L’illuminazione sulla superficie terrestre varia di >10 ordini di grandezza durante il normale ciclo giorno-notte, e il sistema visivo dei vertebrati copre tutta questa gamma di intensità luminose con due sottosistemi neuronali che si basano sull’attività di due tipi di cellule fotorecettrici, bastoncelli e coni. La visione umana a bastoncelli opera su circa sette ordini decimali di illuminazione. Il sistema visivo dei coni opera su una gamma ancora più ampia (Rodieck 1998). L’adattamento alla luce avviene a tutti i livelli del sistema visivo, dai fotorecettori ai neuroni centrali. Tuttavia, la funzione dell’intero sistema visivo dipende dalla capacità dei fotorecettori stessi di adattare la loro sensibilità alla situazione di illuminazione ambientale. Così, i fotorecettori devono generare segnali affidabili di notte quando i singoli fotoni vengono catturati tra lunghi intervalli di oscurità, e devono anche continuare a segnalare alle intensità luminose molto elevate che si incontrano in una giornata di sole. L’adattamento alla luce dei fotorecettori è probabilmente mediato da meccanismi molecolari multipli e forse ridondanti (Detwiler e Gray-Keller 1992; Lagnado e Baylor 1992; Bownds e Arshavsky 1995; Pugh et al. 1999). Recentemente, Pugh et al. 1999 hanno riassunto nove meccanismi molecolari individuali che si pensa siano coinvolti nell’adattamento e hanno discusso i loro contributi relativi all’intero processo di adattamento. Uno studio degli stessi autori, pubblicato a pagina 795 (Nikonov et al. 2000, questo numero), fornisce il supporto sperimentale alle loro intuizioni e sviluppa ulteriormente un quadro teorico che avrà un impatto sui futuri studi sull’adattamento alla luce dei fotorecettori.
I meccanismi molecolari alla base dell’adattamento alla luce possono essere discussi nel contesto delle reazioni che regolano il cGMP nel citoplasma dei fotorecettori (Hodgkin e Nunn 1988):
La concentrazione intracellulare di cGMP è determinata dal tasso della sua sintesi da parte della guanilciclasi e dal tasso della sua idrolisi da parte della fosfodiesterasi (PDE) cGMP. Questa concentrazione è costantemente monitorata dai canali cGMP-gated situati nella membrana plasmatica del fotorecettore. Nel fotorecettore adattato al buio, viene mantenuta una concentrazione costante di cGMP di pochi micromoli. Questo mantiene una frazione dei canali cationici cGMP-gated della membrana plasmatica esterna aperta e la cellula depolarizzata. La luce fa scendere il cGMP attivando la PDE attraverso la cascata enzimatica che include la rodopsina fotoattivata, la proteina G chiamata transducina e l’enzima effettore PDE. La riduzione della concentrazione di cGMP provoca la chiusura del canale e l’iperpolarizzazione del fotorecettore. Il recupero della risposta alla luce avviene quando la cascata eccitatoria viene disattivata, il livello di cGMP viene ripristinato dalla guanililciclasi e i canali si riaprono. Durante la foto-risposta, la concentrazione intracellulare di Ca2+ diminuisce anche perché la sua entrata attraverso i canali cGMP-gated è bloccata mentre continua ad essere estratta da una molecola di scambio Na2+/Ca2+-K+ situata nella membrana plasmatica. È questo calo di Ca2+ che è stato implicato come il fattore principale alla base dell’adattamento alla luce, perché porta alla regolazione di feedback di vari componenti della cascata di fototrasduzione.
Per illustrare l’importanza dell’adattamento alla luce per la normale funzione dei fotorecettori, consideriamo quanto segue. Affinché i fotorecettori a bastoncello registrino stimoli luminosi minimi, deve essere raggiunto un alto grado di amplificazione del segnale nella cascata rodopsina-transducina-PDE. Per esempio, al picco della risposta dei bastoncelli a un singolo fotone, che si verifica ∼1 s dopo l’assorbimento del fotone, ∼5% dei canali aperti e sensibili alla luce diventano chiusi. Ciò implica che un’illuminazione costante che fornisce solo ∼100 fotoni al secondo chiuderebbe tutti i canali, rendendo la cellula non reattiva a qualsiasi ulteriore stimolazione luminosa. Ma poiché i bastoncelli si adattano alla luce, questa saturazione viene evitata finché l’illuminazione ambientale non produce un tasso di cattura dei fotoni di ∼10.000 fotoni al secondo. L’effetto dell’adattamento è ancora più profondo nei coni: essi non si saturano praticamente mai.
La transizione tra lo stato di adattamento al buio e quello alla luce del fotorecettore è accompagnata da due cambiamenti significativi nelle proprietà fisiologiche dei fotorecettori. In primo luogo, i fotorecettori adattati alla luce sono meno sensibili alla luce, impedendo loro di diventare ciechi ad alti livelli di intensità luminosa. In secondo luogo, i fotorecettori adattati alla luce producono fotorisposte più rapide, migliorando la risoluzione temporale del sistema visivo. È a queste due caratteristiche che il termine “adattamento alla luce” è stato applicato più spesso, e l’opinione prevalente in letteratura suggerisce che i sistemi di feedback del Ca2+ siano alla base di entrambi. Un contributo immensamente importante di Nikonov et al. 2000 è quello di sfidare questa visione. Gli autori hanno esaminato il processo di adattamento alla luce nei fotorecettori dell’asta della salamandra e forniscono prove sperimentali che sia la desensibilizzazione dei fotorecettori che l’accelerazione della risposta sono largamente indipendenti dal feedback di Ca2+. Invece, essi risultano dall’elevata attività della PDE causata da un’illuminazione di fondo costante.
Un effetto dell’attivazione costante della PDE sulla sensibilità assoluta della risposta è piuttosto semplice. Poiché la sensibilità assoluta della risposta è proporzionale al numero assoluto di canali aperti prima del flash, la riduzione del numero di canali aperti causata dall’illuminazione fissa porta automaticamente a una compressione dell’ampiezza della risposta. Tuttavia, la compressione della risposta è una parte relativamente piccola dell’effetto totale dell’attivazione costante del PDE. La fonte principale della riduzione della sensibilità del flash è dovuta all’accelerazione del recupero del segnale causata dall’attivazione del PDE. Formalmente, questa accelerazione avviene perché la costante di tempo della reazione che governa il cambiamento di cGMP indotto dal flash è inversamente proporzionale all’attività specifica del PDE per volume citoplasmatico. Questa costante di tempo è esattamente la stessa costante di tempo che governa il turnover dell’intero pool citoplasmatico di cGMP nelle stesse condizioni di illuminazione.
Quest’ultimo concetto non è intuitivo, e Nikonov et al. 2000 forniscono un’analogia idrodinamica “vasca da bagno” per illustrare questo effetto nella discussione del loro articolo. Forniamo un’altra analogia che potrebbe interessare il lettore familiare con le proprietà dei circuiti elettrici. Consideriamo un circuito elettrico composto da una resistenza variabile, un condensatore e una sorgente di corrente costante. La tensione (V) attraverso il condensatore rappresenta la concentrazione di cGMP. La corrente (i) che carica il condensatore (C) rappresenta il tasso di sintesi del cGMP da parte della guanilciclasi (α, secondo Nikonov et al. 2000), mentre il condensatore rappresenta il volume della cellula. L’attività della PDE è rappresentata dal resistore variabile (R(I)), che è regolato dalla luce (I). La conduttività del resistore, 1/R, rappresenta la somma dell’attività basale oscura della PDE e dell’attività stimolata dalla luce della PDE. La tensione attraverso il condensatore è regolata dall’equilibrio tra l’afflusso di corrente nel circuito e la perdita attraverso il resistore. Le equazioni che descrivono i cambiamenti della tensione nel circuito sono identiche a quelle che descrivono la dinamica della concentrazione di cGMP nella barra.
In questa analogia, una risposta flash è rappresentata dall’introduzione di una breve e transitoria diminuzione di R(I). Questo provoca la caduta della tensione a un certo livello, e poi ritorna esponenzialmente al livello costante con una costante di tempo τ = RC. Poiché 1/RC è equivalente al rapporto tra l’attività stazionaria della PDE e il volume citoplasmatico (β, secondo Nikonov et al. 2000), RC rappresenta la costante di tempo dello scambio del pool citoplasmatico di cGMP. Allora è chiaro che una maggiore attività stabile della PDE riduce questa costante di tempo e porta a un recupero più veloce del cGMP al suo livello di base. Nikonov et al. 2000 dimostrano che questo secondo effetto cinetico dell’attività stabile di PDE pre-flash è il principale fattore responsabile dell’accelerazione della fotorisposta durante l’adattamento alla luce. È importante notare che poiché il circuito è lineare, l’andamento temporale del recupero della risposta “flash” è indipendente dal valore costante della corrente i. I cambiamenti di i semplicemente scalano l’ampiezza della risposta di tensione (cGMP) senza alterare il suo tempo di recupero caratteristico. Così, il livello dell’attività della ciclasi allo stato stazionario, i in questa analogia, non ha alcuna influenza sul tasso di recupero della foto-risposta.
Il recupero accelerato significa che la risposta flash si sviluppa in un periodo di tempo più breve, e questo riduce la sensibilità a un flash sovrapposto a uno sfondo stazionario. Così, l’attivazione del PDE allo stato stazionario riduce la sensibilità del fotorecettore attraverso gli effetti combinati della riduzione della frazione di canali aperti e della riduzione della fotorisposta. Esperimenti eleganti hanno permesso a Nikonov et al. 2000 di quantificare il grado di attivazione del PDE da parte delle luci di fondo fisse. Essi mostrano che, della riduzione di ∼100 volte della sensibilità del flash osservata con le loro intensità di fondo più luminose (vedi Fig. 6 in Nikonov et al. 2000), ∼5 volte è dovuta alla compressione della risposta e ∼15 volte è dovuta all’effetto cinetico dell’attivazione della PDE, con il residuo probabilmente dovuto all’effetto della recoverina che agisce sulla vita della rodopsina attivata.
Avendo attribuito la maggior parte della riduzione della sensibilità dei fotorecettori e l’accelerazione della fotorisposta all’elevata attività della PDE prima del flash, si pone la domanda: che ruolo ha il feedback del Ca2+ nell’adattamento alla luce? La risposta è chiara se teniamo presente che l’attività costante della PDE prodotta dalla luce di fondo causa un aumento sostanziale dell’attività idrolitica del cGMP. Se non ci fossero meccanismi di compensazione, la concentrazione di cGMP si ridurrebbe drammaticamente, anche sotto una moderata illuminazione di fondo, finendo per non lasciare alcun canale aperto per registrare ulteriori cambiamenti di luce. Quindi, il ruolo fondamentale del Ca2+ nell’adattamento alla luce è quello di opporsi a questa saturazione coinvolgendo una serie di meccanismi molecolari che alla fine portano alla riapertura dei canali e, quindi, all’estensione della gamma di intensità della luce su cui opera il fotorecettore (vedi Pugh et al. 1999 per riferimenti e discussioni dettagliate).
Il principale effetto di estensione della gamma del Ca2+ è mediato da un feedback sulla guanililciclasi attraverso le proteine leganti il Ca2+ chiamate proteine attivatrici della guanilciclasi. Il declino del Ca2+ dipendente dalla luce causa un aumento del tasso di sintesi del cGMP che contrasta l’elevata attività costante della PDE durante l’illuminazione di fondo. Questo effetto della luce di fondo costante non deve essere confuso con il feedback dinamico del Ca2+ sulla guanililciclasi durante la risposta al flash che accelera il recupero della risposta al flash. Nikonov et al. 2000 sostengono che l’effetto dell’attivazione dinamica della ciclasi varia poco con le condizioni di luce di fondo e, quindi, non dovrebbe essere considerato un fattore importante nell’adattamento alla luce.
Il secondo effetto di estensione del Ca2+ si rivolge direttamente ai canali cGMP-gated. La diminuzione del Ca2+ fa sì che i canali diventino più sensibili al cGMP, in modo da funzionare a una concentrazione di cGMP inferiore. Questo effetto è probabilmente mediato dalla calmodulina o da proteine simili alla calmodulina, e sembra essere più significativo nei coni che nei bastoncelli (Rebrik et al. 2000). Entrambi questi effetti portano alla riapertura dei canali cGMP-gated durante l’illuminazione fissa senza causare alcun effetto desensibilizzante; invece, risensibilizzano il fotorecettore.
Il terzo feedback del Ca2+ differisce dagli altri perché causa sia un’estensione della gamma che contribuisce alla desensibilizzazione della cellula. La diminuzione del Ca2+ aumenta la fosforilazione della rodopsina attraverso la proteina Ca2+-binding recoverin, portando ad una diminuzione della vita della rodopsina attivata. Questo porta alla desensibilizzazione perché riduce il numero di molecole PDE attivate da ogni rodopsina. L’intervallo operativo si estende anche perché il numero ridotto di PDE attivi si traduce in un ridotto tasso idrolitico costante di cGMP. Sia Nikonov et al. che altra letteratura recente discussa dagli autori dimostrano che, nelle aste, questo meccanismo sembra essere molto meno potente del feedback sulla guanililciclasi.
Un altro importante risultato riportato nel loro articolo è che non c’è indicazione di un quarto meccanismo di feedback del Ca2+ proposto, la regolazione adattativa del guadagno nella cascata tra l’attivazione della rodopsina e la chiusura del canale. Lamb e Pugh 1992 hanno sviluppato un metodo per stimare il guadagno nella cascata di fototrasduzione dall’analisi della fase iniziale di salita delle risposte al flash. Più tardi, altre indagini discusse da Nikonov et al. 2000 hanno mostrato che questa pendenza era diminuita per i flash presentati durante l’illuminazione di fondo o mentre il Ca2+ intracellulare era ridotto artificialmente nel buio, concludendo che questo rifletteva un sistema di feedback del Ca2+ che riduceva il guadagno della cascata durante l’adattamento alla luce. Nell’articolo attuale, Nikonov et al. 2000 mostrano che per intensità di luce di fondo che chiudono fino all’80% dei canali sensibili alla luce e provocano una riduzione di circa cinque volte del Ca2+ intracellulare, la fase iniziale di aumento delle risposte flash, infatti, non viene modificata. Essi concludono che l’apparente riduzione dell’amplificazione indotta dalla luce di fondo o dalla riduzione del Ca2+ intracellulare descritta in letteratura è probabilmente dovuta all’aumento del livello costante dell’attività della PDE e all’aumento del tasso di estinzione della rodopsina fotoeccitata che fanno sì che la fotorisposta si stacchi da una traiettoria iniziale invariante in tempi molto precoci.
Nikonov e colleghi ora sostengono che il feedback di Ca2+ nell’adattamento alla luce serve quasi esclusivamente per aumentare la sensibilità dei fotorecettori piuttosto che come meccanismo di desensibilizzazione dei fotorecettori. Anche se questo può sembrare paradossale, l’effetto sensibilizzante dell’estensione della gamma mediata dal feedback del Ca2+ era evidente fin dalle prime pubblicazioni che hanno dimostrato l’importanza del declino del Ca2+ indotto dalla luce per l’adattamento alla luce (Matthews et al. 1988; Nakatani e Yau 1988). In questi studi, l’inibizione del feedback di Ca2+ durante l’illuminazione di fondo costante ha causato una riduzione catastrofica della sensibilità al flash. Il feedback di Ca2+ ha largamente impedito la perdita di sensibilità e ha esteso la gamma operativa del fotorecettore di ∼100 volte (vedi Figura 2 in Matthews et al. 1988). L’eleganza dell’articolo di Nikonov et al. 2000 è che hanno trovato un modo chiaro per distinguere i ruoli dei meccanismi di desensibilizzazione e di sensibilizzazione nel processo generale di adattamento.
Questo ci riporta alla definizione di adattamento alla luce nei fotorecettori. Come abbiamo detto sopra, l’adattamento è solitamente definito come una combinazione di desensibilizzazione delle cellule e accelerazione della risposta. La logica di Nikonov et al. 2000 suggerisce che è necessario ridefinire l’adattamento per includere tre fenomeni interconnessi: desensibilizzazione delle cellule, accelerazione della risposta ed estensione della gamma operativa. I singoli meccanismi molecolari possono contribuire a una o più di queste tre caratteristiche. Come descritto da Pugh e colleghi nel 1999, la desensibilizzazione nei bastoncelli comporta un aumento dell’idrolisi del cGMP stabile, una compressione del segnale e una diminuzione della durata della rodopsina da parte del Ca2+/recupero. L’accelerazione della risposta comporta un aumento dell’idrolisi del cGMP stabile e una diminuzione della durata della rodopsina. L’estensione dell’intervallo coinvolge tre processi Ca2+-dipendenti: un aumento della sintesi di cGMP; un aumento della sensibilità dei canali al cGMP; e un accorciamento del tempo di vita della rodopsina fotoattivata.
Nikonov et al. 2000 forniscono un dettagliato modello matematico della fototrasduzione dei bastoncelli dei vertebrati e dell’adattamento alla luce basato virtualmente su tutti i meccanismi biochimici ben stabiliti. Una modellazione di questo tipo include naturalmente molti parametri che lasciano molto spazio all’ambiguità quando si adattano le risposte. Tuttavia, in questo e in un precedente articolo, Nikonov e colleghi (Nikonov et al. 1998, Nikonov et al. 2000) hanno stimato sperimentalmente molti dei parametri fisiologici e biochimici chiave in modo indipendente. Questo elimina quasi completamente la manipolazione arbitraria dei parametri e aumenta la robustezza delle conclusioni tratte dal modello.
Con la descrizione quantitativa della fototrasduzione e dell’adattamento alla luce che Nikonov et al. forniscono, cosa rimane sconosciuto? Forniamo qui i seguenti tre esempi. In primo luogo, anche se Nikonov et al. non hanno trovato alcuna prova per la regolazione del guadagno di fototrasduzione nelle loro condizioni sperimentali, resta da vedere se la regolazione del guadagno si verifica a livelli di illuminazione più elevati, su una scala temporale più lunga, o in specie diverse. Se così fosse, ciò implicherebbe l’esistenza di ulteriori meccanismi biochimici e componenti molecolari che non sono inclusi nell’attuale schema della fototrasduzione. In secondo luogo, si sa poco sui meccanismi molecolari che sono alla base dell’adattamento alla luce nei coni. I coni sono in grado di coprire una gamma più ampia rispetto ai bastoncelli, e sono virtualmente impossibili da saturare con una luce di fondo continua. Gli studi futuri dovrebbero essere diretti a capire se l’intero adattamento dei coni potrebbe essere spiegato da meccanismi di adattamento forse più efficienti simili ai bastoncelli, o se richiede ulteriori meccanismi unici. In terzo luogo, a un livello più alto dell’elaborazione visiva, non si sa come l’adattamento dei singoli fotorecettori contribuisca all’adattamento dell’intero sistema visivo. Resta da determinare come una delle tre componenti dell’adattamento alla luce dei fotorecettori, la desensibilizzazione delle cellule, l’accelerazione della risposta e l’estensione della gamma di sensibilità, possano far sì che la nostra visione adattata alla luce funzioni più velocemente, con una migliore sensibilità al contrasto e una risoluzione spaziale più alta.