はじめに

ヨーグルトは、乳をLactobacillus属で発酵させることによって調製される乳製品です。 今日、ヨーグルトの治療、予防および栄養特性が広く認められています（Boor、2001年）。 十分な量を投与すれば、プロバイオティクスは宿主に健康上の利益を与え、微生物バランスを向上させます（Fuller, 1989; Guarner et al.） つまり、プロバイオティクスとは、宿主の微生物叢の中で有益な役割を果たす、生きている、非病原性の、友好的な微生物である（Schrezenmeir and de Vrese, 2001）。 乳酸菌（LAB）は、特に乳酸菌属、ビフィズス菌属、腸球菌属の最も重要なプロバイオティクスグループである（Klein et al.、1998）。 乳製品のダイエットや治療の質は、プロバイオティクス微生物によって決定されます（Boor、2001）。

ヨーグルトはプロバイオティクス乳酸菌の潜在的な源です。 ヨーグルトはまた、最も豊富なプロバイオティクス汚染食品として知られています。 乳製品の栄養価は、プロバイオティクス微生物と発酵の結果生成される代謝産物によって増加します。 ヨーグルトの定期的な摂取は、肝臓の過剰な脂肪を減らし、分泌によって向上させる。 また、心臓病、動脈硬化、高血圧や炎症に苦しむ人々のために必要なものです。 ヨーグルトの働きで分泌される胃液は、高い消化能力を発揮します。 さらに、プロバイオティクス微生物の有益な効果、特に乳製品に存在する乳酸菌は、多くの研究者が異なる方法を用いて病原体に対するプロバイオティクス微生物の効果を研究した（Mercenierら、2003）証拠が報告されている。 一般に安全と認められている」（GRAS）ため、食品および非食品産業において幅広く応用されている商業的に重要な細菌である。 乳酸菌は、その特定の有益な特性を改善するために、その分子生物学について広く研究されている（Pouwels and Leer, 1993）。

プロバイオティクスの作用様式は、腸管上皮組織で病原体と結合するプロバイオティクス細菌の能力に基づいています。 プロバイオティクスの抗病原性作用は、pHを低下させる乳酸の生産、過酸化水素の生産と合成バクテリオシンで病原体によって生成された毒素との相互作用で構成されています（Corcionivoschiら、2010）

有効なプロバイオティクス製品は、使用する細菌種の正しい識別と特徴づけを必要とします。 治療的及び栄養的に有用なプロバイオティクス生物の選択は、特定の特性に基づいて行われるであろう（Fuller、1989；Quewand及びVesterlund、2004）。

この研究の目的は、バングラデシュの様々な地域からヨーグルトを収集し、細菌学的および属特異的PCRによる乳酸菌の識別と、病原性細菌の増殖の妨害に続くプロバイオティクス特性の分析であった

材料と方法

サンプル収集と乳酸菌（LAB）の分離。 バングラデシュのチッタゴン市とボグラ市の異なるスーパーから、酸味（サンプルM1、M2、M3）と甘味（サンプルS2）のある2種類のヨーグルトサンプルを採取した。 採取したサンプルは、汚染や劣化を防ぐため、採取後すぐに低温（4℃）の冷蔵庫で無菌的に保管した。 ヨーグルト試料を0.9%食塩水で適切に希釈し、Lactobacillus spp.を分離した。 MRS (Man, Rogosa and Sharpe) brothおよびMRS (Man, Rogosa and Sharpe) agar培地を菌の増殖に使用した。 培地のpHは6.5に調整した。 最後に、コロニーの形態を観察し、グラム染色、カタラーゼおよびオキシダーゼ試験のようないくつかの生化学的試験を行うことにより、Lactobacillusの単一コロニーを単離した。 分離されたコロニーをピックアップし、MRSブロスに移し、37℃でLactobacillusの濃縮を行った。 同定は、Bergeys manual of systemic bacteriologyに記載されている方法に従って行った。 嫌気条件を用いずに、すべての菌株がMRS寒天培地で37℃、48時間よく生育し、乳酸菌の選択的な発育が認められた。 適当な希釈液から代表的な1コロニーを選び、グラム染色反応、コロニー外観、細胞形態、カタラーゼ試験、オキシダーゼ試験、インドール試験、メチルレッド試験、voges-proskauer試験、クエン酸利用試験、糖質発酵パターンをベルギーズマニュアル（Hensyl, 1994）に準じて行い乳酸菌として仮性格を判定した。 ヨーグルトから分離した4検体から古典的な加熱融解法(Salehi et al., 2005)に従ってDNAを抽出した。 MRS寒天培地から純粋な細菌培養物をMRSブロス培地で継代培養し、そこから1.5 mLのブロス培養物をエッペンドルフチューブに取り、10,000 rpmで5分間遠心分離をした。 その後、上清を捨て、ペレットを回収した。 ペレットに約200μLのオートクレーブした脱イオン水を加え、指でシェイクして溶解した。 エッペンドルフチューブのキャップを滅菌針で刺し、100℃のウォーターバスで10分間沸騰させた。 沸騰直後、エッペンドルフチューブを氷中に10分間保持した後、10,000 rpmで10分間遠心分離を行った。 その後、細菌染色体DNAを含む100〜150μLの上清を採取した。

Genus specific PCR amplification: 4株すべての属レベルでの所属を決定するために、Dubernetら(2002)が設計したLbLMA1-rev (5′-CTCAA AACTAAACAAAGTTTC-3′) and R16-1 (5′-CTTGTACACACCG CCCGTCA-3′) primer setを用いてPCRが実施された。 PCR解析は、先に述べたように16-23SリボソームRNA遺伝子間スペーサー領域に基づいて行った（Dubernet et al., 2002）。

反応混合物（20μL）は、10μL 10× PCR Master Mix、6μLのPCR水、2μLのテンプレートと共に添加した各プライマー1μL（100ng μL1）を含んでいた。 実行条件は、95℃での初期変性5分、95℃での変性30秒、55℃でのアニーリング30秒、72℃での伸長30秒、72℃での最終伸長7分の30サイクルである。 生成物は分析まで4℃で保存した。 増幅産物はTAEバッファ（40 mM Tris acetate, 1 mM EDTA, pH 8.2）中の1%アガロースゲルで電気泳動に供された。 ゲルを臭化エチジウム（5μg mL1）で染色し、UVトランスイルミネーター（Biometra GmBH、ドイツ）下で可視化した。

プロバイオティクス特性の分析 プロバイオティクスの特性は、以下の試験を分析することによって決定した。

NaCl耐性試験。 NaCl耐性の測定のために、単離した乳酸菌を、異なる濃度のNaCl（1〜9％）で調整した9本の試験管を含むMRSブロスで増殖させた。 121℃、15Ibsの圧力で15分間オートクレーブした後、各試験管に乳酸菌の10μLオーバーナイト培養物を接種し、37℃で24時間嫌気培養した。24時間培養後、分光光度計を用いて560nmで細菌の増殖を測定した（Graciela and Maruia, 2001）＜8360＞＜1673＞Bile salt tolerance test: 異なるレベル（0.05、0.1、0.15、0.3、0.5%）の胆汁酸塩を含むMRSブロスで細菌培養物の成長速度を測定した。 新たに調製した培養液を培地に1%接種し、嫌気条件下で37℃、24時間培養を行った。 その後、各サンプルの光学密度を分光光度計を用いて560nmで測定した（Graciela and Maruia, 2001）。

増殖のための最適pHの決定。 増殖のための最適pHの決定のために、100μLの新鮮な乳酸菌一晩培養物を、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0の範囲で異なるpHのMRSブロス含有試験管に植菌した。 増殖に対するpHの影響を調べるために、酢酸バッファー（pH-4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5）、トリス-塩酸バッファー（pH-7）およびホウ酸バッファー（pH-8）を使用した。 接種したブロスは嫌気状態で37℃、24時間培養した。 培養後、分光光度計を用いて、接種していない対照ブロスに対して560 nmで細菌の増殖を測定した。

有機酸の定量とpH値の決定 Hoqueら(2010)に従い、分離菌が生産する有機酸の定量とpH値の決定を行った。 10%スキムミルクを添加したMRSブロスに1%(v/v)または100μLの分離菌株を一晩培養し、37℃、72時間嫌気状態で培養し、24、48、72時間ごとに発酵サンプルを採取して凝固乳の液をろ過により分離した。 濾過後、分離した液体のpHをデジタル電極pHメーターを用いて記録し、有機酸の定量はpH指示薬としてフェノフタリンを用いた0.1N NaOHによる滴定により行った（Hoqueら、2010）

病原菌に対する妨害のスクリーニング。 分離された乳酸菌属、いくつかの病原性細菌に対する抗菌活性は、修正寒天オーバーレイ法によって決定された（Aweenら、2012年）。 本研究では、8種類のヒト病原体、Shigella dysenteriae、Bacillus cereus、Pseudomonas aeruginosa、Bacillus megaterium、Staphylococcus aureus、Vibrio cholerae、 Escherichia coli、Shigella sonneiを試験病原体として使用した。 抗菌活性はさらに静菌性か殺菌性かを判断することによって特徴づけられた。 試験は、増殖阻止域のスワッピングにより行った。 このスワブを栄養寒天培地プレート上にストリークし、37℃で72時間好気的に培養した。栄養寒天培地プレート上に増殖がある場合、抑制活性すなわち静菌性と解釈し、増殖がない場合、殺菌性と解釈した＜8360＞ ＜1673＞RESULTS AND DISCUSSION 4つの分離菌はMan, Rogosa and Sharpe (MRS) 培地でpH 6.5で培養された。

その後、すべての分離株を明視野顕微鏡で観察し、顕微鏡的な特徴を観察した。 これらの分離株は、グラム陽性、短・中棒状の無芽胞性細菌（図1a-d）であり、Lactobacillus属の一員であることがわかった（Thamaraj and Shah, 2003）。

さらに、Bergeys manual systematic bacteriology (Hensyl, 1994)で定義されているように、カタラーゼテスト、オキシダーゼテスト、インドールテスト、メチルレッド（MR）テスト、Voges Proskauer（VP）テスト、クエン酸利用テスト、糖質発酵パターンなどのいくつかの生化学テストを実行しました。

分離菌はカタラーゼとオキシダーゼ陰性であり、IMViC（インドール、メチルレッド、ボーゲスプロスカウアー、クエン酸利用）試験でもすべての分離菌が陰性と判明し、これらにより分離菌がLactobacillus spp.と確認できるかもしれない（Dhanasekaran et al, 8360>

本研究では、4つの分離株すべてが11種類の炭水化物、すなわちグルコース、スクロース、フルクトース、ラクトース、キシロース、リボース、ガラクトース、マルトース、マンニトール、ラムノース、デキストロースを発酵できることから、異なるタイプの炭水化物を利用して様々な生息環境で増殖できることが示唆された。 すべての細菌学的および生化学的試験の結果を表1にまとめた。 これらの結果はすべてChowdhuryら(2012)の知見と関連することがわかった。

属特異的PCRによる分子識別：本研究では、Lactobacillusの16SリボソームRNA遺伝子と23SリボソームRNA遺伝子間のスペーサー領域の塩基配列間の類似性を分析し作成した属特異的プライマー (Dubernet et al., 2002)を使用した。 この属特異的プライマーとユニバーサルプライマーを組み合わせて、様々な由来を持つ23株のLactobacillusに対してその特異性を検証した。 PCR産物は1%アガロースでゲル電気泳動し、UVトランスイルミネーターで可視化した。 各試料（M1、M2、M3、S2）には、Lactobacillus属の16-23S rRNA intergenic spacer領域（Dubernet et al, 2002）に相当する200 bpの鋭いバンドが検出された。 また、鋳型を含まない陰性対照ではバンドが得られなかったことから、4つのPCR産物はすべて鋳型DNAに対応するものであることが示唆された（図2）。 プロバイオティクス細菌は、有機酸、H2O2、細菌の代謝に影響を与えるバクテリオシンや毒素産生など、抗菌作用を有する様々な物質を産生する（Rafter, 2003; Rolfe, 2000; Vandenbergh, 1993）。

グラム染色後の乳酸菌の顕微鏡写真（40倍）。 グラム陽性菌は紫色に染色

このためには、NaClや胆汁酸塩のような腸内の悪条件に耐えられる必要がある。 ヨーグルトから分離したLactobacillus spp.は、1-9%のNaClに耐えることができた。 分離株のNaCl耐性を調べるために、光学密度を560 nmで測定し、データをプロットした。 分離株M1、M2、M3、S2は1%NaCl濃度でよく増殖した。 分離株M1、M2、M3、S2の最大成長率（OD）は、1%NaClでそれぞれ1.420、2.143、1.662、2.207であった（Fig. 3）。 8360>

同定されたM1、M2、M3、S2のNaCl耐性試験

NaClはある種の細菌の増殖を抑制する可能性のある阻害物質であることが知られています。 本研究では、ヨーグルトから分離したLactobacillus属は、1〜9％のNaClに耐性を示し、1〜5％のNaClで最適な増殖が観察された（Hoque et al: 単離したLactobacillus spp.は、0.05, 0.1, 0.15, 0.3%の胆汁酸中で生存することができた。 また、分離した乳酸菌は上記の濃度の胆汁酸の中で増殖することができた。 光学密度は560 nmで測定し、データをプロットした。 すべての分離株は0.05%胆汁酸塩濃度で良好に増殖した。 M1、M2、M3およびS2の最大成長率（OD）は、それぞれ1.741、2.213、1.758および2.125であった。 本実験では、ヒトの腸管内に存在する可能性のある0.05-0.3%の胆汁濃度を使用し、健康なヒトに存在する最大胆汁濃度は0.3%であった（Graciela and Maruia, 2001）。 このため、プロバイオティクス細菌を選択する際には、0.3%の胆汁濃度に耐えられることが必要であると報告されている（Gilliland et al.、1984）。 その結果、いずれの菌株も0.3％の胆汁酸塩濃度に対して耐性があり、増殖することができたことから、これらの菌株はプロバイオティクス菌として利用できる可能性があることが示唆された。 ヨーグルトから分離したLactobacillus属は、pH4.0～8.0の範囲で増殖することができた。 光学密度を560 nmで測定し、データをプロットした。 M1、M3、S2はpH6.0でそれぞれ2.201、2.0619、2.237の最大増殖量を示したが、M2はpH6.5で2.259の最大増殖量を示した（図5）。 これらの菌株はpH4.0から8.0の間で増殖することができたが、MRSブロスを用いて37℃で培養した場合、pH5.0から6.5の間で至適増殖が観察された。 この研究から、Lactobacillus属の増殖率は、pH濃度が増加するとある段階で減少すると結論付けることができる（Chowdhury et al, 2012）。

quantification of organic acid and determination pH value.The effect of pH of growth of the identification isolated M1, M2, M3 and S2

有機酸の定量 = V×N×D

ここで、VはNaOHの体積、NはNaOHの強度、Dは希釈倍率である。

この結果から、有機酸の生成量は培養時間とともに増加するが、同時に培地のpHは酸の生成量の増加に伴い減少することがわかった。 結果（表2）から、ボグラヨーグルトから分離したプロバイオティクスLactobacillusは37℃、72時間の培養で最も高い酸度（1.9%）と低いpH3.64が観察された。 チッタゴンの異なるスーパーマーケットのヨーグルトから分離された他のプロバイオティクス細菌は、72時間の培養後、それぞれ最高の酸度1.83、2.11および2.11％、最低pH3.9、3.68および3.65を示した。

乳酸菌による有機酸生産には地域差による小さな変動があり、これらの分離菌がわずかに気候や環境に依存していることを示している（Hoque et al, 2010）。

病原性細菌への干渉をスクリーニングする。 ラクトバチルス、ビフィドバクテリウム、ストレプトコッカス属を含むプロバイオティクスは、ヒトにおける広範囲の腸内病原菌の増殖を抑制することが知られている。 腸内細菌叢の不均衡によって引き起こされる疾患に対する好ましい効果に加えて、Dunneら（2001年）およびWollowskiら（2001年）により、結腸腫瘍の発生に対する細菌のいくつかの実験的観察が報告されています。

本研究では、食品を媒介とする様々な病原性細菌（Shigella dysenteriae、Bacillus cereus、Pseudomonas aeruginosa、Bacillus megaterium、Staphylococcus aureus、Vibrio cholerae、 Escherichia coliおよびShigella sonnei）に対して4菌株の抗菌活性が検討された。 その結果、M1株は72時間培養でBacillus cereus（51.20±1.22mm）に対して最も高い阻害活性を示し、Shigella sonneiに対して最も低い阻害域（23.46±1.00mm）であった。 分離株M2は、72時間培養後、大腸菌に対して最も高い阻止帯径（38.43±1.00 mm）を示し、Bacillus megateriumに対して最も低い阻止帯（20.10±1.00 mm）を示した。 同様に、分離株M3はP. aeruginosaに対して最も高い阻止帯径（42.90±1.20 mm）を示し、S. aureusに対しては最も低い阻止帯（17.83±1.10 mm）であった。 また、分離株S2では、72時間培養後、大腸菌に対して最も高いゾーン（43.80±1.20 mm）、S. aureusに対して最も低いゾーン（21.63±1.10 mm）が観察された。 Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coliに関する結果は、Chowdhuryら（2012）の知見に関連することが分かった。

本研究において、分離株M1、M2、M3、S2については殺細菌および静菌活性に関して満足できる結果が示された。 M1はBacillus megaterium, Vibrio cholera, Shigella sonneiに対して殺菌性を示し，Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, P. aeruginosa, S. aureus, E. coliに対して静菌性を示した。 M2はBacillus cereus, Shigella sonneiに対して殺菌性を示し、Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coliに対して静菌性を示した。 M3はShigella dysenteriae，Bacillus megateriumおよびStaphylococcus aureusに対して殺菌性を示し，Bacillus cereus，Pseudomonas aeruginosa，Vibrio choleraeに対して静菌性を示した。 Escherichia coliおよびShigella sonneiに対して殺菌性を示し、分離株S2はShigella dysenteriae、Bacillus cereus、Pseudomonas aeruginosa、Staphylococcus aureus、Vibrio choleraeおよびShigella sonneiに対して殺菌性を、Bacillus megateriumおよびEscherichia coliに対して静菌性を示しました。

結論

本研究では、Lactobacillus属, を選択的な地域ヨーグルトから分離・同定した。 菌の同定には、いくつかの細菌学的および生化学的な検査を行った。 さらに、Lactobacillus属の16-23S rRNA遺伝子間スペーサー領域に対応する属特異的プライマー（LbLMA-rev）およびユニバーサルプライマー（R16-1）を用いてPCRを行い、細菌学的同定を確認した。 分離されたLactobacillus属細菌は、NaCl（1-9%）や胆汁酸塩（0.05-0.3%）などの阻害物質に耐性を持ち、アルカリ性条件（pH8.0）でも生存可能であった。 これらの菌株（M1、M2、M3、S2）はいずれもグルコース、キシロース、スクロース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、リボース、ラムノース、マンニトール、デキストロースなどの炭水化物を利用できることが確認されました。 さらに、4つの分離株（M1、M2、M3、S2）すべてから分離されたLactobacillus spp.は、乳中で有機酸を生産することができた。 この調査から、乳酸菌による有機酸生産には、地域差によるわずかな差異があることがわかった。 また、4株（M1、M2、M3、S2）ともヒトの一般的な病原性細菌8種類に対して十分な抗菌活性があり、細胞外からバクテリオシンを産生することが分かった。 プロバイオティクスは病原性細菌を抑制し、高塩分、低pH、高胆汁酸塩濃度のようなヒト腸内の過酷な条件にも耐えられるものでなければならない。 分離されたすべてのLactobacillus属菌は、これらの基準を満たすため、ヒトの健康のためのプロバイオティクスとして考えられる

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