Resultados y discusión

Nuestro novedoso método AMHS se ve facilitado por la estructura anatómica/funcional del sistema circulatorio de las abejas. La circulación es forzada por la contracción pulsatoria de los diafragmas dorsal y ventral, que bombean la hemolinfa hacia el corazón. A continuación, la aorta transporta la hemolinfa a la cabeza (Fig. 1F), suministrando hemolinfa al cerebro y a las antenas de la abeja.

En comparación con el TCHS, el AMHS permitió la recogida de 80-100 μL de hemolinfa estéril en un tiempo más corto y de un menor número de individuos, lo que minimiza el riesgo de melanización. Creemos que durante la recogida de hemolinfa, es importante minimizar el tiempo de su contacto con el aire. El riesgo de melanización se reduce con un tiempo de recogida más corto y una progresión más rápida a la etapa de enfriamiento. Además de la reducción del tiempo de recogida, el menor uso de insectos es otra ventaja sustancial de la AMHS sobre la TCHS. La investigación sobre las ápidas debe diseñarse siempre para minimizar el número de abejas que deben ser dañadas. El uso de la SAM para reducir el número de abejas necesarias para recoger un volumen de hemolinfa requerido es coherente con los principios rectores para un uso más ético de los animales en la investigación.

Nuestros resultados actuales también mostraron que el mayor tamaño de los insectos se asoció con un muestreo de hemolinfa más fácil y más rápido, y con mayores volúmenes de hemolinfa recogida (Tabla 1). El muestreo de la hemolinfa de las obreras de Apis mellifera carnica y Apis cerana requirió más tiempo y más insectos que el muestreo de la hemolinfa de los abejorros, ya que las primeras especies son considerablemente más pequeñas y tienen menos hemolinfa.

La hemolinfa se adquiere con mayor frecuencia con capilares utilizando diversos métodos, por ejemplo, mediante la punción del corazón, del seno torácico dorsal o ventral, o de la aorta dorsal . Cada uno de estos procedimientos conlleva el riesgo de que se perfore el ventrículo, lo que provocaría la contaminación de la muestra con el contenido del intestino. Dicha contaminación no sólo hace que la muestra sea inutilizable, sino que también requiere que el capilar se sustituya por uno nuevo o se limpie y desinfecte antes del siguiente uso, aumentando así el tiempo total de recogida de la hemolinfa. La esterilidad de la hemolinfa también puede verse comprometida por la perforación de la membrana que conecta los segmentos del abdomen. El uso del AMHS elimina estos problemas relacionados con los capilares. Además, la recogida de hemolinfa por decapitación puede contaminar la hemolinfa con el néctar que sale del estómago de la abeja. Nuestra novedosa AMHS dio lugar a muestras de hemolinfa de alta calidad biológica. Los hemocitos eran claramente visibles en cada una de las muestras de hemolinfa obtenidas por AMHS (Fig. 1C). El análisis de cada portaobjetos reveló que las muestras de hemolinfa obtenidas por AMHS eran puras y transparentes, sin contaminación (por ejemplo, granos de polen).

Esperábamos que en la realización de la AMHS, la desinfección con etanol y el contacto limitado entre la gota de hemolinfa y el cuerpo de la abeja asegurarían la esterilidad de la muestra. Esta expectativa fue confirmada por los ensayos microbiológicos. La incubación de la hemolinfa adquirida por la SSMA en los medios de agar MRS y Sabouraud confirmó la esterilidad de la hemolinfa. No se observó el crecimiento de microorganismos en ninguna de las 100 gotas de hemolinfa sembradas. Por lo tanto, no se presentan aquí resultados cuantitativos. Tras finalizar el periodo de incubación, sólo observamos círculos de color marrón oscuro de hemolinfa melanizada alrededor de cada gota. Esta melanización se produjo durante el periodo de incubación, no durante la toma de muestras (Fig 1D y 1E). En particular, cuando la hemolinfa recogida no se va a utilizar para pruebas microbiológicas, se puede omitir el paso de desinfección. Es posible que el etanol aplicado en la zona antenal pueda afectar a las actividades enzimáticas u hormonales.

Otros factores, además de la metodología, pueden influir en la eficacia de la recogida de la hemolinfa. En nuestros estudios anteriores, observamos que la cantidad de hemolinfa recogida de una abeja no sólo depende de la casta y la edad de la abeja, sino también de su grado de hidratación, medido en función del volumen de néctar o jarabe de azúcar consumido antes de la toma de muestras de hemolinfa. Ptaszyńska et al. informan de que el muestreo de los volúmenes adecuados de hemolinfa es menos eficaz en las abejas más viejas. Además, la eficacia del muestreo puede depender de las habilidades del investigador en el laboratorio. Estos factores dificultan la comparación de las características cuantitativas de los diferentes protocolos de muestreo de la hemolinfa entre los estudios realizados en diferentes laboratorios y con diferentes organismos. En particular, en nuestras investigaciones anteriores, hemos tomado muestras de la hemolinfa de miles de abejas utilizando la AMHS, así como otros métodos, incluido el TCHS . El personal de nuestro laboratorio tiene una gran experiencia en la recogida de hemolinfa de abejas de diferentes edades y castas. Esta experiencia nos ayudó a comparar los diferentes métodos de muestreo, ya que nuestros resultados no se vieron afectados por los errores debidos a las habilidades variables del personal del laboratorio. Nuestros resultados actuales indicaron que el AMHS era un método eficiente, limpio y muy preciso (Tabla 1) que consumía menos tiempo que el TCHS.

El muestreo de hemolinfa con métodos distintos al AMHS suele requerir equipo adicional, como tubos microcapilares. Además, la extracción de la hemolinfa de los tubos microcapilares requiere el uso de una bomba especial, o bien aplastar los tubos y centrifugarlos con perlas. Otra ventaja de la AMHS es la posibilidad de utilizar una escala de pipeta para medir el volumen de hemolinfa recogido de una sola abeja. Esto es especialmente útil cuando se realizan análisis bioquímicos de micromuestras, por ejemplo, para determinar las actividades enzimáticas . Cabe señalar que, cuando se aplican métodos distintos del AMHS, el volumen de la hemolinfa pura puede calcularse indirectamente, basándose en el volumen del diluyente de la hemolinfa en un tubo antes del muestreo y el volumen medido del diluyente de la hemolinfa después del muestreo. Sin embargo, este método puede conducir a un error adicional; por lo tanto, algunos investigadores utilizan jeringas Hamilton . El AMHS evita el gasto y el trabajo adicional (por ejemplo, la desobstrucción de la jeringa, la desinfección, etc.) que supone el uso de jeringas Hamilton.

El método de Mayack y Naug (la hemolinfa se adquiere haciendo girar a las abejas con las antenas recortadas) es similar al AMHS. Sin embargo, su método requiere una centrifugadora de laboratorio, y las partes de la boca de las abejas tuvieron que ser pegadas para evitar cualquier posible contaminación. Además, en su estudio, diseccionaron las tripas de los apios para evaluar la infección por Nosema ceranae antes de centrifugar las abejas. Sin este paso, las tripas serían una fuente probable de contaminación. Su método consiste en colocar las abejas en tubos de centrífuga y hacerlas girar a 16.000 FCR durante 30 s para obtener la hemolinfa. Este proceso podría estratificar los componentes de la hemolinfa (por ejemplo, proteínas y hemocitos) y conlleva mayores riesgos de contaminación microbiológica y de melanización de la hemolinfa (véase la discusión anterior). Aunque puede ser ideal para analizar los niveles de azúcar en la hemolinfa de las abejas melíferas a las que se les ha extraído previamente el intestino (como en su estudio), no es del todo apropiado para los estudios microbiológicos y genéticos o para las investigaciones de las actividades enzimáticas. En este contexto, nuestro nuevo método AMHS es más adecuado para el uso general, ya que es fácil y simple, y probablemente aplicable en una amplia gama de diferentes tipos de estudios.