La creazione di sistemi di trasformazione genetica ha permesso agli scienziati di trasformare DNA estraneo in funghi filamentosi e di ottenere così i ceppi desiderati per scopi industriali. Ora possiamo trarre pieno vantaggio dal superiore potere secretorio dei funghi e dalla loro eccellente efficienza nella produzione di preziosi metaboliti.

Trasformazione mediata da protoplasti (PMT)

La PMT è il metodo di trasformazione fungina più comunemente usato, che si basa su un gran numero di protoplasti fungini competenti. Il principio è quello di utilizzare alcuni enzimi disponibili in commercio per rimuovere i componenti complessi della parete cellulare fungina per generare protoplasti. Successivamente, alcuni reagenti chimici (come il PEG) vengono utilizzati per promuovere la fusione di acidi nucleici esogeni e protoplasti, come descritto più in dettaglio di seguito. I componenti della parete cellulare dei funghi sono molto variabili tra i diversi ceppi. Anche i componenti del mantello delle spore sono significativamente diversi da quelli delle ife dello stesso ceppo. Pertanto, non esiste un metodo di trasformazione universale che possa essere applicato a diversi ceppi fungini. La preparazione del protoplasto può difficilmente essere standardizzata. Parte delle difficoltà deriva dalla nostra limitata conoscenza delle idrolasi della parete cellulare. Lo sviluppo di un metodo PMT ottimizzato per i funghi richiede ancora uno sforzo significativo.

PMT è un metodo di trasformazione usato abitualmente. Il metodo è stato costantemente migliorato per ottenere una maggiore efficienza per la trasformazione genetica e per il targeting dei loci genici adatti attraverso il gene editing. La preparazione dei protoplasti richiede la rimozione della parete cellulare, che si ottiene principalmente attraverso il trattamento enzimatico. Sono stati riportati anche metodi non enzimatici per preparare i protoplasti, come i metodi fisici che includono la macinazione e l’onda d’urto supersonica. Tuttavia, non sono ampiamente utilizzati a causa della scomodità pratica e della bassa resa dei protoplasti. Un riassunto dei protocolli di trasformazione mediati da protoplasti per diverse specie fungine sono forniti nella tabella 1.

Passi fondamentali del metodo PMT

PMT fu applicato per la prima volta a Saccharomyces cerevisiae. I ricercatori hanno preparato i protoplasti con la chiocciola commerciale e hanno usato il sorbitolo per conservare i protoplasti. Più tardi, tale metodo è stato applicato ai funghi filamentosi, come Neurospora crassa e A. nidulans. Anche se i metodi di trasformazione sono stati migliorati, i passi fondamentali rimangono essenzialmente gli stessi. I passi fondamentali del metodo PMT sono forniti nella Fig. 1.

Passi fondamentali della trasformazione mediata da protoplasti

Preparazione dei protoplasti

Il primo passo nella preparazione dei protoplasti è la rimozione della parete cellulare tramite digestione enzimatica. La parete cellulare dei funghi è composta da glucano, mannano e chitina. La struttura della parete cellulare dei funghi è altamente dinamica, e la parete cellulare varia durante la divisione cellulare e la crescita dei funghi, così come nella germinazione delle spore, nella ramificazione ifale e nella formazione del diaframma. I componenti della parete cellulare sono anche diversi nelle diverse specie di funghi, quindi, vari enzimi dovrebbero essere usati in combinazione. È stato riportato che la selezione di una miscela appropriata di enzimi è un fattore chiave nella preparazione dei protoplasti.

In generale, le ife sono sensibili a un enzima adatto che idrolizza la loro parete cellulare durante la fase logaritmica. Nella procedura PMT di Neurospora, i protoplasti sono preparati idrolizzando le ife appena nate (cultura per 4-6 ore a 25-30 °C). Allo stesso modo, i protoplasti possono essere preparati anche con le conidiospore. Ad esempio, per Aspergillus e Penicillium, si possono scegliere spore germinali o talli.

I protoplasti sono sensibili alla pressione osmotica, bisogna fare attenzione a mantenere una pressione osmotica stabile per mantenere i protoplasti intatti durante l’enzimolisi delle pareti cellulari. Così, gli stabilizzatori osmotici (come sorbitolo, cloruro di sodio e cloruro di potassio) dovrebbero essere inclusi in tutti i buffer per la preparazione dei protoplasti per evitare la rottura delle cellule. Per esempio, la soluzione di sorbitolo con una concentrazione di 0,8-1,2 M è usata nella preparazione dei protoplasti di N. crassa, Aspergillus sp. e Trichoderma sp. per mantenere la stabilità osmotica dei protoplasti. Un riassunto dei parametri di preparazione dei protoplasti per alcune specie fungine comuni sono forniti nella tabella 2.

Assorbimento del DNA esogeno

La soluzione usata per sospendere i protoplasti contiene solitamente ioni calcio e stabilizzatori osmotici. Si pensa che il calcio apra dei canali nella citomembrana, il che facilita l’entrata del DNA esogeno nella cellula, mentre gli stabilizzatori osmotici sono necessari per mantenere la morfologia dei protoplasti. Di solito, una certa quantità di polietilenglicole (PEG) viene aggiunta insieme al DNA purificato (che può essere sia il DNA circolare a doppio filamento che il DNA linearizzato). Il PEG è un promotore di fusione cellulare comunemente usato. Può formare il ponte molecolare tra le cellule o tra la citomembrana e il DNA, e quindi promuove l’adesione. Inoltre, può anche indurre cariche disordinate sulla superficie della citomembrana, alterare la permeabilità della membrana e facilitare l’ingresso di acidi nucleici esogeni nelle cellule.

PEG è un agente cruciale che migliora l’efficienza di trasformazione. Una bassa efficienza di trasformazione nella maggior parte dei casi può essere migliorata aggiungendo più PEG. In condizioni normali, la performance del PEG a basso peso molecolare (come il PEG3000) è superiore a quella del PEG ad alto peso molecolare (come il PEG8000). Tuttavia, questo deve essere ottimizzato per varie specie.

L’efficienza di trasformazione è anche influenzata dalla temperatura. In generale, la miscela di DNA e protoplasti dovrebbe essere messa in ghiaccio per 15-30 minuti, in modo che il DNA possa aderire alla superficie dei protoplasti.

Rigenerazione dei protoplasti

Per garantire un buon recupero dei protoplasti vitali, i protoplasti sono lasciati recuperare sulla piastra senza pressione di selezione per un certo tempo prima di essere trasferiti su una piastra selettiva. Uno stabilizzatore osmotico dovrebbe essere incluso nella coltura di rigenerazione. La pressione osmotica stabile è il fattore chiave per i protoplasti per rigenerare la parete cellulare. Solo i protoplasti che portano acidi nucleici esogeni possono crescere sul terreno selettivo.

Commenti sul metodo PMT

Il metodo di trasformazione dei protoplasti è semplice ed efficace e non richiede attrezzature costose. Ma il protocollo comporta molti passaggi e reagenti critici. Ogni passo deve essere ottimizzato e la qualità dei reagenti deve essere testata criticamente. Lo stato di crescita dei funghi da trasformare deve essere attentamente monitorato. L’esperienza è fondamentale per il successo dell’implementazione di questo metodo.

Trasformazione mediata da Agrobacterium (AMT)

Agrobacterium è un batterio Gram-negativo comunemente presente nel suolo. L’Agrobacterium tumefaciens può infettare le piante ferite. Il plasmide che induce il tumore di > 200 kb, che è anche chiamato plasmide Ti, potrebbe essere isolato nella fase iniziale dell’infezione. Quando A. tumefaciens infetta una pianta, entra nella pianta attraverso la ferita e integra parte del plasmide Ti nel genoma delle cellule vegetali infette. Il frammento di DNA integrato dal plasmide Ti è comunemente chiamato DNA di trasferimento o T-DNA. Il T-DNA si inserisce nel genoma della pianta in modo casuale come monoclonale. Il T-DNA è fiancheggiato da due ripetizioni imperfette direzionali (chiamate bordo sinistro e destro) e contiene geni che codificano enzimi responsabili della formazione di ormoni vegetali, che causano la crescita tumorale. Un vettore binario è stato progettato per avere il gene bersaglio inserito tra i bordi sinistro e destro del T-DNA, e il plasmide ricombinante è stato trasformato nell’Agrobacterium tumefaciens. Il clone di Agrobacterium positivo è stato usato come veicolo per integrare il gene target nel genoma fungino. Le fasi specifiche saranno discusse in dettaglio qui di seguito.

Il metodo AMT ha dimostrato di essere più stabile ed efficiente dei metodi di trasformazione convenzionali da quando il primo documento ha riportato che questo metodo potrebbe essere applicato alla trasformazione fungina. Il metodo AMT è stato applicato per la prima volta per trasformare S. cerevisiae. Un plasmide che porta un gene di resistenza all’igromicina è comunemente usato per trasformare Aspergillus awamori. Il metodo AMT è stato applicato a molti Ascomiceti, tra cui l’Aspergillus , e Monascus purpureus . I passi fondamentali del metodo AMT sono forniti nella Fig. 2. Un riassunto del protocollo di trasformazione mediato da Agrobacterium per diverse specie di funghi è fornito nella tabella 3.

I passi fondamentali della trasformazione mediata da Agrobacterium

Fattori che influenzano l’efficienza AMT

Molti fattori influenzano l’efficienza AMT, tra cui il tipo di materiale fungino di partenza (protoplasto, spora, ifa e tessuto del corpo del frutto), la concentrazione dell’acetosiringone, il rapporto tra fungo e Agrobacterium e le condizioni di co-cultura.

1. Il tipo di materiale fungino di partenza Il metodo AMT può usare i protoplasti, le spore, le ife e il tessuto del corpo del frutto dei funghi come ricevente. I materiali di partenza appropriati dovrebbero essere selezionati per i diversi ceppi. Per esempio, il metodo AMT funziona solo per i protoplasti di Rhizopus. oryzae e Mucor circinelloides, mentre le spore o le spore germinali non produrrebbero trasformanti.

2. La concentrazione di acetosiringone (AS) AS agisce su due fasi durante il processo AMT. Uno è il processo di induzione e l’altro è il processo di trasformazione. AS è generalmente usato per indurre l’espressione del dominio Vir del T-DNA, e il gene nel dominio Vir attiva il trasferimento del T-DNA. Numerosi studi hanno dimostrato che una quantità adeguata di AS era necessaria durante il processo di trasformazione. Tuttavia, l’aggiunta di AS non è assolutamente necessaria durante la fase di precoltura dell’Agrobacterium, che potrebbe ridurre l’efficienza di trasformazione per alcuni ceppi. La concentrazione di AS è un fattore importante che influenza l’efficienza di trasformazione durante il processo di co-coltura del fungo-Agrobacterium nell’AMT di Aspergillus awamori.

3. Il rapporto tra funghi e Agrobacterium Entro certi limiti, l’efficienza di trasformazione raggiungerà il livello massimo con l’aumento della quantità di fungo o Agrobacterium. Un rapporto ottimale per l’AMT per diversi funghi deve essere determinato empiricamente. Il rapporto tra cellule fungine e batteriche dovrebbe essere ottimizzato per diversi sistemi di trasformazione fungo-Agrobacterium.

4. Le condizioni di co-cultura Le condizioni di co-cultura sono un fattore importante nel metodo AMT. Questo include il tempo di coltura, la temperatura, il pH, e la selezione del filtro. La temperatura e il tempo di co-cultura sono i fattori chiave tra le fasi dell’AMT. Nella trasformazione fungo-Agrobacterium, una condizione appropriata per iniziare è una temperatura di 20-28 °C e un tempo di co-coltura di 16-96 h. Una temperatura più bassa (20-25 °C) è solitamente vantaggiosa per il metodo AMT. Il filtro, che è idrofilo e serve come supporto per la co-coltura fungo-Agrobacterium, facilita il trasferimento di singole colonie alla piastra di screening. Una membrana di nitrocellulosa, una membrana di nylon, carta da filtro, cellophane e una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) possono essere usate come filtro.

Commenti sulla trasformazione mediata da Agrobacterium

Il metodo AMT apre una nuova strada per quei funghi recalcitranti alla trasformazione con metodi convenzionali. Il metodo AMT è particolarmente adatto a generare mutazioni knock-in nei funghi perché il T-DNA si inserisce casualmente nel genoma come una singola copia. Inoltre, AMT può raggiungere un’alta efficienza di ricombinazione omologa in vari esperimenti di targeting genico.

I principali vantaggi del metodo AMT includono: in primo luogo, destinatari di trasformazione diversificati, tra cui protoplasti, ife e spore; in secondo luogo, la capacità di integrare i geni esogeni nel genoma per formare trasformanti stabili; e in terzo luogo, alta efficienza di trasformazione con conseguente un gran numero di trasformanti.

Il metodo AMT richiede vettori binari, che sono noiosi da preparare. Più fattori devono essere presi in considerazione nell’ottimizzazione del processo di trasformazione. Questa è una grande limitazione del metodo AMT.

Trasformazione per elettroporazione

L’elettroporazione è un metodo di trasformazione semplice, rapido ed efficiente per i funghi filamentosi. Nell’elettroporazione, le cariche elettriche sono immagazzinate in un condensatore per costruire un’alta tensione, il campione è colpito dalla tensione d’impulso, e l’acido nucleico esogeno può essere trasferito istantaneamente nelle cellule. Di solito, le onde quadrate o le onde di decadimento esponenziale sono utilizzate nella trasformazione dei funghi. Gli impulsi di decadimento esponenziale sono generati semplicemente caricando e scaricando un condensatore. Il campo elettrico diminuisce esponenzialmente dal valore di picco. Un’onda quadra è una forma d’onda periodica non sinusoidale (che può essere rappresentata come una sommatoria infinita di onde sinusoidali), in cui l’ampiezza si alterna ad una frequenza costante tra valori minimi e massimi fissi. Forme d’onda diverse di elettroporazione sono utilizzate per specie diverse. Un riassunto delle forme d’onda utilizzate nell’elettroporazione per diverse specie è fornito nella tabella 4.

Quando una cellula è esposta al campo elettrico, la struttura della citomembrana sarà modificata con una tensione indotta tra la citomembrana. Si possono formare micropori nella citomembrana dopo la scossa elettrica. La permeabilità della parete cellulare indotta è reversibile entro le soglie della tensione e della durata, altrimenti, causerà lesioni irreversibili alle cellule. Pertanto, i micropori nella citomembrana sembrano avere due modelli dopo lo shock elettrico, il modello reversibile e quello irreversibile. Le molecole lipidiche e proteiche nella citomembrana possono ripristinare la struttura originale quando viene applicata un’intensità di campo appropriata, mentre lo shock elettrico irreversibile darà luogo a irreparabilità o a un recupero estremamente lento, che alla fine porta alla morte cellulare. Il DNA esogeno può essere trasferito nel batterio, nel protoplasto della pianta, nella cellula animale e nei funghi filamentosi attraverso l’elettroporazione. Questo metodo è stato applicato con successo a più funghi. Ozeki et al. hanno scoperto che le spore germinali sono più adatte alla trasformazione per elettroporazione. Negli ultimi anni, l’elettroporazione è diventata un metodo affidabile per la trasformazione genica di alcuni ceppi comuni. Un riassunto dei protocolli di trasformazione mediati dall’elettroporazione per diverse specie fungine è fornito nella tabella 5.

Fattori che influenzano la trasformazione mediante elettroporazione

Parametri di elettroporazione

1. Intensità del campo elettrico L’intensità del campo elettrico è il fattore più importante che influenza l’efficienza di elettroporazione. Quando l’intensità del campo elettrico applicato raggiunge la grandezza di kV/cm e la larghezza dell’impulso su scala μs-ms, la citomembrana sarà cambiata e molti micropori saranno generati sulle pareti cellulari. L’alta intensità del campo elettrico è associata a un alto tasso di assorbimento degli acidi nucleici esogeni e a un tasso di sopravvivenza cellulare inferiore. Tuttavia, vari tipi di cellule richiedono diverse intensità di campo elettrico a causa delle differenze nei componenti della citomembrana. Pochi micropori si formano quando l’intensità del campo elettrico non supera la soglia richiesta. Al contrario, un’eccessiva intensità del campo elettrico provocherà danni irreversibili alla citomembrana, portando alla morte cellulare.

2. Capacità Durante il processo di elettroporazione, la variazione delle cariche elettriche e l’intensità del campo elettrico applicato alla sospensione cellulare dipendono dalla capacità e dalla durata dell’impulso. L’intensità e la durata dell’impulso sono anche influenzati dalla capacità, quindi, una maggiore capacità ha migliori effetti di trasformazione.

3. Durata e frequenza dell’impulso La durata della perforazione sulla citomembrana, che è direttamente collegata all’efficienza di trasformazione dell’elettroporazione, è influenzata dalla durata dell’impulso e dalla frequenza.

Ambiente di elettroporazione e fattori esterni

1. Soluzione tampone La soluzione tampone fornisce un ambiente importante per l’elettroporazione delle cellule, e il valore di pH della soluzione tampone di shock elettrico è di grande importanza. Normalmente, viene usato un tampone di pH 7.0. Le cellule sono facilmente perforate e uccise a pH superiore a 7.0.

2. Temperatura Una grande quantità di calore viene prodotta durante il processo di elettroporazione, che sarà rilasciata nella soluzione tampone. Pertanto, una temperatura ridotta (0-4 °C) è raccomandata per un effetto migliore. Inoltre, il bagno di ghiaccio nella miscela pre-elettroshock può anche migliorare l’efficienza dell’elettroshock.

3. Concentrazione di acido nucleico esogeno Nel complesso, l’efficienza di elettroporazione aumenta con la concentrazione di acido nucleico esogeno. Il DNA compatto a superelica entra più facilmente nelle cellule attraverso la citomembrana. Nel 1995, uno studio ha riportato che ogni 1 μg di DNA plasmidico potrebbe generare 100 trasformanti per A. niger.

Commenti sul metodo di elettroporazione

Il metodo di elettroporazione è stato ampiamente applicato a numerosi tipi di cellule, compresi procarioti ed eucarioti. Questa tecnologia ha il potenziale per essere il metodo di scelta per la trasformazione di specie fungine inesplorate. Rispetto al metodo PMT, dove sono coinvolti passaggi complicati, l’elettroporazione è semplice e più conveniente. Tuttavia, il meccanismo di elettroporazione rimane ancora poco chiaro. Il tasso di perforazione della citomembrana dipende da molti parametri del campo elettrico. Inoltre, richiede condizioni tampone adeguate per essere efficace in modo ottimale.

Trasformazione biolistica

La trasformazione biolistica è anche conosciuta come bombardamento di particelle. Il suo principio è che il DNA estraneo viene adsorbito sulla superficie di particelle di tungsteno o d’oro. Sotto la spinta dell’alta pressione, le particelle vengono iniettate nelle cellule ospiti. Il bombardamento di particelle può realizzare sia la trasformazione stabile che quella transitoria.

Vari fattori influenzano l’efficienza del bombardamento in modelli di interazioni complesse. I parametri biologici (tipo di cellule, condizioni di crescita e densità cellulare) e le impostazioni strumentali (tipo e dimensione delle particelle, livello di vuoto e pressione, distanza del bersaglio) sono variabili importanti. Non è soggetto alle limitazioni dei tipi di cellule dell’ospite o delle specie. Per i funghi, il bombardamento di particelle è sufficientemente efficiente per quegli organismi che sono difficili da coltivare o da cui i protoplasti sono difficili da preparare. Il bombardamento di particelle è facile e conveniente da utilizzare. Tuttavia, gli strumenti e i materiali di consumo per il bombardamento di particelle sono costosi. Sarà considerato solo nel caso in cui altri metodi non funzionino. Attualmente, il bombardamento di particelle è stato utilizzato per trasformare con successo A. nidulans e T. reesei, ecc.

Trasformazione mediata da onde d’urto (SWMT)

SWMT utilizza il principio di trasformazione e trasmissione dell’energia per generare un disturbo transitorio della pressione e una forza di torsione attraverso le cellule per formare un effetto di cavitazione transitorio. Questo metodo è stato applicato nel trattamento medico come l’ortopedia e la frantumazione dei calcoli renali. SWMT cambia la permeabilità delle membrane cellulari attraverso la cavitazione acustica con conseguente assorbimento dell’acido nucleico esogeno nelle cellule. Il metodo è stato utilizzato con successo per introdurre acido nucleico esogeno in Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium. Nel 2013, Denis Magaña-Ortíz et al. hanno riportato per la prima volta l’applicazione di SWMT per i funghi, tra cui A. niger, Fusarium oxysporum, e Phanerochaete chrysosporium . In questo articolo, sono stati notati tre vantaggi del metodo SWMT. In primo luogo, rispetto ai metodi di trasformazione convenzionali, questo metodo è in grado di agire direttamente sulle spore ma non sui protoplasti. In secondo luogo, i parametri fisici erano facilmente controllabili, solo il numero di spore, l’energia e la velocità dell’onda d’urto dovevano essere controllati con precisione. In terzo luogo, l’efficienza di trasformazione era eccellente. I risultati di Denis Magaña-Ortíz et al. hanno indicato che, rispetto al metodo di trasformazione di Agrobacterium, il metodo SWMT potrebbe migliorare l’efficienza di trasformazione di 5400 volte per A. niger. Poiché una grande proporzione di DNA è danneggiata nel trattamento con onde d’urto, l’efficienza di trasformazione determinata dal rapporto tra DNA e cellule era piuttosto bassa. Tuttavia, per il numero di cellule coinvolte, l’efficienza di trasformazione era significativamente più alta. Nel valutare l’efficienza, bisogna considerare due aspetti: la quantità di DNA e il numero di cellule. Per esempio, nell’esperimento eseguito da Magana-Ortiz et al. , in generale, il DNA plasmidico utilizzato nella trasformazione dei protoplasti e nell’elettroporazione è di circa 1-10 μg . È costoso e scomodo per produrre tale quantità enorme di plasmide in laboratorio per il metodo SWMT. Inoltre, le fonti e gli strumenti a onde d’urto sono costosi perché sono progettati principalmente per scopi medici. Questo risulta essere un grosso ostacolo all’adozione di questo metodo in un laboratorio di microbiologia con risorse limitate.