La produzione di catalasi è considerata un determinante di virulenza in Staphylococcus aureus, permettendo ai batteri di resistere meglio all’uccisione intra- ed extracellulare da parte del perossido di idrogeno (4, 5). Le specie di Staphylococcus sono catalasi positive e anaerobiche facoltative, tranne S. aureus subsp. anaerobius e S. saccharolyticus, che sono catalasi negative e anaerobiche. Quest’ultimo è generalmente considerato apatogeno. La catalasi di S. aureus è codificata dal gene katA, che ha un open reading frame di 1.518 bp e codifica una proteina con 505 aminoacidi (9). S. aureus subsp. anaerobius ospita un gene mutato, designato katB, che è lungo 1.368 bp e codifica un polipeptide di 455 aminoacidi. Rispetto alla sequenza nucleotidica di katA, quella di katB ha mostrato sei mutazioni missenso e una delezione di una singola coppia di basi, situata a bp 1338 a monte del codone d’inizio, che causa uno spostamento della struttura di lettura nucleotidica e una terminazione prematura della traduzione a bp 1368 (9).

Sono stati riportati ceppi di S. aureus anaerobici e catalasi-negativi. Tuttavia, nessuno di loro è stato caratterizzato con metodi molecolari (1, 2, 7, 10, 12). Qui descriviamo un isolato di S. aureus meticillino-resistente (MRSA) catalasi-negativo che è stato caratterizzato dall’amplificazione e dal sequenziamento del gene putativo della catalasi. A nostra conoscenza, questa è la prima descrizione molecolare di un ceppo di S. aureus subsp. aureus catalasi-negativo.

Un uomo di 65 anni è stato ammesso all’unità di terapia intensiva del dipartimento di chirurgia dell’ospedale universitario di Mainz. Era multimorbido, affetto da cirrosi epatica alcol-tossica, ipertensione arteriosa, malattia coronarica, insufficienza cardiaca (classe II secondo la classificazione della New York Heart Association), diabete mellito e malattia polmonare ostruttiva cronica. Un campione di secrezione tracheale è stato prelevato per un’indagine microbiologica di routine, senza che fossero evidenti segni di infezione in quel momento.

Il campione di secrezione tracheale è stato trattato convenzionalmente, e sono state osservate colonie cremose beta-emolitiche, tipiche di S. aureus, su agar sangue di pecora al 5%. L’isolato è risultato ripetutamente negativo per la catalasi dopo un’incubazione aerobica o anaerobica, anche alla quinta subcultura. Cresceva bene sia aerobicamente che anaerobicamente. I risultati del test della coagulasi su vetrino e del test della DNasi erano fortemente positivi. Il sistema BBL CRYSTAL per batteri gram-positivi (Becton Dickinson Company, Sparks, MD) e il sistema API Staph (bioMérieux, Marcy l′Etoile, Francia) hanno identificato l′isolato come S. aureus con il 98,6% e il 97,8% di probabilità (codici profilo 0064773465 e 6736153), rispettivamente. L’analisi della sequenza del DNA del gene 16S rRNA ha confermato il ceppo come S. aureus subsp. aureus. Questo ceppo è stato depositato nella DSMZ (collezione tedesca di microrganismi e colture cellulari) con il numero DSM 18827.

La suscettibilità agli antibiotici è stata determinata mediante diffusione su disco su agar Mueller-Hinton in base alle linee guida CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Il ceppo era resistente a penicillina, oxacillina, cefaclor, cefuroxime, eritromicina, clindamicina e ciprofloxacina ma sensibile a gentamicina, rifampicina, sulfametossazolo-trimetoprim, vancomicina, teicoplanina e linezolid. Questo rappresenta il fenotipo tipico dei ceppi MRSA endemici osservati nel nostro istituto. Il ceppo è stato ulteriormente confermato come MRSA utilizzando la PCR per identificare i geni mecA e S. aureus-specifici come descritto in precedenza (6).

La sequenza nucleotidica del gene della catalasi di S. aureus nel ceppo MRSA catalasi-negativo è stata amplificata mediante PCR utilizzando i primer descritti in precedenza (9), ed entrambi i filamenti sono stati sequenziati utilizzando la chimica del dye terminator con un analizzatore di DNA ABI PRISM 3700. L’analisi della sequenza ha rivelato un’identità del 99,60% con quella del gene della catalasi katA del ceppo MRSA Mu50 o N315 (Gen Bank accession no. BA000017 o BA000018, rispettivamente), con una differenza di 6 nucleotidi nelle posizioni 1152 e 1388-1392 a monte del codone di inizio. La sostituzione di una singola base (T) situata a bp 1152 a monte del codone di iniziazione rappresenta una mutazione silenziosa. Tuttavia, la cancellazione di cinque basi (AAACG) (da bp 1388 a 1392 a monte del codone di iniziazione) ha portato a uno spostamento della struttura di lettura nucleotidica, con la conseguenza della sostituzione di aminoacidi consecutivi e la terminazione prematura della traduzione a bp 1418. Allo stesso modo, la nostra sequenza del gene della catalasi era identica al 99,54% alle sequenze di katA dei ceppi di S. aureus subsp. aureus MSSA476, COL, NCTC 8325, USA300 e MW2, di cui sono stati sequenziati anche i genomi completi, con conferma ripetuta della stessa delezione di 5 basi.

Questa mutazione differiva quindi fondamentalmente dalle mutazioni che sono state descritte per il gene della catalasi katB di ceppi S. aureus subsp. anaerobius catalasi-negativi (GenBank accession No. AJ000471) (9). Tuttavia, le conseguenze di una delezione nella regione C-terminale della catalasi sembrano essere le stesse, cioè uno spostamento del frame di lettura nucleotidico, un codone di terminazione precoce e una perdita dell’attività enzimatica.

Due specie di Staphylococcus, S. aureus subsp. anaerobius e S. saccharolyticus, sono note per non produrre catalasi. Il nostro ceppo differisce da queste specie sulla base della sua capacità di crescere bene in condizioni aerobiche, la sua espressione del fattore di raggruppamento, la sua produzione di acido da trealosio e lattosio, e la sua sequenza 16S rRNA.

Le catalasi, o più correttamente le idroperossidasi, sono enzimi coinvolti nella degradazione del perossido di idrogeno (generato durante il metabolismo cellulare o incontrato durante l’infezione dell’ospite) in acqua e ossigeno molecolare. La catalasi è stata a lungo implicata come un determinante di virulenza in S. aureus. L’importanza dell’espressione in vivo degli enzimi di stress ossidativo catalasi e superossido dismutasi è stata suggerita attraverso l’analisi di isolati clinici con livelli ridotti di espressione di questi enzimi (4, 5). S. aureus subsp. anaerobius è strettamente legato a S. aureus sensu stricto e condivide con esso la capacità di produrre tossine ed enzimi extracellulari, ma è dotato di un potenziale patogeno molto inferiore a S. aureus (9). Sia la sopravvivenza intracellulare che la moltiplicazione extracellulare giocano ruoli importanti nella patogenesi delle infezioni da S. aureus. La sopravvivenza intracellulare nei neutrofili, nelle cellule endoteliali, nelle cellule epiteliali e negli osteoblasti è stata descritta in S. aureus e quindi richiede che i batteri possano resistere allo stress ossidativo (3). La catalasi è un componente critico per mantenere la vitalità durante la fame a lungo termine, una capacità importante per la trasmissione nosocomiale di S. aureus o MRSA (11). Infine, la produzione di catalasi è un meccanismo importante che permette allo S. aureus di coesistere con i microrganismi che generano perossido di idrogeno in un ambiente aerobico come il tratto respiratorio superiore. L’attività battericida di Streptococcus pneumoniae verso S. aureus è apparentemente mediata dal perossido di idrogeno, fornendo una possibile spiegazione meccanicistica per l’interferenza interspecifica osservata negli studi epidemiologici (8).

La rilevanza clinica dei ceppi di S. aureus catalasi-negativi richiede uno studio. In rapporti precedenti, i ceppi di S. aureus catalasi-negativi sono stati isolati da campioni di sangue, cateteri, campioni di secrezione bronchiale, ulcere e altre ferite associate a infezioni o endemie nosocomiali (1, 2, 7, 10, 12). Anche se pochi, questi rapporti forniscono la prova che la catalasi non è un requisito assoluto per la patogenicità. Tuttavia, è possibile che la patogenicità o l’efficienza di trasmissione sia diminuita. Nel nostro caso, il ceppo MRSA catalasi-negativo è stato ripetutamente isolato dallo stesso paziente ma mai da altri pazienti dell’unità di terapia intensiva o dell’ospedale universitario. Non c’erano indicazioni che il ceppo avesse causato un’infezione. Il modello di resistenza agli antibiotici ha suggerito un’origine comune per il ceppo MRSA catalasi-negativo e altri ceppi MRSA locali. Ci sono pochi, se non nessuno, rapporti di MRSA catalasi-negativo che sono stati isolati da un paziente senza malattia apparente dall’isolato. Questo articolo presenta un rapporto unico in questo senso. Questo è anche il primo rapporto di un ceppo di S. aureus subsp. aureus catalasi-negativo caratterizzato con metodi molecolari.