrobianos generaron la mayor parte de la discordancia. En cambio, el rendimiento del BC-GP fue de 121/124 (98%) en los hemocultivos clínicos monomicrobianos y de 198/208 (95%) en los hemocultivos simulados. En este estudio, los hemocultivos polimicrobianos representaron 14/106 (13%) y 3/33 (9%), respectivamente, de los hemocultivos positivos en TH y SH. En conjunto, los cultivos polimicrobianos representaron 17/139 (12%) de los hemocultivos clínicos prospectivos, lo que coincide con estudios anteriores que informan de que entre el 6 y el 20% de todas las infecciones del torrente sanguíneo son polimicrobianas. El BC-GP identificó correctamente todos los organismos en 12/17 (70%) de los cultivos polimicrobianos. En estudios anteriores de BC-GP, las tasas de identificación correcta en cultivos polimicrobianos oscilaron entre el 57 y el 86% . Dado que la información errónea puede afectar al diagnóstico clínico, dando lugar a una selección inadecuada de agentes antimicrobianos, es necesario comprender las limitaciones de BC-GP.
Una preocupación adicional con los cultivos polimicrobianos es la interpretación clínica de la detección de mecA y estafilococos. En nuestros 17 cultivos polimicrobianos, 5 muestras arrojaron 2 o 3 cepas estafilocócicas con o sin mecA. Esto puede llevar a un uso innecesario de vancomicina o a subestimar la infección causada por estafilococos resistentes a la meticilina. La repetición del BC-GP en otra serie de hemocultivos puede disminuir el riesgo de este problema. En el caso de los cultivos monomicrobianos o de los cultivos simulados, todas las discrepancias se observaron con los estreptococos, excepto con una cepa de S. caprae. La identificación errónea de BC-GP para los estreptococos incluyó 2 S. mitis identificados como S. pneumoniae, la no detección de 2 S. pneumoniae, 2 S. anginosus group y 2 S. pyogenes. En informes anteriores también se han comunicado resultados similares para S. mitis, S. oralis y S. pneumoniae. Dado que el parentesco genético entre S. mitis, S. oralis y S. pneumoniae es bien conocido sobre la base de una homología del >99% de las secuencias del gen del ARNr 16S, los resultados de BC-GP para S. pneumoniae o Streptococcus con hemólisis alfa sin ninguna señal positiva específica de la especie deben interpretarse cuidadosamente y confirmarse mediante métodos convencionales como la sensibilidad a la optoquina o la prueba de solubilidad biliar. Es interesante que una dilución de 11 veces del medio de cultivo de sangre original puede conducir a la detección de la señal de Streptococcus y de la señal de la especie (Tabla 4). Se ha informado de un rango de detección según el organismo por BC-GP.
El mayor beneficio de utilizar BC-GP es el tiempo más temprano para informar de la identificación y los determinantes de resistencia de los hemocultivos positivos, lo que permite una selección más temprana de la terapia antimicrobiana apropiada y la implementación de medidas de control de la infección como el aislamiento y la precaución de contacto . Esto puede tener un impacto significativo en el sistema sanitario japonés. La diferencia de tiempo entre los resultados de la BC-GP y los resultados finales de identificación y susceptibilidad basados en cultivos que se muestran en la tabla 3 en TH es coherente con informes anteriores . Por otro lado, los resultados anteriores de 80,7 a 196,6 horas para organismos distintos de S. aureus utilizando BC-GP en el SHI reflejan la falta de disponibilidad de los servicios de microbiología clínica durante los fines de semana y las vacaciones. Dado que los servicios de microbiología clínica se subcontratan en muchos hospitales de Japón o se limitan a un turno durante los días laborables o no se ofrecen durante los fines de semana, la posible relación coste-beneficio de mantener los servicios de hemocultivos en los hospitales es significativa. Además, la formación del personal de laboratorio en el laboratorio general para reconocer los cocos y bacilos Gram-positivos permitirá realizar las pruebas BC-GP durante el fin de semana, así como por las tardes/noches. El BC-GP ofrece la oportunidad de que los hospitales mantengan en sus instalaciones un servicio de laboratorio muy crítico.
En conclusión, el BC-GP proporcionó una identificación y detección precisas de los marcadores de resistencia en comparación con los métodos rutinarios de laboratorio basados en el cultivo para los organismos Gram-positivos, incluyendo las cepas CA-MRSA, HA-MRSA y VRE que circulan en Japón. Minimizar el tiempo de optimización de la terapia antimicrobiana mediante el uso de BC-GP puede contribuir a reducir los costes y mejorar la atención al paciente. En 2016, BC-GP recibió la aprobación regulatoria en Japón convirtiéndose en la primera prueba molecular multiobjetivo para cultivos de sangre positivos aprobada como dispositivo de diagnóstico in vitro para ayudar en el diagnóstico de infecciones bacterianas del torrente sanguíneo. Serán necesarios estudios adicionales para validar la rentabilidad de BC-GP en el contexto del sistema de prestación de asistencia sanitaria japonés.
Aprobación ética
Este estudio fue aprobado por las juntas de revisión internas de TH y SHI.
Intereses contrapuestos
Todos los autores declaran no tener intereses contrapuestos.
Contribuciones de los autores
Ken Kikuchi diseñó y realizó el estudio y redactó el manuscrito. Mari Matsuda, Shigekazu Iguchi, Tomonori Mizutani, Kaori Sansaka, Kenta Negishi, Kimie Shimada, Shigeyuki Notake, Hideji Yanagisawa y Reiko Yabusaki realizaron los trabajos de laboratorio. Keiichi Hiramatsu, Michiru Tega-Ishii, Jun Umemura, Hiroshi Takahashi, Hideki Araoka y Akiko Yoneyama supervisaron la recogida de datos y coordinaron y participaron en el diseño del estudio.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado, en parte, por una subvención (S0991013) del Ministerio de Educación, Cultura, Deporte, Ciencia y Tecnología de Japón (MEXT), para la Fundación de Proyectos de Investigación Estratégica en Universidades Privadas.