INTRODUZIONE

Lo yogurt è un prodotto caseario preparato dalla fermentazione del latte con Lactobacillus spp. Oggi, le proprietà terapeutiche, profilattiche e nutrizionali dello yogurt sono ampiamente accettate (Boor, 2001). Se somministrati in quantità sufficiente, i probiotici apportano benefici alla salute dell’ospite e aumentano l’equilibrio microbico (Fuller, 1989; Guarner et al., 2005). Quindi, i probiotici sono microrganismi vivi, non patogeni e amichevoli che svolgono ruoli benefici nel comparto della microflora dell’ospite (Schrezenmeir e de Vrese, 2001). I batteri dell’acido lattico (LAB) sono il gruppo di microrganismi probiotici più importante, soprattutto Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp. ed Enterococcous sp. (Klein et al., 1998). Le qualità dietetiche e terapeutiche del prodotto del latte sono determinate dal microrganismo probiotico (Boor, 2001).

Lo yogurt è una fonte potenziale di Lactobacillus spp. probiotico. Lo yogurt è anche conosciuto come il cibo più ricco di contaminazione probiotica. Il valore nutrizionale del prodotto del latte è aumentato dai microrganismi probiotici e dai metaboliti prodotti come risultato della fermentazione. L’assunzione regolare di yogurt riduce l’eccesso di grasso dal fegato e migliora la secrezione. È anche necessario per coloro che soffrono di malattie cardiache, aterosclerosi, ipertensione e infiammazione. Il succo gastrico che viene secreto dall’azione dello yogurt porta ad un’alta capacità digestiva. L’effetto benefico dei microrganismi probiotici, in particolare Lactobacillus sp., che esiste nei prodotti lattiero-caseari, è stato dimostrato da molti ricercatori che hanno studiato gli effetti dei microrganismi probiotici contro gli organismi patogeni utilizzando diversi metodi (Mercenier et al., 2003).

I lattobacilli sono membri dei batteri dell’acido lattico il cui prodotto finale primario di fermentazione è l’acido lattico. Sono batteri commercialmente importanti con un’ampia varietà di applicazioni sia nell’industria alimentare che in quella non alimentare grazie al loro status di “Generally Recognized As Safe” (GRAS). I lattobacilli sono stati ampiamente studiati per la loro biologia molecolare al fine di migliorare le loro specifiche caratteristiche benefiche (Pouwels e Leer, 1993).

La modalità di azione dei probiotici si basa sulla capacità dei batteri probiotici di legare gli agenti patogeni nel tessuto epiteliale intestinale. L’azione antipatogena dei probiotici consiste nella produzione di acido lattico che diminuisce il pH, interagisce con le tossine prodotte dai patogeni con la produzione di perossido di idrogeno e la sintesi di batteriocina (Corcionivoschi et al., 2010).

Un prodotto probiotico efficace richiede una corretta identificazione e caratterizzazione della specie batterica utilizzata. La selezione degli organismi probiotici che possono essere utili dal punto di vista terapeutico e nutrizionale sarebbe basata su proprietà specifiche (Fuller, 1989; Quewand e Vesterlund, 2004).

Lo scopo di questa ricerca era di raccogliere yogurt da varie regioni del Bangladesh e l’identificazione dei lattobacilli tramite PCR batteriologica e specifica del genere e l’analisi delle loro proprietà probiotiche in seguito all’interferenza con la crescita di batteri patogeni.

MATERIALI E METODI

Raccolta di campioni e isolamento di batteri lattici (LAB): Due tipi di campioni di yogurt sono stati raccolti da diversi supermercati di Chittagong e Bogra, in Bangladesh, di sapore acido (campione M1, M2 e M3) e dolce (campione S2). Poi i campioni sono stati conservati immediatamente dopo la raccolta in un frigorifero a bassa temperatura (4°C) in modo asettico per proteggere dalla contaminazione e dal deterioramento. Il Lactobacillus spp. è stato isolato dai campioni di yogurt mediante diluizioni appropriate con una soluzione salina allo 0,9%. Il brodo MRS (Man, Rogosa and Sharpe) e i terreni di agar MRS (Man, Rogosa and Sharpe) sono stati utilizzati per la crescita dell’organismo. Il pH dei terreni è stato regolato a 6,5. Le piastre sono state incubate aerobicamente a 37°C per 48 ore. Infine, la singola colonia di Lactobacillus è stata isolata osservando la morfologia della colonia e alcuni test biochimici come la colorazione di Gram, la catalasi e il test dell’ossidasi. Le colonie ben isolate sono state prelevate e trasferite in brodo MRS per l’arricchimento di Lactobacillus a 37°C.

Identificazione dei batteri dell’acido lattico (LAB) mediante analisi batteriologica: L’identificazione è stata effettuata secondo i metodi descritti nel Bergeys manual of systemic bacteriology. Senza l’uso di condizioni anaerobiche tutti i ceppi sono cresciuti bene su agar MRS a 37°C per 48 ore per la crescita selettiva dei lattobacilli. Da diluizioni appropriate una colonia rappresentativa è stata prelevata e identificata provvisoriamente come lattobacilli dopo la reazione di colorazione di Gram, l’aspetto delle colonie, la morfologia cellulare, il test della catalasi, il test dell’ossidasi, il test dell’indolo, il test del rosso metile, il test di Voges-Persauer, il test di utilizzo del citrato e i modelli di fermentazione dei carboidrati come delineato dal manuale Bergeys (Hensyl, 1994).

Estrazione del DNA dagli isolati: Il DNA è stato estratto da 4 campioni isolati dallo yogurt secondo il classico metodo del calore-disgelo (Salehi et al., 2005). La coltura batterica pura da MRS agar slant è stata subcoltivata in MRS broth medium da cui 1,5 mL di coltura brodosa è stata presa in una provetta eppendorf e centrifugata a 10.000 rpm per 5 minuti. Dopo di che il surnatante è stato scartato e il pellet è stato raccolto. Circa 200 μL di acqua deionizzata autoclavata sono stati aggiunti al pellet e sciolti agitando con le dita. Il tappo della provetta eppendorf è stato forato da un ago sterile e poi la provetta è stata bollita a bagnomaria a 100°C per 10 minuti. Subito dopo l’ebollizione, la provetta eppendorf è stata tenuta in ghiaccio per 10 minuti e poi centrifugata a 10.000 rpm per 10 minuti. Poi sono stati raccolti 100-150 μL di surnatante contenente il DNA cromosomico batterico.

Amplificazione PCR specifica del genere: Per determinare l’appartenenza al livello di genere di tutti e 4 gli isolati, la PCR è stata effettuata con il set di primer specifici del genere Lactobacillus LbLMA1-rev (5′-CTCAA AACTAAACAAAGTTTC-3′) e R16-1 (5′-CTTGTACACACCG CCCGTCA-3′) progettati da Dubernet et al. (2002). L’analisi PCR è stata fatta sulla base della regione intergenica spaziatrice dell’RNA ribosomiale 16-23S come descritto in precedenza (Dubernet et al., 2002).

La miscela di reazione (20 μL) conteneva 1 μL (100 ng μL1) di ogni primer aggiunto con 10 μL 10× PCR Master Mix, 6 μL di acqua PCR e 2 μL di template. La condizione di esecuzione era la denaturazione iniziale a 95°C per 5 min, seguita da 30 cicli che consistevano nella denaturazione a 95°C per 30 secondi, nell’annealing a 55°C per 30 secondi, nell’estensione a 72°C per 30 secondi e in una fase di estensione finale di 7 minuti a 72°C. I prodotti sono stati conservati a 4°C fino all’analisi. I prodotti amplificati sono stati sottoposti a elettroforesi in gel di agarosio all’1% in tampone TAE (40 mM Tris acetato, 1 mM EDTA, pH 8.2). I gel sono stati colorati con bromuro di etidio (5 μg mL1) e visualizzati sotto transilluminatore UV (Biometra GmBH, Germania).

Analisi delle caratteristiche probiotiche: Le caratteristiche probiotiche sono state determinate analizzando i seguenti test.

Test di tolleranza al NaCl: Per la determinazione della tolleranza al NaCl, i lattobacilli isolati sono stati coltivati in brodo MRS contenente nove provette regolate con diverse concentrazioni di NaCl (1-9%). Dopo la sterilizzazione in autoclave per 15 minuti in 15 Ibs di pressione a 121°C, ogni provetta è stata inoculata con 10 μL di coltura notturna di Lactobacillus e incubata anaerobicamente a 37°C per 24 ore. Dopo 24 ore di incubazione, la crescita batterica è stata misurata utilizzando uno spettrofotometro a 560 nm (Graciela e Maruia, 2001).

Test di tolleranza ai sali biliari: Il tasso di crescita delle colture batteriche è stato determinato in brodo MRS contenente diversi livelli (0,05, 0,1, 0,15, 0,3 e 0,5%) di sali biliari. Le colture appena preparate sono state inoculate (1%) nel mezzo e incubate a 37°C per 24 ore in condizioni anaerobiche. Poi la densità ottica di ogni campione è stata misurata usando uno spettrofotometro a 560 nm (Graciela e Maruia, 2001).

Determinazione del pH ottimale per la crescita: Per la determinazione del pH ottimale per la crescita, 100 μL di coltura fresca di Lactobacillus overnight sono stati inoculati in provette contenenti brodo MRS con pH variabile da 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 e 8.0. Per determinare l’effetto del pH sulla crescita sono stati utilizzati i tamponi acetato (pH -4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5), Tris-HCl (pH-7) e borato (pH-8). Il brodo inoculato è stato incubato in condizioni anaerobiche per 24 ore a 37°C. Dopo l’incubazione, la crescita dei batteri è stata misurata utilizzando uno spettrofotometro a 560 nm rispetto al brodo di controllo non inoculato.

Quantificazione dell’acido organico e determinazione del valore del pH: Secondo Hoque et al. (2010), è stata eseguita la quantificazione degli acidi organici prodotti dagli isolati e la determinazione dei loro valori di pH. Il brodo MRS integrato con 10% di latte scremato è stato inoculato con 1% (v/v) o 100 μL di coltura overnight degli isolati e incubato in condizioni anaerobiche a 37°C per 72 ore. I campioni fermentati sono stati raccolti ogni 24, 48 e 72 ore e i liquidi del latte coagulato sono stati separati per filtrazione. Dopo la filtrazione, il pH del liquido separato è stato registrato utilizzando un misuratore di pH ad elettrodo digitale e la quantificazione dell’acido organico è stata fatta attraverso la titolazione con 0,1 N NaOH usando il fenoftalene come indicatore di pH (Hoque et al., 2010).

Screening dell’interferenza con i batteri patogeni: Le attività antibatteriche dei Lactobacillus spp. isolati contro alcuni batteri patogeni sono state determinate con il metodo della sovrapposizione di agar modificato (Aween et al., 2012). Otto diversi patogeni umani, Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli e Shigella sonnei sono stati utilizzati in questo studio come patogeni di prova. L’attività antibatterica è stata ulteriormente caratterizzata determinando se batteriostatica o battericida. Il test è stato eseguito tamponando la zona di inibizione della crescita. Il tampone è stato strisciato su una piastra di agar nutriente e incubato aerobicamente a 37°C per 72 ore. La presenza di crescita nella piastra di agar nutriente è stata interpretata come attività inibitoria, cioè batteriostatica, mentre nessuna crescita è stata interpretata come battericida.

RESULTATI E DISCUSSIONE

Identificazione dei batteri attraverso test batteriologici e biochimici: I quattro isolati sono stati coltivati in terreno Man, Rogosa e Sharpe (MRS) a pH 6.5. Tutti gli isolati sono stati prodotti piccoli, irregolari e di forma rotonda con crema biancastra brillante o di colore brunastro che erano morfologicamente simili a Lactobacillus spp.

Quindi tutti gli isolati sono stati esaminati al microscopio a campo chiaro per osservare le loro caratteristiche microscopiche. Questi isolati sono stati trovati gram positivi, a forma di asta corta e media, non spore che formano batteri (Fig. 1a-d) che li indicano come membri di Lactobacillus spp.

Inoltre, alcuni test biochimici come il test della catalasi, il test dell’ossidasi, il test dell’indolo, il test del rosso metile (MR), il test di Voges Proskauer (VP), il test di utilizzo del citrato e i modelli di fermentazione dei carboidrati sono stati eseguiti come delineato dal Bergeys manual systematic bacteriology (Hensyl, 1994).

Gli isolati sono stati trovati catalasi e ossidasi negativi e nei test IMViC (indolo, metil-rosso, voges proskauar, utilizzo del citrato) tutti gli isolati sono stati trovati negativi, quindi questi potrebbero confermare che gli isolati erano Lactobacillus spp (Dhanasekaran et al, 2010).

In questo studio, tutti i quattro isolati sono stati in grado di fermentare 11 diversi carboidrati, cioè, glucosio, saccarosio, fruttosio, lattosio, xilosio, ribosio, galattosio, maltosio, mannitolo, ramnosio e destrosio indicando che sono in grado di crescere in varietà di habitat utilizzando diversi tipi di carboidrati. I risultati riassunti di tutti i test batteriologici e biochimici sono presentati nella tabella 1. Tutti questi risultati sono stati trovati pertinenti ai risultati di Chowdhury et al. (2012).

Identificazione molecolare attraverso la PCR specifica del genere: In questo studio, abbiamo usato un primer specifico del genere preparato analizzando le somiglianze tra le sequenze nucleotidiche della regione spaziale tra i geni 16 e 23S dell’RNA ribosomiale di Lactobacillus (Dubernet et al., 2002). La specificità di questo primer specifico del genere combinato con un primer universale è stato testato contro 23 ceppi di Lactobacillus di varia origine. I prodotti di PCR sono stati sottoposti a elettroforesi su gel in agarosio all’1% e visualizzati con un transilluminatore UV. Per ogni campione (M1, M2, M3 e S2) è stata trovata una banda netta di 200 bp che corrisponde alla regione dello spaziatore intergenico 16-23S rRNA di Lactobacillus spp. (Dubernet et al., 2002). Così tutti e 4 gli isolati sono stati confermati a livello di genere come Lactobacillus spp. Il controllo negativo senza alcun modello non ha dato alcuna banda, il che suggerisce che tutti i 4 prodotti di PCR erano corrispondenza del DNA modello (Fig. 2).

Analisi delle caratteristiche probiotiche: I batteri probiotici producono una varietà di sostanze con proprietà antibatteriche tra cui acido organico, H2O2, batteriocine che influenzano il metabolismo batterico o la produzione di tossine (Rafter, 2003; Rolfe, 2000; Vandenbergh, 1993).

Per fare questo, devono essere in grado di resistere a condizioni sfavorevoli nell’intestino come NaCl e sale bile.

Test di tolleranza al NaCl: L’isolato Lactobacillus spp. da yogurt era in grado di tollerare 1-9% di NaCl. Per determinare la tolleranza al NaCl degli isolati, la densità ottica è stata misurata a 560 nm e i dati sono stati tracciati. Gli isolati M1, M2, M3 e S2 sono cresciuti bene alla concentrazione dell’1% di NaCl. La crescita massima (OD) degli isolati M1, M2, M3 e S2 è stata trovata 1.420, 2.143, 1.662 e 2.207, rispettivamente in 1% NaCl (Fig. 3). L’alta tolleranza al sale è una proprietà desiderabile per gli organismi da utilizzare come probiotici.

È noto che NaCl è una sostanza inibitoria che può inibire la crescita di alcuni tipi di batteri. In questo studio, i risultati hanno mostrato che i Lactobacillus spp. isolati dagli yogurt erano in grado di tollerare 1-9% di NaCl e la crescita ottimale è stata osservata all’1-5% di NaCl (Hoque et al., 2010).

Test di tolleranza ai sali biliari: Il Lactobacillus spp. isolato è stato in grado di sopravvivere in 0,05, 0,1, 0,15 e 0,3% di acido biliare. Il Lactobacillus spp. isolato è stato anche in grado di moltiplicarsi nelle suddette concentrazioni di acido biliare. La densità ottica è stata misurata a 560 nm e i dati sono stati tracciati. Tutti gli isolati crescono bene in una concentrazione di sali biliari dello 0,05%. La crescita massima (OD) degli isolati M1, M2, M3 e S2 è stata trovata rispettivamente 1.741, 2.213, 1.758 e 2.125. Il tasso di crescita è diminuito con l’aumento del livello di concentrazione dei sali biliari (Fig. 4).

In questo esperimento sono stati utilizzati 0,05-0,3% di concentrazione di bile che si può trovare nel tratto intestinale umano e la concentrazione massima di bile che è presente nell’uomo sano è 0,3% (Graciela e Maruia, 2001). È stato riportato che, prima di selezionare un batterio probiotico per il consumo umano, deve essere tollerabile alla concentrazione di bile dello 0,3% (Gilliland et al., 1984). Sulla base del risultato, si suggerisce che, questi ceppi possono essere potenziali per l’uso come organismo probiotico perché tutti gli isolati erano resistenti e in grado di crescere in 0,3% di concentrazione di sali biliari.

Determinazione del pH ottimale per la crescita: Il Lactobacillus spp. isolato dagli yogurt era in grado di crescere in intervalli di pH da 4,0 a 8,0. La densità ottica è stata misurata a 560 nm e i dati sono stati tracciati. La crescita massima (OD) degli isolati M1, M3 e S2 è stata trovata 2.201, 2.0619 e 2.237, rispettivamente a pH 6.0 mentre la crescita massima degli isolati M2 era 2.259 a pH 6.5 (Fig. 5). Gli isolati sono stati in grado di crescere a pH tra 4.0 e 8.0 ma la crescita ottimale è stata osservata a pH tra 5.0 e 6.5 quando coltivati in brodo MRS a 37°C. Da questo studio si può concludere che il tasso di crescita di Lactobacillus spp. diminuisce ad un certo stadio quando la concentrazione di pH aumenta (Chowdhury et al., 2012).

Quantificazione dell’acido organico e determinazione valore del pH: Per la quantificazione dell’acido organico, è stato usato il metodo di titolazione.

Quantificazione dell’acido organico = V×N×D

dove, V è il volume di NaOH, N è la forza di NaOH e D è il fattore di diluizione. Il risultato della produzione di acido organico è presentato nella tabella 2.

Questo studio indica che la produzione di acido organico è aumentata con il tempo di incubazione, ma allo stesso tempo il pH dei media è diminuito con l’aumento della produzione di acido. Dal risultato (Tabella 2) l’acidità più alta (1,9%) e il pH più basso 3,64 sono stati osservati dopo 72 ore di incubazione a 37°C per il Lactobacillus probiotico isolato dallo yogurt Bogra. Altri batteri probiotici isolati dallo yogurt di diversi supermercati di Chittagong hanno mostrato la più alta acidità 1.83, 2.11 e 2.11% e il più basso pH 3.9, 3.68 e 3.65, rispettivamente dopo 72 ore di incubazione.

C’è una piccola variazione nella produzione di acido organico da parte dei lattobacilli dovuta alle loro differenze regionali, indicando che questi isolati sono leggermente dipendenti dal clima e dall’ambiente (Hoque et al., 2010).

Screening di interferenza con i batteri patogeni: I probiotici tra cui Lactobacillus, Bifidobacterium e Streptococcus spp. sono noti per essere inibitori della crescita di una vasta gamma di patogeni intestinali nell’uomo. Oltre agli effetti favorevoli contro le malattie causate da uno squilibrio della microflora intestinale, diverse osservazioni sperimentali di batteri contro lo sviluppo di tumori del colon sono riportate da Dunne et al. (2001) e Wollowski et al. (2001).

In questo studio, i 4 isolati selezionati sono stati esaminati secondo la loro attività antibatterica contro diversi batteri patogeni come Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli e Shigella sonnei associati a malattie di origine alimentare. Il confronto della loro inibizione (in mm) contro 8 patogeni di test è mostrato nella tabella 3.

I risultati sperimentali hanno mostrato che la più alta attività inibitoria dell’isolato M1 è stata dimostrata contro Bacillus cereus (51,20±1,22 mm) e la più bassa zona di inibizione era (23,46±1,00 mm) contro Shigella sonnei dopo 72 ore di incubazione. Il diametro più alto della zona di inibizione dell’isolato M2 è stato mostrato contro E. coli (38,43±1,00 mm) e la zona più bassa (20,10±1,00 mm) contro Bacillus megaterium dopo 72 ore di incubazione. Allo stesso modo, il diametro più alto della zona di inibizione dell’isolato M3 è stato mostrato contro P. aeruginosa (42,90±1,20 mm) e la zona più bassa (17,83±1,10 mm) contro S. aureus. Infine, nell’isolato S2, la zona più alta è stata osservata contro E. coli (43,80±1,20 mm) e la zona più bassa (21,63±1,10 mm) contro S. aureus dopo 72 ore di incubazione. I risultati relativi a Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae ed Escherichia coli sono stati trovati pertinenti ai risultati di Chowdhury et al. (2012). L’isolato M1 è risultato battericida verso Bacillus megaterium, Vibrio cholera, Shigella sonnei e batteriostatico verso Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, P. aeruginosa, S. aureus ed E. coli. L’isolato M2 era battericida verso Bacillus cereus, Shigella sonnei e batteriostatico verso Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli. L’isolato M3 era battericida verso Shigella dysenteriae, Bacillus megaterium e Staphylococcus aureus e batteriostatico verso Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Escherichia coli e Shigella sonnei e l’isolato S2 era battericida a Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae e Shigella sonnei e batteriostatico a Bacillus megaterium ed Escherichia coli.

CONCLUSIONE

In questo studio i Lactobacillus spp, sono stati isolati e identificati da yogurt regionali selettivi. Per l’identificazione dei batteri sono stati eseguiti diversi test batteriologici e biochimici. Oltre a questo è stata condotta una PCR utilizzando i primer specifici del genere (LbLMA-rev) e universali (primer R16-1) corrispondenti alla regione dello spaziatore intergenico 16-23S rRNA di Lactobacillus spp. per confermare l’identificazione batteriologica. I Lactobacillus spp. isolati erano in grado di tollerare sostanze inibitorie come NaCl (1-9%) e sale biliare (0,05-0,3%) e anche in grado di sopravvivere in condizioni alcaline (pH 8,0). Tutti questi isolati (M1, M2, M3 e S2) erano capaci di utilizzare carboidrati come glucosio, xilosio, saccarosio, fruttosio, galattosio, lattosio, maltosio, ribosio, ramnosio, mannitolo e destrosio. Inoltre, il Lactobacillus spp. isolato, da tutti e 4 gli isolati (M1, M2, M3 e S2) era in grado di produrre acido organico nel latte. Questa indagine indica che c’è una piccola variazione nella produzione di acido organico da parte dei Lactobacillus dovuta alla loro variazione regionale. La presenza di attività antibatteriche di tutti e 4 gli isolati (M1, M2, M3 e S2) contro otto comuni batteri patogeni umani è stata trovata soddisfacente e gli isolati producono batteriocina extracellulare. Un probiotico deve essere in grado di inibire gli organismi patogeni e dovrebbe essere in grado di tollerare le difficili condizioni dell’intestino umano come l’alto sale, il basso pH e l’alta concentrazione di sali biliari. Tutti i Lactobacillus spp. isolati hanno soddisfatto questi criteri e quindi possono essere considerati come potenziali probiotici per la salute umana.