Risultati e discussione

Il nostro nuovo metodo AMHS è facilitato dalla struttura anatomico/funzionale del sistema circolatorio delle api. La circolazione è forzata dalla contrazione pulsatoria dei diaframmi dorsale e ventrale, che pompano l’emolinfa nel cuore. Successivamente, l’aorta trasporta l’emolinfa nella testa (Fig 1F), fornendo emolinfa al cervello e alle antenne dell’ape.

Rispetto al TCHS, l’AMHS ha permesso la raccolta di 80-100 μL di emolinfa sterile in un tempo più breve e da un numero minore di individui, che riduce al minimo il rischio di melanizzazione. Crediamo che durante la raccolta di emolinfa, è importante ridurre al minimo il tempo di contatto con l’aria. Il rischio di melanizzazione si riduce con un tempo di raccolta più breve e una progressione più rapida alla fase di raffreddamento. Oltre al tempo di raccolta ridotto, l’uso ridotto di insetti è un altro vantaggio sostanziale dell’AMHS rispetto al TCHS. La ricerca sugli apidi dovrebbe sempre essere progettata per ridurre al minimo il numero di api che devono essere danneggiate. L’uso della AMHS per ridurre il numero di api necessarie per raccogliere un volume di emolinfa richiesto è coerente con i principi guida per un uso più etico degli animali nella ricerca.

I nostri risultati attuali hanno anche mostrato che la dimensione più grande dell’insetto è stata associata con un campionamento di emolinfa più facile e veloce, e con maggiori volumi di emolinfa raccolti (Tabella 1). Il prelievo di emolinfa da Apis mellifera carnica e Apis cerana ha richiesto più tempo e più insetti rispetto al prelievo di emolinfa dai bombi, in quanto le prime specie sono notevolmente più piccole e hanno meno emolinfa.

L’emolinfa è più spesso acquisita con capillari utilizzando vari metodi, per esempio, perforando il cuore, il seno toracico dorsale o ventrale, o l’aorta dorsale. Ognuna di queste procedure comporta il rischio che il ventricolo venga forato, portando alla contaminazione del campione con il contenuto dell’intestino. Tale contaminazione non solo rende il campione inutilizzabile, ma richiede anche che il capillare debba essere sostituito con uno nuovo o pulito e disinfettato prima dell’uso successivo, aumentando così il tempo complessivo di raccolta dell’emolinfa. La sterilità dell’emolinfa può anche essere compromessa dalla perforazione della membrana che collega i segmenti dell’addome. L’uso dell’AMHS elimina questi problemi legati al capillare. Inoltre, la raccolta di emolinfa tramite decapitazione può contaminare l’emolinfa con il nettare che fuoriesce dallo stomaco dell’ape. Il nostro nuovo AMHS ha prodotto campioni di emolinfa di alta qualità biologica. Gli emociti erano chiaramente visibili in ogni campione di emolinfa acquisito dalla AMHS (Fig 1C). L’analisi di ogni vetrino da microscopio ha rivelato che i campioni di emolinfa acquisiti con la AMHS erano puri e trasparenti, senza alcuna contaminazione (ad esempio, granelli di polline).

Ci aspettavamo che nella performance della AMHS, la disinfezione con etanolo e il contatto limitato tra la goccia di emolinfa e il corpo dell’ape avrebbero garantito la sterilità del campione. Questa aspettativa è stata confermata dai test microbiologici. L’incubazione dell’emolinfa acquisita dalla AMHS su entrambi i terreni MRS e Sabouraud agar ha confermato la sterilità dell’emolinfa. Non è stata osservata alcuna crescita di microrganismi su nessuna delle 100 gocce di emolinfa placcate. Pertanto, qui non vengono presentati risultati quantitativi. Dopo aver terminato il periodo di incubazione, abbiamo osservato solo cerchi marrone scuro di emolinfa melanizzata intorno ad ogni goccia. Questa melanizzazione si è verificata durante il periodo di incubazione, non durante il campionamento (Fig 1D e 1E). In particolare, quando l’emolinfa raccolta non deve essere utilizzata per i test microbiologici, la fase di disinfezione può essere omessa. È possibile che l’etanolo applicato all’area antennale possa influenzare le attività enzimatiche o ormonali.

Fattori diversi dalla metodologia possono influenzare l’efficienza della raccolta di emolinfa. Nei nostri studi precedenti, abbiamo osservato che la quantità di emolinfa raccolta da un’ape dipende non solo dalla casta e dall’età dell’ape, ma anche dal suo grado di idratazione misurato in base al volume di nettare o sciroppo di zucchero consumato prima del prelievo dell’emolinfa. Ptaszyńska et al. riferiscono che il campionamento dei volumi di emolinfa adeguati è meno efficace dalle api più vecchie. Inoltre, l’efficienza del campionamento può dipendere dalle capacità di laboratorio del ricercatore. Questi fattori rendono difficile confrontare le caratteristiche quantitative dei diversi protocolli di campionamento dell’emolinfa tra studi effettuati in diversi laboratori e utilizzando diversi organismi. In particolare, nelle nostre indagini precedenti, abbiamo campionato l’emolinfa di migliaia di api utilizzando AMHS, così come altri metodi, tra cui TCHS . Il personale del nostro laboratorio ha una notevole esperienza nella raccolta di emolinfa da api di diverse età e caste. Questa esperienza ci ha aiutato a confrontare i diversi metodi di campionamento, poiché i nostri risultati non sono stati influenzati da errori dovuti a competenze variabili del personale di laboratorio. I nostri risultati attuali hanno indicato che l’AMHS era un metodo efficiente, pulito e altamente accurato (Tabella 1) che richiedeva meno tempo del TCHS.

Il campionamento dell’emolinfa con metodi diversi dall’AMHS richiede tipicamente attrezzature aggiuntive, come i tubi microcapillari. Inoltre, la rimozione dell’emolinfa dai tubi microcapillari richiede l’uso di una pompa speciale, o lo schiacciamento dei tubi e la centrifugazione con perline. Un altro vantaggio dell’AMHS è la possibilità di utilizzare una bilancia a pipetta per misurare il volume di emolinfa raccolto da ogni singola ape. Questo è particolarmente utile quando si esegue l’analisi biochimica di micro-campioni, ad esempio, per determinare le attività enzimatiche. Vale la pena notare che quando si applicano metodi diversi da AMHS , il volume di emolinfa pura può essere calcolato indirettamente, sulla base del volume del diluente emolinfa in un tubo prima del campionamento e il volume misurato del diluente emolinfa dopo il campionamento. Tuttavia, tale metodo può portare a un ulteriore errore; pertanto, alcuni ricercatori utilizzano le siringhe Hamilton. L’AMHS evita la spesa e il lavoro aggiuntivo (ad esempio, l’intasamento della siringa, la disinfezione, ecc.) dell’uso delle siringhe Hamilton.

Il metodo di Mayack e Naug (l’emolinfa viene acquisita facendo girare le api con le antenne tagliate) è simile all’AMHS. Tuttavia, il loro metodo richiede sia una centrifuga di laboratorio, e le parti della bocca delle api dovevano essere incollate per evitare ogni possibile contaminazione. Inoltre, nel loro studio, hanno sezionato le budella delle api per valutare l’infezione da Nosema ceranae prima di centrifugare le api. Senza questo passo, le budella sarebbero una probabile fonte di contaminazione. Il loro metodo consiste nel mettere le api in provette da centrifuga e farle girare a 16.000 RCF per 30 secondi per ottenere l’emolinfa. Questo processo potrebbe stratificare i componenti dell’emolinfa (ad esempio, proteine ed emociti) e comporta maggiori rischi di contaminazione microbiologica e di melanizzazione dell’emolinfa (vedi discussione sopra). Mentre può essere ideale per analizzare i livelli di zucchero dell’emolinfa tra le bottinatrici di api con le budella precedentemente rimosse (come nel loro studio), non è del tutto appropriato per studi microbiologici e genetici o indagini sulle attività enzimatiche. In questo contesto, il nostro nuovo metodo AMHS è più adatto per uso generale, essendo facile e semplice, e probabilmente applicabile in una vasta gamma di diversi tipi di studi.