1 Introduction

Il campo delle neuroscienze comportamentali è progredito immensamente nell’ultimo secolo e comprende lo sviluppo di metodologie e strumenti scientifici per sondare vari aspetti della cognizione. Il “one-trial object recognition test” eseguito per la prima volta da Ennaceur e Delacour nel 1988 è diventato un modello ampiamente accettato per indagare non solo la memoria di riconoscimento degli oggetti ma anche la memoria di lavoro, l’attenzione, l’ansia, la neofobia e la neofilia (Antunes e Biala, 2011; Goulart et al., 2010; Silvers et al., 2007) e per valutare i cambiamenti causati da interventi farmacologici e lesioni cerebrali. Sviluppato inizialmente per i roditori, il test NOR (novel object recognition) è stato utilizzato anche per esaminare la memoria negli esseri umani, nei primati, nei piccioni, nei criceti, nei conigli e nei pesci. Questo capitolo descriverà come il test NOR e le varianti di questo test sono stati adattati per l’uso con pesci d’acqua dolce e marini, e come questi pesci si sono comportati sia nel NOR che nei test di memoria episodica (ELM).

Secondo stime recenti, ci sono oltre 32.500 specie di pesci negli ecosistemi oceanici e d’acqua dolce, e rappresentano circa la metà dei vertebrati viventi sul pianeta (Nelson, 2006). I pesci possono vivere in ambienti molto diversi e sopportare varie sfide fisiologiche che alla fine influenzano i loro repertori comportamentali. Per esempio, alcuni pesci vivono in acqua dolce che non contiene quasi sale (0,1 mOsmol/kg), mentre altri prosperano in mare (∼1000 mOsmol/kg) e fino ad ambienti ipersalini (2400 mOsmol/kg) (McCormick et al., 2013), e di conseguenza richiedono processi ionoregolatori completamente opposti per equilibrare il loro milieu interno (∼300 mOsmol/kg). I pesci eurialini possono persino passare avanti e indietro dall’acqua salata a quella marina (McCormick et al., 2013). Altri pesci come la carpa crucifera (Carassius carassius) possono vivere in acque a 4°C senza ossigeno (anossia completa) per diversi mesi (Nilsson, 2001). Queste sono imprese fisiologiche che non hanno paragoni nei sistemi dei mammiferi. Può essere che come animali terrestri non ci relazioniamo bene con la vita sott’acqua e non passiamo molto tempo ad osservare i pesci nel loro habitat naturale. Questo porta i ricercatori e il pubblico in generale ad avere una tendenza generale a sottovalutare le capacità fisiologiche e mentali dei pesci (Brown et al., 2008; Brown, 2014). Tuttavia, ci sono molte scoperte interessanti nel corso degli anni che forniscono una certa comprensione delle loro capacità cognitive basate sul loro comportamento in natura. Per esempio, l’uso di strumenti da parte dei pesci è stato descritto già nel 1958, 3 anni prima della scoperta di Jane Goodall dell’uso di strumenti negli scimpanzé (vedi Bshary et al., 2002; Patton e Braithwaite, 2015). Il pesce gatto hoplo marrone (Hoplosternum thoracatum) depone le uova e poi secerne una sostanza simile alla colla che usa per attaccare le sue uova alla lettiera delle foglie (cioè, una “tavoletta”). Se si presenta una minaccia, questi pesci raccolgono questa “tavoletta” e spostano le uova al sicuro (Armburst, 1958). I ciclidi africani (Aequidens paraguayensis) sono stati osservati trasportare le uova con tavolette di foglie (Keenleyside e Prince, 1976; Timms e Keenleyside, 1975), e il blackspot tuskfish (Choerodon schoenleinii) è stato osservato afferrare una conchiglia nella sua bocca e romperla contro una roccia, utilizzando così un’incudine simile alla roccia (Jones et al., 2011). Inoltre, l’uso di strumenti è stato recentemente osservato in uno studio di laboratorio con il merluzzo atlantico (Gadus morhua) (Millot et al., 2013). Ci sono molte altre descrizioni dell’uso degli strumenti, delle abilità spaziali e di navigazione e delle dinamiche sociali nei pesci che esulano dallo scopo di questo capitolo (per una rassegna vedi, Brown, 2014; Bshary et al., 2002; Patton e Braithwaite, 2015).

Per quanto riguarda l’apprendimento e la memoria, tra le diverse specie di pesci, i gobidi sembrano avere eccezionali abilità di memoria spaziale. Sono stati studiati nell’ultimo mezzo secolo. Osservati per la prima volta in natura, questi pesci vivono nella zona di marea dove la colonna d’acqua sale durante l’alta marea e possono esplorare tutta la zona intertidale. Durante la bassa marea, la colonna d’acqua diminuisce lasciando solo piccole pozze d’acqua per i gobidi. Se stimolati da un predatore durante la bassa marea, i ghiozzi diventano aerei, saltando da una piscina all’altra. Spesso i bordi superiori delle piscine non permettono ai ghiozzi di vedere il loro obiettivo, rendendo necessaria una memoria accurata della piscina di destinazione (Aronson, 1951, 1971). Questa memoria spaziale è stata studiata in laboratorio, e si è scoperto che può essere mantenuta fino a 40 giorni (Aronson, 1971), molto più grande della “durata della memoria di 3 secondi” nel mito dei pesci. Altri studi hanno dimostrato che la memoria è stata mantenuta per almeno 10 giorni in un compito di alternanza spaziale nel pesce zebra (Williams et al., 2002), per almeno 12 giorni in un test di discriminazione rinforzata dal cibo nel ciclide giallo elettrico (Labidochromis caeruleus) (Ingraham et al., 2016) e fino a 1 mese in un test di memoria implicita nel pesce paradise (Macropodus opercularis) (Csányi et al., 1989). In un paradigma di condizionamento della traccia appetitiva, il merluzzo atlantico (G. morhua) ha dimostrato la conservazione della memoria dopo almeno 3 mesi (Nilsson et al., 2008) e in un compito di risposta di fuga, il pesce arcobaleno maculato (Melanotaenia duboulayi) ha dimostrato la conservazione della memoria 11 mesi dopo la loro esposizione iniziale al test (Brown, 2001). In questi due ultimi studi, i pesci sono stati addestrati e testati in gruppo.

La maggior parte degli studi sull’apprendimento e la memoria nel secolo scorso sono stati eseguiti su pesci rossi ospitati in laboratorio o su pesci catturati in natura; tuttavia, nell’ultimo decennio, c’è stata un’impennata nella ricerca con il pesce zebra (Danio rerio). Questo pesce è diventato un utile organismo modello negli studi di neuroscienze comportamentali e farmacologia (Bailey et al., 2015; Kalueff et al., 2013; Levin et al., 2007; Norton e Bally-Cuif, 2010; Tierney, 2011; Mathur e Guo, 2010; Orger e de Polavieja, 2017). È stato utilizzato per studiare molti aspetti del comportamento, tra cui la ricompensa, l’apprendimento e la memoria, la risposta ai farmaci, l’aggressività, l’ansia e il sonno (Collier e Echevarria, 2013; Hamilton et al., 2017b; Holcombe et al., 2013; Perathoner et al., 2016; Norton e Bally-Cuif, 2010). Il sistema nervoso centrale del pesce zebra è molto meno complesso di quello degli esseri umani; tuttavia, le principali divisioni del cervello (prosencefalo, mesencefalo e mesencefalo) e i sistemi di neurotrasmettitori sono conservati (Panula et al., 2010). Con il completamento del suo sequenziamento del genoma (Kettleborough et al., 2013), il pesce zebra è un modello di scelta per i genetisti a causa della semplicità di manipolazione tramite tecniche di genetica in avanti (Patton e Zon, 2001) e inversa (Rinkwitz et al., 2011). Quindi, si prevede che l’uso di zebrafish aiuterà a determinare i meccanismi neurali e genetici che controllano i comportamenti di base e complessi (Holtzman et al., 2016; Blaser e Vira, 2014; Gerlai, 2012; Feierstein et al., 2015; Naumann et al., 2016; Friedrich et al., 2010; Leighton et al., 2018).

Studi di apprendimento e memoria hanno dimostrato che gli zebrafish sono in grado di eseguire una vasta gamma di compiti di apprendimento e memoria. Per esempio, i pesci zebra allevati solo con cibo rosso, blu, verde o bianco mordono più frequentemente le strisce di plastica dello stesso colore del cibo con cui sono stati allevati rispetto alle strisce di altri colori (Spence e Smith, 2008). In un test T-maze con due bracci distintamente colorati, l’ingresso nel braccio del colore “corretto” è stato costantemente premiato con il cibo. I zebrafish sono stati in grado di eseguire un compito di discriminazione visiva; hanno mostrato una preferenza per il braccio colorato che era abbinato alla ricompensa alimentare (Colwill et al., 2005). In alcuni test comportamentali, è stato utilizzato anche un “rinforzatore negativo” per esaminare la memoria associativa. Il feromone di allarme è un composto rilasciato con lesioni alle cellule epidermiche degli zebrafish e provoca una risposta innata di allarme. Hall e Suboski (1995) hanno scoperto che dopo aver accoppiato il feromone d’allarme con una luce rossa o una molecola odorante come la morfolina (stimoli inizialmente neutri), i pesci zebra hanno mostrato una reazione di allarme a entrambi gli stimoli in assenza del feromone d’allarme (Hall e Suboski, 1995). La risposta di evitamento è un altro tipo di apprendimento condizionato che comporta la somministrazione di stimoli stressanti o nocivi che induce l’organismo ad evitare lo stimolo. Per esempio, i pesci zebra possono essere condizionati a nuotare oltre un ostacolo alla vista di un segnale luminoso se questo segnale è costantemente seguito da lievi scosse elettriche (Pradel et al., 1999, 2000). Gli zebrafish sono stati anche testati in paradigmi di apprendimento spaziale. Possono imparare a nuotare verso lati alternati di un acquario per raccogliere una ricompensa alimentare (Smith et al., 2010; Williams et al., 2002) o per evitare uno stimolo avverso (Levin e Chen, 2004). Quindi, una vasta gamma di test di apprendimento e di memoria che sono stati utilizzati nei roditori sono ora adattati ed eseguiti da zebrafish.