Modello discreto

La crescita di una colonia microbica che consuma un nutriente diffondente è rappresentata utilizzando il modello a reticolo introdotto da Matsuura23, i cui dettagli sono forniti nella sezione 3. Brevemente, consideriamo un reticolo rettangolare con L x e L y siti nelle direzioni x e y, rispettivamente. Il numero di celle occupate è indicato con ν con la corrispondente densità di celle ρ = ν/(L x L y ). Ogni elemento del reticolo rettangolare può ospitare al massimo una cella ma può contenere qualsiasi numero intero non negativo di particelle nutritive, indipendentemente dal fatto che ci sia anche una cella in quel sito. Ad ogni passo temporale, le cellule di lievito possono assorbire una particella nutritiva situata nello stesso sito e produrre una singola cellula figlia in un sito adiacente in una direzione cardinale, mentre le particelle nutritive possono fare s passi, sempre nelle direzioni cardinali. Come condizione iniziale, le cellule sono seminate all’interno del reticolo in un modello prescritto, mentre un certo numero di particelle nutritive sono collocate uniformemente a caso all’interno del dominio per dare una specifica concentrazione media iniziale c0. I confini del dominio sono trattati come pareti solide, replicando il comportamento sperimentale all’interno di una capsula di Petri. È importante notare che i modelli prodotti da questo modello sono il risultato della sola interazione tra le cellule e il nutriente, per cui qualsiasi morfologia non uniforme prodotta dal modello può essere attribuita interamente alla DLG.

Morfologie caratteristiche della DLG

Matsushita & Fujikawa12 ha usato una colonia di cellule di B. subtilis per illustrare tre fenomeni chiave che sorgono a causa di DLG: (I) la ‘selezione’ dei rami più corti da quelli più lunghi; (II) repulsione tra colonie vicine; e (III) crescita diretta verso una fonte di nutrimento (Fig. 2). Queste caratteristiche sono state precedentemente dimostrato di sorgere a causa di DLG solo utilizzando un modello basato su reticolo della crescita della colonia simile a quello utilizzato qui 30. Confermiamo prima che il modello discreto descritto sopra può riprodurre questo comportamento prima di utilizzare questo modello per quantificare i modelli prodotti.

Risultati sperimentali di Matsushita & Fujikawa12 (riga superiore) con simulazioni modello corrispondente (riga inferiore). Sono mostrati (a) rami più grandi che schermano i rami più piccoli dal nutrimento (fenomeno I), (b) due colonie seminate vicine che sembrano respingersi a vicenda (fenomeno II), e (c) una singola colonia che cresce verso la fonte di nutrimento sul lato destro della piastra di Petri (fenomeno III). Le simulazioni di (d) rami di selezione, (e) due colonie vicine e (f) crescita con il nutriente sul lato destro sono calcolate usando il modello basato sul reticolo. Le cellule del seme sono contrassegnate da un punto rosso. Le simulazioni sono state calcolate su reticoli con dimensioni L x = L y = 200 con parametri s = 3 e c0 = 1, che risultano in un valore di Δ dello stesso ordine di grandezza come negli esperimenti. Le figure 2(a), 2(b) e 2(c) sono ristampate da Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 168, Mitsugu Matsushita and Hiroshi Fujikawa, Diffusion-limited growth in bacterial colony formation, 498-506, 1990, con il permesso di Elsevier.

L’interazione tra le cellule e il nutriente può essere quantificata ampiamente confrontando il tasso relativo di diffusione di queste due quantità. La crescita della colonia è misurata calcolando il tasso medio di cambiamento nell’area della colonia Δ m quando vista dall’alto, che ha le stesse unità della diffusività. Questa quantità si calcola facilmente da un’immagine sperimentale o da dati simulati, come quelli prodotti dal modello discreto. La diffusione del nutriente Δ n è presa per essere la diffusività del glucosio poiché questo è comunemente usato come fonte di nutrimento e c’è poca differenza tra la diffusività dei diversi nutrienti. La diffusività del glucosio in acqua è nota per essere circa \({D}_{0}=4,03 volte {10}^{-2})mm2 min-1, sulla base di osservazioni sperimentali36. Per il glucosio in un gel di agar a bassa densità, la diffusività è data da

dove w è la percentuale in peso di agar37. Assumendo w = 0,3%, la diffusività è 4,01×10-2 mm2 min-2, che è il valore utilizzato per il resto di questo studio. La diffusività cambia poco con la quantità di agar, e quindi w ha un impatto trascurabile sui risultati. Da queste quantità calcoliamo il rapporto

che fornisce una misura adimensionale dei tassi relativi di diffusione. A piccoli valori di Δ, i nutrienti si diffondono su una scala temporale più veloce della crescita cellulare, il che significa che qualsiasi variazione locale nella concentrazione di nutrienti si dissipa senza influenzare la morfologia della colonia. Un valore di Δ che è 1 o più grande indica che la crescita cellulare si sta verificando ad una velocità almeno tanto grande quanto la diffusione dei nutrienti, e le variazioni locali nella concentrazione dei nutrienti possono avere un impatto sulla morfologia della colonia. Delle tre immagini sperimentali, solo l’immagine della crescita diretta ha sufficienti informazioni fornite sia sulla scala che sul tempo necessario per calcolare Δ. Da questa immagine troviamo che Δ ≈ 0,23. Impostando s = 3 e c0 = 1 nel modello si ottengono soluzioni con valori di Δ tra 0,3 e 0,5, che è dello stesso ordine di grandezza dei risultati sperimentali e quindi fornisce un confronto adeguato. Questi valori di parametro sono utilizzati per il resto di questa sottosezione. Il comportamento in ciascuno dei tre casi è ulteriormente quantificato utilizzando gli indici spaziali, descritti di seguito, simili all’approccio di Binder et al.38. Ogni simulazione utilizza un reticolo con dimensioni L x = L y = 200, che è abbastanza grande per produrre caratteristiche con una risoluzione sufficiente pur essendo computazionalmente efficiente.

Per esaminare lo screening ramo (fenomeno I), nutriente è seminato uniformemente a caso attraverso il dominio e una singola cella è posto al centro del reticolo. La simulazione viene eseguita fino a quando la densità totale delle cellule raggiunge 0,2, illustrata dalla colonia rappresentativa mostrata in Fig. 2. Questa colonia è caratterizzata da grandi rami che emanano dal sito della cella centrale iniziale, con rami più corti in mezzo che sono stati schermati dal nutrimento dai rami più grandi, e mostra una significativa crescita non uniforme. Questo corrisponde al comportamento osservato da Matsushita & Fujikawa12. La morfologia può essere quantificata contando prima gli angoli di ogni cellula misurati in senso antiorario da qualche angolo di riferimento con l’origine posta al centro della massa. I conteggi sono scalati dai valori attesi per le cellule distribuite uniformemente a caso, e l’indice angolare di crescita non uniforme I θ è definito come la deviazione standard dei conteggi scalati, in modo che valori maggiori di I θ indicano livelli maggiori di crescita non uniforme. L’immagine sperimentale ha un indice di 0,18, mentre la simulazione ha un indice di 0,2, indicando che i due sono in stretto accordo.

Per il caso delle colonie respingenti (fenomeno II), il nutrimento è di nuovo posto uniformemente a caso attraverso il dominio. Due celle seme sono poste verticalmente al centro del dominio, ognuna a un ottavo della larghezza del dominio dal centro orizzontalmente in modo che le celle siano separate da un quarto della larghezza totale del dominio. La simulazione viene calcolata fino a quando la densità totale delle celle raggiunge 0,2. Una tipica simulazione è mostrata in Fig. 2, che mostra il divario tra le due colonie osservate da Matsushita & Fujikawa12. Le colonie di repulsione possono essere quantificate contando il numero totale di cellule ν e il numero di cellule ν c tra le due cellule seme alla fine della simulazione. L’indice di repulsione è quindi definito come I c = 1 – ν c /ν, che è vicino a 0,5 quando le due colonie crescono uniformemente, inferiore a 0,5 quando si forma un divario, e maggiore di 0,5 quando le colonie mostrano una preferenza per la crescita verso l’altro. Le posizioni delle celle di seme per ogni colonia nell’immagine sperimentale sono approssimate disegnando linee lungo i rami e identificando dove queste si intersecano. L’immagine sperimentale e la simulazione hanno indici 0,19 e 0,27, rispettivamente, il che suggerisce che entrambi producono modelli di crescita simili con un divario significativo tra le due colonie.

La crescita diretta (fenomeno III) è simulata mettendo inizialmente tutti i nutrienti nella colonna più a destra del dominio, con una singola cella posta al centro del dominio. La simulazione viene quindi calcolata fino a quando la densità delle cellule raggiunge 0,1. Una tipica colonia è mostrata in Fig. 2, che assomiglia molto al risultato sperimentale di Matsushita & Fujikawa12. Per misurare la polarizzazione verso un lato del dominio, calcoliamo la proporzione I b delle cellule sul lato destro del dominio rispetto al numero totale di cellule, in modo che I b ∈ . I valori dell’indice I b vicini a 0,5 indicano una distorsione minima, mentre I b < 0,5 indica una distorsione verso il lato destro e I b < 0,5 indica una distorsione verso sinistra. L’immagine sperimentale ha un indice di 0,92, che corrisponde strettamente all’indice di simulazione di 0,93. In entrambi i casi gli indici indicano una grande distorsione di crescita verso la posizione iniziale del nutriente.

Come trovato da Ginovart et al.30, le buone corrispondenze qualitative tra le immagini sperimentali e le simulazioni mostrano che DLG da solo può produrre lo screening, la repulsione e la crescita diretta delle colonie di B. subtilis. Abbiamo ulteriormente rafforzato questo confronto attraverso l’uso di un confronto quantitativo tra gli esperimenti e un modello matematico. Così, ci aspettiamo che questi fenomeni siano presenti quando DLG sta influenzando la morfologia, mentre l’assenza di queste caratteristiche suggerisce che altri meccanismi sono responsabili del modello di crescita. Fondamentalmente, l’accordo tra il modello discreto e il modello proposto da Ginovart et al. dimostra che il modello discreto impiegato qui fornisce una rappresentazione soddisfacente di DLG e quindi può essere utilizzato per quantificare questo comportamento.

Inducendo DLG

Avendo dimostrato che il modello discreto è in grado di replicare il comportamento DLG, qui quantifichiamo la dipendenza di questi fenomeni dai parametri del modello in modo da prevedere quando gli effetti DLG si presenteranno. Le colonie sono nuovamente simulate su un reticolo di dimensioni L x = L y = 200 utilizzando le stesse tre condizioni iniziali e gli stessi criteri di arresto della sottosezione precedente. Le simulazioni sono ripetute 50 volte per ogni coppia di passi di nutrienti s = 1, 5, …, 37 e concentrazioni iniziali c0 = 1, 2, …, 7. Per ogni coppia di parametri calcoliamo l’indice medio rilevante sulle 50 realizzazioni.

Per esaminare il branch screening (fenomeno I), consideriamo le colonie cresciute da una singola cellula in un campo di nutrienti uniforme, con i corrispondenti valori medi dell’indice \({\bar{I}}_{\theta }\) sulle 50 realizzazioni mostrate in Fig. 3. I valori più grandi di \({bar{I}}_{\theta}) si presentano quando sia s che c0 sono piccoli, il che è dovuto a due fattori. In primo luogo, poiché la diffusività dei nutrienti, effettivamente s, è piccola rispetto al tasso di crescita cellulare, le fluttuazioni nei livelli di nutrienti si sviluppano attraverso il dominio. In secondo luogo, la bassa concentrazione iniziale di nutrienti c0 significa che queste fluttuazioni creano regioni in cui il livello di nutrienti è troppo basso per sostenere la crescita cellulare. Quando s o c0 è più grande, almeno una di queste condizioni non può verificarsi e il valore di \({\bar{I}}_{\theta}\) diventa più piccolo, indicando che DLG non ha più un’influenza significativa sulla colonia. Quindi, questi risultati indicano che i modelli non uniformi possono verificarsi solo quando sia la diffusività dei nutrienti, rispetto al tasso di crescita cellulare, che la concentrazione dei nutrienti sono piccoli.

Misure degli effetti di DLG in colonie microbiche simulate. Tutte le simulazioni sono calcolate usando il modello basato sul reticolo usando una gamma di passi di nutrienti s e concentrazioni iniziali di nutrienti c0. Sono mostrati (a) l’indice medio \({bar{I}}_{theta }}) per lo screening dei rami (fenomeno I), (b) l’indice medio \({bar{I}}_{c}) per il respingimento delle colonie (fenomeno II), e (c) l’indice medio \({bar{I}}_{b}) per la crescita diretta (fenomeno III).

Un comportamento simile si osserva per il caso di repulsione (fenomeno II), come si vede dall’indice medio \({bar{I}}_{c}}) tracciato in Fig. 3. I valori maggiori dell’indice si trovano a piccoli valori di s e c0, il che si verifica per le stesse ragioni di \({\bar{I}}_{\theta }\).

Il comportamento per la crescita diretta (fenomeno III) è diverso, come si vede dall’indice medio \({bar{I}}_{b}\ mostrato in Fig. 3. A piccoli valori di s, l’indice \({bar{I}_{b}}} è grande e varia poco con c0. All’aumentare di s, l’indice \({bar{I}}_{b}} diminuisce e mostra una maggiore dipendenza da c0, con valori più grandi di \({bar{I}}_{b}) a valori più bassi di c0. L’intervallo di valori del parametro su cui si può osservare la crescita diretta è molto più grande che per gli altri due fenomeni DLG. Pertanto, se la crescita diretta non si verifica, allora non si verificheranno nemmeno le altre due caratteristiche, e quindi la crescita diretta fornisce un primo controllo utile per DLG che è semplice da misurare. Questa caratteristica sarà usata per testare la DLG nel resto di questo lavoro.

Modello continuo

L’emergere dei fenomeni DLG dipende sia dalla concentrazione di nutrienti che dalla diffusività delle due specie. Mentre gli indici misurano la dipendenza di questi fenomeni dal numero di passi discreti di nutrienti s e dalla concentrazione iniziale di nutrienti c0, il valore di Δ potrebbe essere calcolato solo dai dati simulati piuttosto che specificato come input al modello. Quando si considerano i dati sperimentali, tuttavia, è naturale caratterizzare la diffusione relativa delle cellule e dei nutrienti usando Δ, poiché questo può essere misurato facilmente dalle immagini sperimentali. Qui introduciamo un sistema deterministico di equazioni di reazione-diffusione che modella la densità delle cellule e la concentrazione di nutrienti e permette la specificazione delle diffusività relative di ogni quantità, che è equivalente a impostare Δ. Mentre questo modello non è adatto a catturare le caratteristiche sottili osservate in Fig. 2, è in grado di replicare la crescita diretta verso una fonte di nutrienti (fenomeno III), che è stato trovato per sorgere nel più ampio intervallo di parametri. Ci concentriamo quindi su questo aspetto della DLG, che agisce come un segno facilmente misurabile che la DLG si sta verificando.

Consideriamo un dominio unidimensionale, che è sufficiente per illustrare il comportamento generale del modello29,32,39. Usando la posizione adimensionale x, il tempo t, la densità cellulare n(x,t) e la concentrazione di nutrienti g(x, t), descritta nella sezione 3, le equazioni di governo si riducono a

Il parametro D = D m /D n è il rapporto tra la diffusività cellulare D m e quella del nutriente D n . Questo è simile alla definizione di Δ (2), usando la diffusività cellulare al posto del tasso di cambiamento misurato nell’area della colonia. Il primo termine sul lato destro di entrambe le equazioni rappresenta il contributo della diffusione, mentre i secondi termini rappresentano rispettivamente il consumo di nutriente e la crescita di nuove cellule, con c la quantità adimensionale di nutriente consumato per nuova cellula.

Come condizioni iniziali, le cellule sono posizionate al centro del dominio con il nutriente polarizzato verso destra secondo

dove N può essere interpretato come una concentrazione di nutrienti adimensionale. Per illustrare il comportamento generale, le condizioni iniziali per N = 1 sono mostrate in Fig. 4.

Risultati del modello di reazione-diffusione unidimensionale. (a) La condizione iniziale per N = 1 mostra le cellule concentrate nel centro del dominio con il nutriente a destra. (b) I valori massimi di I b fino al tempo t = 1, tracciati contro il logaritmo in base 10 di D e N, suggeriscono che DLG si verifica solo a particolari valori del parametro. Due esempi rappresentativi sono mostrati contrassegnati. (c) Al più grande valore di I b quando D = 10-6 e N = 1, le cellule sono ancora quasi simmetriche su x = 0, mentre la concentrazione di nutrienti è diventata effettivamente uniforme. (d) Usando D = 10-0.5 e N = 105 si ha una significativa distorsione verso il lato destro, dove il nutriente era inizialmente concentrato.

Prendendo come fissi i tipici valori dei parametri dati nella sezione 3, il valore di N varia solo a causa della concentrazione fisica del nutriente. Considerando un mezzo contenente solo nutrienti, che rappresenta una concentrazione massima, troviamo che il valore di N non può essere maggiore di circa 105. Le soluzioni sono quindi calcolate per 1 ≤ N ≤ 105. Mentre le osservazioni sperimentali tipiche suggeriscono che 10-3 ≤ D ≤10-1, consideriamo valori per 10-6 ≤ D ≤103 in modo da fornire un esame teorico di come il comportamento cambia con D. Per diversi valori di questi parametri, calcoliamo il valore massimo di I b osservato fino al tempo t = 1. Questo corrisponde a circa 119 giorni di crescita. Questo corrisponde a circa 119 giorni di crescita, che, pur essendo più grande dei tipici tempi sperimentali, assicura che il valore massimo di I b sia osservato durante la simulazione. Gli indici calcolati I b sono tracciati in Fig. 4 usando una scala logaritmica in base 10 per entrambi gli assi. Per log(N) < 1, c’è poca o nessuna distorsione nella crescita delle cellule, come misurato da I b . A valori più grandi di N, la quantità di distorsione osservata dipende dal valore di D, con il massimo che si verifica vicino a (D,N) = (1, 105). Questo valore di D corrisponde a diffusività delle cellule e dei nutrienti di uguale grandezza e intorno a questo valore è possibile osservare una distorsione nella crescita per valori di N piccoli come 101,5. In condizioni sperimentali tipiche, N ha ordine di grandezza 2, il che indica che gli effetti DLG sono più probabili da osservare quando D è vicino all’unità.

La gamma di comportamento è ulteriormente illustrata considerando le distribuzioni da due esempi contrastanti. In ogni caso, la soluzione è mostrata nel momento corrispondente al massimo bias della cella. Per D = 10-6 e N = 1, mostrato in Fig. 4, la concentrazione dei nutrienti è diventata effettivamente uniforme prima che la densità delle cellule possa sviluppare qualsiasi bias evidente verso il lato destro, dove il nutriente era inizialmente concentrato. Al contrario, prendendo D = 10-0.5 e N = 105, anch’esso tracciato in Fig. 4, le cellule mostrano un’ovvia preferenza verso il lato destro del dominio.

L’analisi del modello continuo suggerisce che, se \(D\ll 1\), allora la crescita diretta, e quindi qualsiasi effetto DLG, si verificherà solo a valori di N almeno grandi come 103. Poiché le stime indicano che N ha un ordine di grandezza 2, questo suggerisce che DLG sarà osservato solo quando D è vicino all’unità, come evidente dalla Fig. 4. Questo può anche essere illustrato usando parametri fisici. Usando i valori dei parametri dati nella sezione 3, i microbi con diffusività \({D}_{m}=3 volte {10}^{-2})mm2 min-1 posti in un ambiente con la massima concentrazione iniziale di nutrienti \({N}_{0}\mathrm{=3.8}times {10}^{-3})g mm-2 corrisponderebbero approssimativamente ai valori adimensionali D = 0.75 e N = 104. Dalla Fig. 4, ci si aspetterebbe che questa specie cresca verso una fonte di nutrimento e quindi mostri un comportamento DLG. Se gli stessi microbi fossero messi in un ambiente con una concentrazione massima di nutrienti \({N}_{0}\mathrm{=3.8}times {10}^{-6})g mm-2, il valore di N scenderebbe a 10 e la crescita distorta non sarebbe più osservata. I risultati di questa sezione forniscono quindi un quadro per identificare quando ci si aspetta che si verifichi la DLG basandosi solo sulle stime di D e N.

Confronti sperimentali

Avendo esaminato le previsioni del modello, le usiamo ora per identificare il meccanismo di crescita dominante nelle colonie microbiche. Consideriamo i tre esempi sperimentali rappresentativi mostrati in Fig. 1: due colonie del batterio B. subtilis e una colonia di S. cerevisiae. Poiché non conosciamo il valore appropriato del rapporto di diffusione D, che è richiesto dal modello di reazione-diffusione, la crescita è invece caratterizzata dalla diffusione relativa Δ (2). Questo parametro rappresenta il rapporto tra il tasso medio di cambiamento dell’area della colonia, visto dall’alto, e la diffusività del glucosio e può essere misurato dalle immagini. Poiché il nutriente è distribuito uniformemente e solo una singola colonia è cresciuta, qualsiasi DLG in questi esempi dovrebbe manifestarsi come una crescita irregolare con screening dei rami (fenomeno I).

I valori calcolati dei tassi di crescita Δ m sono riportati nella tabella 1, insieme ai corrispondenti tassi relativi Δ. Questi valori indicano che le colonie di B. subtilis crescono due ordini di grandezza più velocemente della colonia di lievito e un ordine di grandezza più lento della diffusività del glucosio. L’utilizzo di valori tipici per la concentrazione iniziale dei nutrienti suggerisce che gli esperimenti corrispondono a un valore di N che ha ordine di grandezza 2. La corrispondenza di questa stima e dei valori di Δ con i risultati del modello di Fig. 4 indica che B. subtilis corrisponde a un regime in cui si verificherà una crescita diretta dovuta a DLG. Poiché questa stima è stata fatta misurando il tasso di proliferazione cellulare p all’interno di una colonia di S. cerevisiae, che è probabilmente più piccolo del valore corrispondente per i batteri, ci si aspetta che sia una sottostima per N e un valore più grande di N aumenta la probabilità di osservare DLG. Al contrario, la colonia di S. cerevisiae ha un Δ con ordine di grandezza -3, che indica che il nutriente si diffonde su una scala temporale molto più veloce di quella della crescita cellulare. Di conseguenza, ci si aspetta che qualsiasi variazione locale nella concentrazione di nutrienti si dissipi prima di avere un’influenza sulla morfologia della colonia. Questo indica che la morfologia non è influenzata dalla DLG. Quindi, nonostante la forte somiglianza tra le forme delle colonie batteriche e di lievito in ambienti poveri di nutrienti, queste due morfologie sono dovute a fenomeni diversi. Le colonie batteriche crescono su una scala temporale sufficientemente veloce che la diffusione dei nutrienti può limitare la crescita, risultando in un modello irregolare. La crescita molto più lenta delle colonie di lievito significa che la DLG non può verificarsi e, invece, le morfologie non uniformi delle colonie che sorgono in ambienti a basso contenuto di nutrienti devono essere dovute alla sola crescita pseudofila.

Abbiamo cercato un’ulteriore conferma di questi risultati testando la crescita diretta (fenomeno III) in colonie di S. cerevisiae, imitando il set-up utilizzato da Matsushita & Fujikawa12 e nelle simulazioni40. Una piastra di Petri è stata riempita con destrosio sintetico a basso contenuto di ammonio (SLAD) con nutriente posto al centro della piastra di Petri. Le cellule di lievito sono state seminate a diverse distanze dal centro e fotografate dopo 16 giorni di crescita. Ulteriori dettagli sperimentali sono forniti nella sezione 3. Sia il glucosio che il solfato di ammonio sono stati usati come nutrienti limitati, con immagini rappresentative per ciascuno mostrate in Fig. 5. Le immagini sono orientate in modo che il centro della capsula di Petri, dove è stato collocato il nutriente, è sul lato destro. La diffusività dell’ammonio in acqua è circa 9,84×10-2 mm2 min-1 41. Poiché questo è dello stesso ordine di grandezza della diffusività del glucosio, ci si aspetta che ogni fonte di nutrienti porti a un valore simile di Δ. Nessuna delle due colonie mostra una distorsione notevole nella crescita in qualsiasi direzione, ed entrambe producono indici di distorsione I b quasi esattamente uguali a 0,5. Le diffusività effettive Δ m e le diffusività adimensionali Δ per ogni prova sono date nella tabella 2. In entrambi i casi Δ ha ordine di grandezza -3, il che indica che la crescita diretta non dovrebbe essere osservata e concorda con i risultati degli esperimenti precedenti.

Immagini degli esperimenti di crescita diretta utilizzando S. cerevisiae. Le immagini sono orientate in modo che il nutriente corrispondente si trovi sul lato destro della colonia, come indicato dal testo verticale. Le colonie sono state coltivate su (a) SLAD-G con glucosio aggiunto a destra e (b) SLAD-N con solfato di ammonio aggiunto a destra. Le barre della scala rappresentano 5 mm.

Un’ulteriore prova della modalità di crescita è fornita dal comportamento vicino al bordo delle colonie. Ci sono chiari segni di crescita non uniforme intorno al confine della colonia cresciuta su SLAD-N ma non sulla colonia cresciuta su SLAD-G. Se questo modello fosse dovuto alla DLG, ci aspetteremmo un comportamento simile su entrambi i supporti. È noto, tuttavia, che i lieviti diploidi, come il ceppo AWRI796 utilizzato in questo esperimento, passano alla crescita pseudo-ifale quando vengono privati dell’azoto2 , come SLAD-N. Questo suggerisce che la crescita non uniforme osservata nelle colonie di lievito, come mostrato in Fig. 1, è dovuta alla crescita pseudofila e non alla DLG.