Abstract

Background. La diagnosi precoce della batteriemia Gram-positiva e la tempestiva terapia antimicrobica appropriata sono necessarie per diminuire la mortalità dei pazienti. Lo scopo del nostro studio è stato quello di valutare le prestazioni del test di emocoltura Gram-positiva Verigene (BC-GP) in due ambienti sanitari speciali e determinare il potenziale impatto del test di emocoltura rapida per la batteriemia Gram-positiva all’interno del sistema sanitario giapponese. Inoltre, lo studio comprendeva emocolture simulate, che includevano una libreria di isolati ben caratterizzati di Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA) ed enterococchi resistenti alla vancomicina (VRE) che riflettono diverse regioni geografiche del Giappone. Metodi. Un totale di 347 test BC-GP sono stati eseguiti su emocolture cliniche e simulate. I risultati BC-GP sono stati confrontati con i risultati ottenuti con metodi di riferimento per l’identificazione del genere/specie e il rilevamento dei geni di resistenza utilizzando metodologie molecolari e MALDI-TOF MS. Risultati. Per l’identificazione e il rilevamento dei geni di resistenza in due siti clinici e nelle emocolture simulate, la concordanza complessiva del BC-GP con i metodi di riferimento è stata 327/347 (94%). Il tempo per l’identificazione e il rilevamento della resistenza antimicrobica tramite BC-GP è stato significativamente più breve rispetto ai test di routine, soprattutto nell’ospedale cardiologico, che non offre servizi di microbiologia clinica nei fine settimana e nei giorni festivi. Conclusioni. BC-GP ha generato un’accurata identificazione e rilevazione dei marcatori di resistenza rispetto ai metodi di laboratorio di routine per gli organismi Gram-positivi in ambienti clinici specializzati, fornendo risultati più rapidi degli attuali test di routine.

1. Introduzione

I batteri Gram-positivi sono i microrganismi più predominanti associati a sepsi in ambienti sanitari e la causa più prevalente di batteriemia in pazienti con trapianto di cellule staminali ematopoietiche. La batteriemia enterococcica è associata a un aumento del rischio di mortalità nei pazienti con trapianto di cellule staminali ematopoietiche, indipendentemente dalla suscettibilità alla vancomicina. Nelle unità di cardiologia, l’endocardite infettiva, l’aneurisma infettivo, le infezioni del flusso sanguigno legate al catetere o le infezioni del sito chirurgico dopo gli interventi cardiaci sono le principali infezioni di cui i microrganismi causali più comuni sono cocchi Gram-positivi. In entrambe le unità mediche, l’individuazione precoce dei Gram-positivi e dei marcatori resistenti è molto critica nella gestione della cura del paziente, nella stewardship antibiotica e nella prevenzione della diffusione dei microrganismi resistenti.

Poiché l’intervento precoce con la terapia antimicrobica è associato a una prognosi migliore e ogni ora di ritardo è associata a un aumento della mortalità, la diagnosi rapida è fondamentale. Il Verigene Gram-positive blood culture assay (BC-GP) (Nanosphere, Inc., Northbrook, IL) è un sistema di microarray da campione a risultato per l’identificazione dei comuni batteri Gram-positivi e dei principali marcatori di resistenza direttamente da un’emocoltura positiva. Anche se un certo numero di studi hanno precedentemente valutato BC-GP riportando prestazioni che vanno dal 92 al 99% di accordo con la metodologia convenzionale, una limitazione dei rapporti precedenti è stata che molti degli studi sono stati dagli Stati Uniti così come i paesi al di fuori del Giappone con solo un rapporto pubblicato di portata limitata in Giappone.

La variazione genetica tra le stirpi batteriche che circolano in diverse regioni geografiche del mondo può influenzare la sensibilità dei saggi molecolari basati su sonde oligonucleotidiche per rilevare gli organismi o marcatori di resistenza. Gli studi a Hong Kong e in Belgio hanno riportato prestazioni BC-GP inferiori.

Lo scopo di questo studio è stato quello di determinare il potenziale impatto sulla gestione del paziente e l’esito del paziente di BC-GP in ambienti ospedalieri specializzati all’interno dell’ambiente sanitario giapponese, che affronta una serie di sfide. Una popolazione che invecchia sempre di più e l’onere che accompagna l’aumento dei costi sanitari complessivi hanno sfidato l’infrastruttura sanitaria. Nonostante lo Staphylococcus aureus meticillino-resistente (MRSA) sia responsabile di oltre il 90% delle infezioni contratte in ospedale causate da batteri resistenti in Giappone, l’esternalizzazione dei test di microbiologia clinica o l’assenza di copertura nel fine settimana sono comuni in molte strutture sanitarie come parte del contenimento dei costi. Questo documento rappresenta la prima valutazione completa di BC-GP in Giappone per convalidare le sue prestazioni cliniche. Lo studio di emocoltura simulata include una libreria di ceppi ben caratterizzati di MRSA associati all’assistenza sanitaria (HA-MRSA), MRSA acquisiti in comunità (CA-MRSA) ed enterococchi resistenti alla vancomicina (VRE) che circolano in Giappone.

2. Metodi

BC-GP è stato valutato al Toranomon Hospital (TH) e Sakakibara Heart Institute (SHI), in conformità con i protocolli di studio approvati dal comitato di revisione istituzionale specifico del sito, durante il 26 giugno 2012, al 6 marzo 2013. Il TH è un ospedale universitario con 1168 posti letto e un’unità di cura ematologica di 123 posti letto per il trapianto di cellule staminali ematopoietiche che esegue da 140 a 160 trapianti di cellule staminali ematopoietiche all’anno. Il laboratorio di microbiologia dell’ospedale funziona tutti i giorni durante le ore diurne. SHI è un ospedale universitario di 320 letti specializzato in malattie cardiovascolari con una casistica di oltre 1.500 interventi a cuore aperto all’anno. Il laboratorio di microbiologia dell’ospedale è gestito da un laboratorio di riferimento commerciale esterno. Il laboratorio di microbiologia opera durante il turno di giorno nei giorni feriali ed è chiuso nei fine settimana e nei giorni festivi.

Le emocolture sono state eseguite allo SHI utilizzando flaconi BacT/ALERT FA e il monitoraggio con BacT/ALERT 3D (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francia). TH ha usato flaconi BACTEC Plus e il monitoraggio con BACTEC 9240 e FX (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Solo un flacone di emocoltura positivo contenente cocci o bacilli Gram-positivi per paziente è stato incluso nello studio. Due ml di terreno di emocoltura positivo sono stati conservati a -85C per la ripetizione dei test.

L’identificazione microbiologica di routine e i test di suscettibilità degli isolati sono stati eseguiti utilizzando test di identificazione convenzionali come la solubilità della bile, la suscettibilità del disco optochin e il sistema MicroScan WalkAway (Beckman Coulter, Pasadena, CA) al TH e il sistema Vitek 2 (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francia) al SHI. Lo screening della cefoxitina per la resistenza alla meticillina è stato eseguito secondo le linee guida CLSI. È stato utilizzato anche un test di agglutinazione al lattice per rilevare la proteina legante la penicillina PBP2a.

Il testBC-GP è stato eseguito su emocolture positive con organismi Gram-positivi secondo le istruzioni del produttore. In breve, un campione ben miscelato di 350 μl del terreno dell’emocoltura è stato pipettato nel pozzetto del campione del vassoio di estrazione nucleica BC-GP, collocato sul Verigene Processor SP per l’elaborazione e l’analisi con il Verigene Reader.

È stata eseguita una valutazione per determinare la differenza di tempo tra la comunicazione dei risultati utilizzando BC-GP e l’identificazione basata sulla coltura e i risultati di suscettibilità antimicrobica per 139 brodi di emocoltura positivi. Per i risultati basati sulla coltura, il tempo richiesto fino alla generazione del rapporto finale era il tempo tra la lettura della colorazione di Gram e l’inserimento dei risultati finali di identificazione e suscettibilità nel sistema informativo del laboratorio. Per il BC-GP, il tempo per il risultato era il tempo tra la lettura della macchia di Gram e l’inserimento dei risultati del BC-GP nel sistema informativo del laboratorio.

Un set di sfida di 208 emocolture simulate è stato costruito utilizzando il tipo, i ceppi di riferimento e i ceppi clinici provenienti da diverse regioni geografiche del Giappone per valutare il BC-GP. I ceppi clinici includevano organismi che presentavano problemi per i sistemi di identificazione commerciali in studi clinici precedenti al TH e al SHI. Inoltre, è stata testata anche una libreria di ceppi ben caratterizzati di HA-MRSA, CA-MRSA e VRE dal Giappone. Studi di emocoltura simulata sono stati eseguiti presso il Miroku Medical Laboratory (Saku City, Prefettura di Nagano, Giappone). Duecentottanta ceppi sono stati regolati a una torbidità di circa 100 CFU/ml in una soluzione salina sterile. Trecento μl sono stati inoculati in bottiglie BACTEC Plus Aerobic/F contenenti da 8 a 10 ml di sangue umano intero (gruppo sanguigno O, Tennessee Blood Services, Memphis, TN) per un inoculo finale di 30 UFC/bottiglia. Un flacone BACTEC Plus Anaerobic/F è stato inoculato anche per S. pneumoniae e il gruppo S. anginosus. Ogni flacone è stato incubato nel sistema BACTEC fino a generare un segnale positivo. Se il BC-GP ha generato risultati negativi, è stata ripetuta la diluizione di 11 volte del mezzo di coltura del sangue utilizzando acqua distillata sterile.

Ognuno degli isolati positivi della coltura del sangue nei due siti ospedalieri è stato conservato in latte scremato al 10% (Difco) a -85C. L’identificazione della specie è stata confermata utilizzando la spettrometria di massa a desorbimento laser assistito dalla matrice (MALDI-TOF MS) (Microflex LT con software Biotyper ver. 3.0; Bruker Daltonik GmbH, Brema, Germania) per tutti i ceppi. Se l’organismo non è stato identificato a livello di specie mediante MALDI-TOF MS (valore di punteggio < 2,0) o identificato come Micrococcus, Listeria, Staphylococcus diverso da S. aureus, Streptococcus diverso da S. pyogenes e S. agalactiae, è stato eseguito un test di conferma mediante PCR-sequenziamento diretto di 16S rDNA o sodA presso l’Università Juntendo o l’Università medica femminile di Tokyo. La PCR specifica per il rilevamento di mecA in tutti gli stafilococchi e vanA, vanB in tutti gli enterococchi è stata eseguita. I metodi utilizzati per la tipizzazione SCCmec di MRSA acquisiti in comunità o associati all’assistenza sanitaria utilizzati per caratterizzare i ceppi sono stati precedentemente descritti.

La concordanza è stata determinata in confronto ai risultati dei metodi di riferimento. C’era concordanza se il rilevamento del target BC-GP concordava con il metodo di riferimento a livello di genere o di specie. Gli intervalli di confidenza al novantacinque per cento (95% CI) e il test a coppie sono stati determinati utilizzando GraphPad StatMate (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

3. Risultati

In questo studio, l’accordo complessivo di identificazione tra BC-GP e il metodo di riferimento è stato di 327/347 (94%) per le emocolture prospettiche in due siti clinici e le emocolture simulate. L’accordo combinato tra PCR e BC-GP per la rilevazione di mecA è stato di 71/73 (97%) per le emocolture prospettiche e le emocolture simulate.

La precisione di identificazione combinata da entrambi i siti ospedalieri è stata di 129/139 (93%). Per le colture monomicrobiche, l’accuratezza di identificazione era 121/124 (98%). L’accordo tra PCR e BC-GP per la positività di mecA era 51/53 (96%). La tabella 1 mostra i risultati del TH. Complessivamente, 96/104 (92%) organismi sono stati identificati correttamente dalla BC-GP a livello di specie o di genere, compreso il rilevamento dei geni di resistenza. Come mostrato nella tabella 2, l’accordo totale del BC-GP con il metodo di riferimento al SHI è stato di 33/35 (94%) organismi.

BC-GP riporta la presenza di mecA solo per S. aureus e S. epidermidis. In questo studio, dei 102 ceppi di stafilococco, 72 erano S. aureus o S. epidermidis. I risultati discordanti erano dovuti a organismi mecA S. epidermidis non rilevabili in colture polimicrobiche contenenti sia S. epidermidis mecA positivo che mecA negativo. Dei 30 Staphylococcus spp. diversi da S. epidermidis e S. aureus, 21 (70%) erano positivi per mecA, compresi 2 S. lugdunensis, che non potevano essere riportati come mecA positivi dal BC-GP.

La tabella 3 mostra la differenza di tempo tra la generazione dei risultati BC-GP e l’identificazione finale basata sulla cultura e i risultati di suscettibilità antimicrobica in entrambi gli ospedali. I risultati BC-GP erano disponibili in media da 28,2 a 51,0 ore prima dell’identificazione finale basata sulla coltura e dei risultati di suscettibilità al TH. Al SHI, il BC-GP ha generato risultati in una media di 34,5 a 196,6 ore prima. Confrontando il tempo per l’identificazione finale basata sulla coltura e risultati di suscettibilità a TH e SHI, con l’eccezione di S. aureus, i risultati per S. epidermidis e stafilococchi coagulasi-negativi diversi da S. epidermidis, enterococchi e streptococchi richiesto significativamente () più tempo a SHI (83.3, 123.6, 159.1, e 199.1 ore, rispettivamente) rispetto a TH (40.8, 53.9, 36.1, e 53.5 ore, rispettivamente).

Utilizzando emocolture simulate di Gram-positivi, BC-GP ha identificato correttamente 198/208 (95%) degli organismi (Tabella 4). Sei streptococchi (3%) sono stati identificati erroneamente o identificati solo a livello di genere dal BC-GP. Per quanto riguarda i 4 flaconi di emocoltura BC-GP falsi negativi, 1 S. pyogenes è stato identificato correttamente e 1 S. mitis ha generato un segnale positivo di Streptococcus genus/S. pneumoniae dopo una diluizione di 11 volte del terreno di coltura. Il gene mecA è stato rilevato in 20/20 (100%) organismi MRSA che rappresentano ceppi acquisiti in comunità (SCCmec tipo IIa, IV e V) e associati all’assistenza sanitaria (SCCmec tipo I, IIb, III e non tipizzabile) mediante BC-GP. BC-GP ha rilevato 14/14 (100%) geni vanA e 20/20 (100%) vanB in ceppi VRE ben caratterizzati da studi precedenti in Giappone.

4. Discussione

Le prestazioni di BC-GP osservate nel nostro studio erano simili ai rapporti precedenti. Poiché i servizi di microbiologia clinica sono esternalizzati o non funzionano durante i turni di riposo nei giorni feriali e sono chiusi nei fine settimana e nei giorni festivi in molti ospedali in Giappone, i test diagnostici rapidi hanno un potenziale significativo di impatto sulla cura del paziente, diminuendo drasticamente il tempo di identificazione dell’organismo e i risultati di suscettibilità antimicrobica.

La BC-GP rileva il mecA in tutti gli stafilococchi sulla base della misurazione dell’intensità del segnale; tuttavia, la segnalazione è limitata a S. aureus e S. epidermidis sulla base di un algoritmo in cui il mecA viene segnalato solo quando S. aureus o S. epidermidis viene rilevato dalla BC-GP. Le versioni future del BC-GP dovrebbero prendere in considerazione la modifica dell’algoritmo per consentire la segnalazione del rilevamento di mecA per stafilococchi diversi da S. aureus o S. epidermidis, poiché il 70% dei 30 ceppi non-S. aureus e S. epidermidis nel nostro studio erano resistenti alla meticillina. Sebbene S. epidermidis sia il principale patogeno stafilococcico coagulasi-negativo, altri stafilococchi come S. lugdunensis e S. haemolyticus sono importanti patogeni nell’ambiente sanitario. Al contrario, la performance di BC-GP era 121/124 (98%) nelle emocolture cliniche monomicrobiche e 198/208 (95%) nelle emocolture simulate. In questo studio, le emocolture polimicrobiche hanno rappresentato 14/106 (13%) e 3/33 (9%), rispettivamente, delle emocolture positive a TH e SH. Complessivamente, le colture polimicrobiche hanno rappresentato 17/139 (12%) delle emocolture cliniche prospettiche, il che è coerente con gli studi precedenti che riportano dal 6 al 20% di tutte le infezioni del flusso sanguigno come polimicrobiche. Il BC-GP ha identificato correttamente tutti gli organismi in 12/17 (70%) delle colture polimicrobiche. Nei precedenti studi BC-GP, i tassi di identificazione corretta nelle colture polimicrobiche variavano dal 57 all’86%. Poiché le informazioni fuorvianti possono influenzare la diagnosi clinica, con conseguente selezione inappropriata degli agenti antimicrobici, è necessario comprendere i limiti del BC-GP.

Un’ulteriore preoccupazione con le colture polimicrobiche è l’interpretazione clinica del rilevamento di mecA e di stafilococco. Nelle nostre 17 colture polimicrobiche, 5 campioni hanno prodotto 2 o 3 ceppi stafilococcici con o senza mecA. Questo può portare a un uso non necessario della vancomicina o a sottostimare l’infezione causata da stafilococchi resistenti alla meticillina. Ripetere il BC-GP su un altro set di emocolture può ridurre il rischio di questo problema. Per le colture monomicrobiche o le colture simulate, tutte le discrepanze sono state osservate con gli streptococchi ad eccezione di 1 ceppo S. caprae. L’identificazione errata BC-GP per gli streptococchi ha incluso 2 S. mitis identificati come S. pneumoniae, nessun rilevamento di 2 S. pneumoniae, 2 S. anginosus group e 2 S. pyogenes. Rapporti precedenti hanno anche riportato risultati simili per S. mitis, S. oralis e S. pneumoniae. Come parentela genetica tra S. mitis, S. oralis, e S. pneumoniae è ben noto sulla base di >99% omologia delle sequenze del gene 16S rRNA , BC-GP risultati per S. pneumoniae o Streptococcus con alfa-emolisi senza alcun segnale positivo specie-specifica dovrebbe essere attentamente interpretato e confermato da metodi convenzionali come la sensibilità optochin o il test di solubilità bile. È interessante notare che una diluizione di 11 volte del mezzo di emocoltura originale può portare al rilevamento del segnale Streptococcus e del segnale di specie (tabella 4). È stata riportata una gamma di rilevamento a seconda dell’organismo da BC-GP.

Il vantaggio principale dell’utilizzo di BC-GP è il tempo più precoce per la segnalazione dell’identificazione e dei determinanti di resistenza dalle emocolture positive che consente una selezione più precoce della terapia antimicrobica appropriata e l’attuazione di misure di controllo delle infezioni come l’isolamento e la precauzione del contatto. Questo ha il potenziale di avere un impatto significativo nel sistema sanitario giapponese. La differenza di tempo tra i risultati BC-GP e l’identificazione finale basata sulla cultura e i risultati di suscettibilità mostrati nella tabella 3 al TH è coerente con i rapporti precedenti. D’altra parte, i risultati precedenti da 80,7 a 196,6 ore per gli organismi diversi da S. aureus utilizzando BC-GP al SHI riflettono la non disponibilità dei servizi di microbiologia clinica durante i fine settimana e le vacanze. Poiché i servizi di microbiologia clinica sono esternalizzati in molti ospedali in Giappone o limitati a un turno durante i giorni feriali o non offerti durante i fine settimana, i potenziali costi-benefici del mantenimento dei servizi di emocoltura negli ospedali sono significativi. Inoltre, l’addestramento del personale di laboratorio nel laboratorio generale per riconoscere i cocchi e i bacilli Gram-positivi permetterà il test BC-GP durante il fine settimana e la sera/notte. BC-GP offre l’opportunità agli ospedali di mantenere in-house un servizio di laboratorio molto critico.

In conclusione, BC-GP ha fornito un’identificazione accurata e il rilevamento di marcatori di resistenza rispetto ai metodi di laboratorio basati sulla coltura di routine per gli organismi Gram-positivi tra cui CA-MRSA, HA-MRSA, e ceppi VRE che circolano in Giappone. Ridurre al minimo il tempo per ottimizzare la terapia antimicrobica utilizzando BC-GP può contribuire a ridurre i costi e migliorare la cura del paziente. Nel 2016, BC-GP ha ricevuto l’approvazione normativa in Giappone diventando il primo test molecolare multitarget per le emocolture positive approvato come dispositivo diagnostico in vitro per aiutare la diagnosi delle infezioni batteriche del flusso sanguigno. Ulteriori studi saranno necessari per convalidare il rapporto costo-efficacia del BC-GP nel contesto del sistema sanitario giapponese.

Approvazione etica

Questo studio è stato approvato dai comitati di revisione interna TH e SHI.

Interessi concorrenti

Tutti gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Contributi degli autori

Ken Kikuchi ha progettato e condotto lo studio e ha redatto il manoscritto. Mari Matsuda, Shigekazu Iguchi, Tomonori Mizutani, Kaori Sansaka, Kenta Negishi, Kimie Shimada, Shigeyuki Notake, Hideji Yanagisawa, e Reiko Yabusaki hanno eseguito i lavori di laboratorio. Keiichi Hiramatsu, Michiru Tega-Ishii, Jun Umemura, Hiroshi Takahashi, Hideki Araoka, e Akiko Yoneyama hanno supervisionato la raccolta dei dati e coordinato e partecipato alla progettazione dello studio.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sostenuto, in parte, da un Grant-in-Aid (S0991013) del Ministero dell’Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia, Giappone (MEXT), per la Fondazione di progetti di ricerca strategica nelle università private.