El establecimiento de sistemas de transformación genética ha permitido a los científicos transformar ADN extraño en hongos filamentosos y obtener así las cepas deseadas para fines industriales. Ahora podemos aprovechar al máximo el poder de secreción superior de los hongos y su excelente eficacia en la fabricación de metabolitos valiosos.

Transformación mediada por protoplastos (PMT)

La PMT es el método de transformación fúngica más utilizado, que se basa en un gran número de protoplastos fúngicos competentes. El principio consiste en utilizar algunas enzimas disponibles en el mercado para eliminar los componentes complejos de la pared celular de los hongos para generar protoplastos. Posteriormente, se utilizan algunos reactivos químicos (como el PEG) para promover la fusión de los ácidos nucleicos exógenos y los protoplastos, como se describe con más detalle a continuación. Los componentes de la pared celular del hongo son muy variables entre las distintas cepas. Incluso los componentes de la cubierta de la espora son significativamente diferentes de los de las hifas de la misma cepa. Por lo tanto, no existe un método de transformación universal que pueda aplicarse a diferentes cepas de hongos. La preparación de protoplastos apenas puede estandarizarse. Parte de las dificultades provienen de nuestro limitado conocimiento de las hidrolasas de la pared celular. El desarrollo de un método PMT optimizado para los hongos todavía requiere un esfuerzo significativo.

PMT es un método de transformación utilizado de forma rutinaria. El método ha sido objeto de constantes mejoras para lograr una mayor eficiencia en la transformación genética y para dirigir los loci genéticos adecuados mediante la edición de genes. La preparación de protoplastos requiere la eliminación de la pared celular, lo que se consigue principalmente mediante un tratamiento enzimático. También se han descrito métodos no enzimáticos para preparar protoplastos, como los métodos físicos que incluyen la molienda y el choque de ondas supersónicas. Sin embargo, no se utilizan ampliamente debido a los inconvenientes prácticos y al bajo rendimiento de los protoplastos. En la Tabla 1 se ofrece un resumen de los protocolos de transformación mediada por protoplastos para diferentes especies de hongos.

Pasos básicos del método PMT

El PMT se aplicó por primera vez a Saccharomyces cerevisiae. Los investigadores prepararon protoplastos con la caracolasa comercial y utilizaron sorbitol para conservar los protoplastos. Posteriormente, dicho método se aplicó a hongos filamentosos, como Neurospora crassa , y A. nidulans . Aunque los métodos de transformación se han mejorado, los pasos básicos siguen siendo esencialmente los mismos. Los pasos básicos del método PMT se proporcionan en la Fig. 1.

Pasos básicos de la transformación mediada por protoplastos

Preparación de los protoplastos

El primer paso en la preparación de protoplastos es la eliminación de la pared celular mediante digestión enzimática. La pared celular de los hongos está compuesta por glucano, manano y quitina. La estructura de la pared celular fúngica es muy dinámica, y la pared celular varía durante la división celular y el crecimiento de los hongos, así como en la germinación de las esporas, la ramificación de las hifas y la formación del diafragma. Los componentes de la pared celular también son diferentes en las distintas especies de hongos, por lo que deben utilizarse varias enzimas en combinación. Se ha informado de que la selección de una mezcla de enzimas adecuada es un factor clave en la preparación de protoplastos.

En general, las hifas son sensibles a una enzima adecuada que hidrolice su pared celular durante la fase logarítmica. En el procedimiento PMT de Neurospora, los protoplastos se preparan hidrolizando las hifas recién nacidas (cultivo durante 4-6 h a 25-30 °C) . Del mismo modo, los protoplastos también pueden prepararse con conidiosporas. Por ejemplo, para Aspergillus y Penicillium, se pueden elegir esporas germinales o talos.

Los protoplastos son sensibles a la presión osmótica, se debe tener cuidado de mantener una presión osmótica estable para mantener los protoplastos intactos durante la enzimólisis de las paredes celulares. Por lo tanto, deben incluirse estabilizadores osmóticos (como el sorbitol, el cloruro de sodio y el cloruro de potasio) en todos los tampones para la preparación de protoplastos a fin de evitar la ruptura de las células. Por ejemplo, en la preparación de protoplastos de N. crassa , Aspergillus sp. y Trichoderma sp. se utiliza una solución de sorbitol con una concentración de 0,8-1,2 M para mantener la estabilidad osmótica de los protoplastos. Un resumen de los parámetros de preparación de protoplastos para algunas especies de hongos comunes se proporciona en la Tabla 2.

Captación de ADN exógeno

La solución utilizada para suspender los protoplastos suele contener iones de calcio y estabilizadores osmóticos. Se cree que el calcio abre canales en la citomembrana, lo que facilita la entrada del ADN exógeno en la célula, mientras que los estabilizadores osmóticos son necesarios para mantener la morfología de los protoplastos. Normalmente, se añade cierta cantidad de polietilenglicol (PEG) junto con el ADN purificado (que puede ser el ADN circular de doble cadena o el ADN linealizado). El PEG es un promotor de la fusión celular comúnmente utilizado. Puede formar el puente molecular entre las células o entre la citomembrana y el ADN, y así promover la adhesión. Además, también puede inducir cargas desordenadas en la superficie de la citomembrana, alterar la permeabilidad de la membrana y facilitar la entrada de ácidos nucleicos exógenos en las células.

El PEG es un agente crucial que mejora la eficiencia de la transformación. La baja eficiencia de transformación en la mayoría de los casos puede mejorarse añadiendo más PEG. En condiciones normales, el rendimiento del PEG de bajo peso molecular (como el PEG3000) es superior al del PEG de alto peso molecular (como el PEG8000). Sin embargo, esto debe ser optimizado para varias especies.

La eficiencia de la transformación también está influenciada por la temperatura. En general, la mezcla de ADN y protoplastos debe colocarse en hielo durante 15-30 minutos, para que el ADN pueda adherirse a la superficie de los protoplastos.

Regeneración de protoplastos

Para garantizar una buena recuperación de protoplastos viables, se deja que los protoplastos se recuperen en la placa sin presión de selección durante un tiempo determinado antes de transferirlos a una placa selectiva. Se debe incluir un estabilizador osmótico en el cultivo de regeneración. La presión osmótica estable es el factor clave para que los protoplastos regeneren la pared celular. Sólo los protoplastos que llevan ácidos nucleicos exógenos pueden crecer en el medio selectivo.

Comentarios sobre el método PMT

El método de transformación de protoplastos es simple y eficaz sin necesidad de equipos costosos. Pero el protocolo implica muchos pasos y reactivos críticos. Cada paso debe ser optimizado y la calidad de los reactivos debe ser probada críticamente. El estado de crecimiento de los hongos que se transforman debe controlarse cuidadosamente. La experiencia es crítica para la implementación exitosa de este método.

Transformación mediada por Agrobacterium (AMT)

Agrobacterium es una bacteria Gram-negativa que se encuentra comúnmente en el suelo. Agrobacterium tumefaciens puede infectar plantas lesionadas. El plásmido inductor de tumores de > 200 kb, que también se denomina plásmido Ti, pudo aislarse en la fase inicial de la infección. Cuando A. tumefaciens infecta una planta, entra en ella a través de la herida e integra parte del plásmido Ti en el genoma de las células vegetales infectadas. El fragmento de ADN integrado del plásmido Ti se denomina comúnmente ADN de transferencia o ADN-T. El ADN-T se inserta en el genoma de la planta de forma aleatoria como monoclonal. El ADN-T está flanqueado por dos repeticiones imperfectas direccionales (denominadas borde izquierdo y derecho) y contiene genes que codifican enzimas responsables de la formación de hormonas vegetales, que provocan el crecimiento del tumor . Se diseñó un vector binario con el gen objetivo insertado entre los bordes izquierdo y derecho del ADN-T, y el plásmido recombinante se transformó en el Agrobacterium tumefaciens. El clon positivo de Agrobacterium se utilizó como vehículo para integrar el gen diana en el genoma del hongo. Los pasos específicos se discutirán en detalle más adelante.

El método AMT ha demostrado ser más estable y eficiente que los métodos de transformación convencionales desde el primer artículo en el que se informó de que este método podía aplicarse a la transformación de hongos. El método AMT se aplicó por primera vez para transformar S. cerevisiae . Un plásmido que porta un gen de resistencia a la higromicina se utiliza habitualmente para transformar Aspergillus awamori . El método AMT se ha aplicado a muchos Ascomycetes, incluyendo el Aspergillus , y el Monascus purpureus . Los pasos básicos del método AMT se muestran en la Fig. 2. Un resumen del protocolo de transformación mediada por Agrobacterium para diferentes especies de hongos se proporciona en la Tabla 3.

Los pasos básicos de la transformación mediada por Agrobacterium

Factores que influyen en la eficiencia de la TMA

Muchos factores afectan a la eficiencia de la TMA, incluyendo el tipo de material fúngico de partida (protoplasto, espora, hifa y tejido del cuerpo del fruto), la concentración de la acetosiringona, la proporción entre el hongo y el Agrobacterium y las condiciones de cocultivo.

1. El tipo de material fúngico de partida El método AMT puede utilizar los protoplastos, las esporas, las hifas y el tejido del cuerpo del fruto de los hongos como recipiente. Deben seleccionarse los materiales de partida apropiados para las diferentes cepas. Por ejemplo, el método AMT sólo funciona para los protoplastos de Rhizopus. oryzae y Mucor circinelloides, mientras que las esporas o las esporas germinales no producirían transformantes.

2. La concentración de acetosiringona (AS) AS actúa en dos etapas durante el proceso AMT. Una es el proceso de inducción y la otra es el proceso de transformación. La AS se utiliza generalmente para inducir la expresión del dominio Vir del ADN-T, y el gen del dominio Vir activa la transferencia del ADN-T. Numerosos estudios han demostrado que es necesaria una cantidad adecuada de AS durante el proceso de transformación. Sin embargo, la adición de AS no es absolutamente necesaria durante la etapa de precultivo de Agrobacterium, lo que podría reducir la eficiencia de transformación para algunas cepas. La concentración de AS es un factor importante que afecta a la eficiencia de transformación durante el proceso de co-cultivo del hongo-Agrobacterium en el AMT de Aspergillus awamori .

3. La proporción entre hongos y Agrobacterium Dentro de ciertos límites, la eficiencia de transformación alcanzará el nivel máximo con el aumento de la cantidad de hongo o Agrobacterium. Debe determinarse empíricamente una proporción óptima de AMT para diferentes hongos. La proporción entre las células fúngicas y las bacterianas debe optimizarse para los diferentes sistemas de transformación hongo-Agrobacterium.

4. Las condiciones de co-cultivo Las condiciones de co-cultivo son un factor importante en el método AMT. Esto incluye el tiempo de cultivo, la temperatura, el pH y la selección del filtro. La temperatura y el tiempo de cocultivo son los factores clave entre los pasos del AMT. En la transformación hongo-Agrobacterium, una condición adecuada para comenzar es una temperatura de 20-28 °C y un tiempo de cocultivo de 16-96 h. Una temperatura más baja (20-25 °C) suele ser beneficiosa para el método AMT. El filtro, que es hidrófilo y sirve de soporte para el cocultivo hongo-Agrobacterium, facilita la transferencia de colonias individuales a la placa de cribado. Como filtro puede utilizarse una membrana de nitrocelulosa, una membrana de nylon, papel de filtro, celofán y una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF).

Comentarios sobre la transformación mediada por Agrobacterium

El método AMT abre una nueva vía para aquellos hongos recalcitrantes a la transformación por métodos convencionales. El método AMT es especialmente adecuado para generar mutaciones knock-in en hongos porque el ADN-T se inserta aleatoriamente en el genoma como una sola copia. Además, el método AMT puede lograr una alta eficiencia de recombinación homóloga en varios experimentos de selección de genes.

Las principales ventajas del método AMT incluyen: en primer lugar, la diversificación de los receptores de transformación, incluyendo protoplastos, hifas y esporas; en segundo lugar, la capacidad de integrar genes exógenos en el genoma para formar transformantes estables; y en tercer lugar, la alta eficiencia de transformación que resulta en un gran número de transformantes.

El método AMT requiere vectores binarios, que son tediosos de preparar. Es necesario tener en cuenta múltiples factores en la optimización del proceso de transformación. Esta es una de las principales limitaciones del método AMT.

Transformación por electroporación

La electroporación es un método de transformación simple, rápido y eficiente para hongos filamentosos. En la electroporación, las cargas eléctricas se almacenan en un condensador para construir un alto voltaje, la muestra es golpeada por el voltaje de impulso, y el ácido nucleico exógeno puede ser transferido instantáneamente a las células. Por lo general, en la transformación de los hongos se utilizan ondas cuadradas u ondas de decaimiento exponencial. Los impulsos de decaimiento exponencial se generan simplemente cargando y descargando un condensador. El campo eléctrico disminuye exponencialmente desde el valor máximo. Una onda cuadrada es una forma de onda periódica no sinusoidal (que puede representarse como una suma infinita de ondas sinusoidales), en la que la amplitud alterna con una frecuencia constante entre valores mínimos y máximos fijos. Se utilizan diferentes formas de onda de electroporación para diferentes especies. En la Tabla 4 se ofrece un resumen de las formas de onda utilizadas en la electroporación para diferentes especies.

Cuando una célula se expone al campo eléctrico, la estructura de la citomembrana se modificará con un voltaje inducido entre la citomembrana. Se pueden formar microporos en la citomembrana tras la descarga eléctrica. La permeabilidad inducida de la pared celular es reversible dentro de los umbrales del voltaje y la duración, de lo contrario, causará lesiones irreversibles a las células. Por lo tanto, los microporos de la citomembrana parecen tener dos patrones tras la descarga eléctrica, el reversible y el irreversible. Las moléculas de lípidos y proteínas de la citomembrana pueden restaurar la estructura original cuando se aplica una intensidad de campo adecuada, mientras que la descarga eléctrica irreversible dará lugar a la irreparabilidad o a una recuperación extremadamente lenta, lo que finalmente conduce a la muerte celular . El ADN exógeno puede transferirse a la bacteria, al protoplasto de la planta, a la célula animal y a los hongos filamentosos mediante la electroporación. Este método se ha aplicado con éxito a múltiples hongos. Ozeki et al. descubrieron que las esporas germinales son más susceptibles de ser transformadas por electroporación . En los últimos años, la electroporación se ha convertido en un método fiable para la transformación genética de algunas cepas comunes . En la Tabla 5 se ofrece un resumen de los protocolos de transformación mediada por electroporación para diferentes especies de hongos.

Factores que influyen en la transformación por electroporación

Parámetros de electroporación

1. Intensidad del campo eléctrico La intensidad del campo eléctrico es el factor más importante que influye en la eficiencia de la electroporación. Cuando la intensidad del campo eléctrico aplicado alcanza la magnitud de kV/cm y el ancho de pulso de la escala de μs-ms, la citomembrana se modificará y se generarán muchos microporos en las paredes celulares . Una alta intensidad de campo eléctrico se asocia con una alta tasa de captación de ácidos nucleicos exógenos y una menor tasa de supervivencia celular. Sin embargo, varios tipos de células requieren diferentes intensidades de campo eléctrico debido a las diferencias en los componentes de la citomembrana . Se forman pocos microporos cuando la intensidad del campo eléctrico no supera el umbral requerido. Por el contrario, una intensidad de campo eléctrico excesiva provocará daños irreversibles en la citomembrana, lo que conducirá a la muerte de la célula.

2. Capacitancia Durante el proceso de electroporación, la variación de las cargas eléctricas y la intensidad del campo eléctrico aplicado a la suspensión celular dependen de la capacitancia y de la duración del pulso. La intensidad y la duración del pulso también están influenciadas por la capacitancia, por lo tanto, una mayor capacitancia tiene mejores efectos de transformación .

3. Duración y frecuencia del pulso La duración de la perforación en la citomembrana, que está directamente relacionada con la eficiencia de transformación de la electroporación, está influenciada por la duración y la frecuencia del pulso .

Entorno de electroporación y factores externos

1. Solución tampón La solución tampón proporciona un entorno importante para la electroporación de las células, y el valor del pH de la solución tampón de choque eléctrico es de gran importancia. Normalmente, se utiliza un tampón de pH 7,0. Las células se pinchan y mueren fácilmente con un pH superior a 7,0 .

2. Temperatura Durante el proceso de electroporación se produce una gran cantidad de calor, que se liberará en la solución tampón. Por lo tanto, se recomienda una temperatura reducida (0-4 °C) para obtener un mejor efecto . Además, el baño con hielo de la mezcla previa al choque eléctrico también puede mejorar la eficiencia del choque eléctrico.

3. Concentración del ácido nucleico exógeno En general, la eficiencia de la electroporación aumenta con la concentración del ácido nucleico exógeno. El ADN compacto en forma de superhélice entra más fácilmente en las células a través de la citomembrana. En 1995, un estudio informó de que cada 1 μg de ADN plasmídico podía generar 100 transformantes para A. niger .

Comentarios sobre el método de electroporación

El método de electroporación se ha aplicado ampliamente a numerosos tipos de células, incluyendo procariotas y eucariotas. Esta tecnología tiene el potencial de ser el método de elección para la transformación de especies fúngicas inexploradas. En comparación con el método PMT, que implica pasos complicados, la electroporación es simple y más conveniente. Sin embargo, el mecanismo de la electroporación sigue sin estar claro. La tasa de perforación de la citomembrana depende de muchos parámetros del campo eléctrico. Además, requiere unas condiciones de amortiguación adecuadas para ser óptima.

Transformación biológica

La transformación biológica también se conoce como bombardeo de partículas. Su principio es que el ADN extraño se adsorbe en la superficie de partículas de tungsteno u oro. Bajo el empuje de una alta presión, las partículas se inyectan en las células huésped. El bombardeo de partículas puede realizar transformaciones tanto estables como transitorias.

Varios factores afectan a la eficacia del bombardeo en patrones de interacciones complejas . Los parámetros biológicos (tipo de célula, condiciones de crecimiento y densidad celular) y los ajustes instrumentales (tipo y tamaño de las partículas, nivel de vacío y presión, distancia del objetivo) son variables importantes.

El bombardeo de partículas es el más potente entre todos los métodos de transformación genética. No está sujeto a las limitaciones de los tipos de células del huésped o de las especies. En el caso de los hongos, el bombardeo de partículas es suficientemente eficaz para aquellos organismos que son difíciles de cultivar o de los que es difícil preparar protoplastos. El bombardeo de partículas es fácil y cómodo de manejar. Sin embargo, los instrumentos y consumibles para el bombardeo de partículas son caros. Sólo se considerará en el caso de que otros métodos no funcionen. En la actualidad, el bombardeo de partículas se ha utilizado para transformar con éxito A. nidulans y T. reesei, etc.

Transformación mediada por ondas de choque (SWMT)

SWMT utiliza el principio de transformación y transmisión de energía para generar una perturbación transitoria de la presión y una fuerza de torsión a través de las células para formar un efecto de cavitación transitoria. Este método se ha aplicado en tratamientos médicos como la ortopedia y la trituración de cálculos renales . El SWMT cambia la permeabilidad de las membranas celulares a través de la cavitación acústica, lo que resulta en la captación de ácido nucleico exógeno en las células. El método se ha utilizado con éxito en la introducción de ácido nucleico exógeno en Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa y Salmonella typhimurium . En 2013, Denis Magaña-Ortíz et al. informaron por primera vez de la aplicación de SWMT para hongos, incluyendo A. niger, Fusarium oxysporum y Phanerochaete chrysosporium . En este artículo, se observaron tres ventajas del método SWMT. En primer lugar, en comparación con los métodos de transformación convencionales, este método es capaz de actuar directamente sobre las esporas, pero no sobre los protoplastos. En segundo lugar, los parámetros físicos eran fácilmente controlables, sólo había que controlar con precisión el número de esporas, la energía y la velocidad de la onda de choque. En tercer lugar, la eficacia de la transformación fue excelente. Los resultados de Denis Magaña-Ortíz et al. indicaron que, en comparación con el método de transformación con Agrobacterium, el método SWMT podía mejorar la eficiencia de transformación en 5400 veces para A. niger .

Pero también fueron notables algunas limitaciones en este método de transformación. Dado que una gran proporción de ADN se daña en el tratamiento con ondas de choque, la eficiencia de transformación determinada por la proporción de ADN en las células era bastante baja . Sin embargo, para el número de células involucradas, la eficiencia de transformación era significativamente mayor . Para evaluar la eficiencia, hay que considerar dos aspectos: la cantidad de ADN y el número de células. Por ejemplo, en el experimento realizado por Magana-Ortiz et al. , en general, el ADN plasmídico utilizado en la transformación de protoplastos y la electroporación es de aproximadamente 1-10 μg . Es caro e inconveniente producir una cantidad tan grande de plásmido en el laboratorio para el método SWMT. Además, las fuentes e instrumentos de ondas de choque son caros porque están diseñados principalmente para fines médicos. Esto resulta ser un obstáculo importante para adoptar este método en un laboratorio de microbiología con recursos limitados.