要旨

その背景 患者の死亡率を低下させるためには，グラム陽性菌血症の早期発見と適時適切な抗菌薬療法が必要である。 本研究の目的は，2つの特殊な医療環境におけるVerigene Gram-positive blood culture assay（BC-GP）の性能を評価し，日本の医療提供体制におけるグラム陽性菌血症に対する迅速血液培養検査の潜在的影響を明らかにすることであった。 さらに、本研究では、日本のさまざまな地域を反映して十分に特徴づけられたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）およびバンコマイシン耐性腸球菌（VRE）の分離ライブラリーを含む模擬血液培養を実施した。 方法 合計347のBC-GPアッセイを臨床および模擬血液培養に対して実施した。 BC-GPの結果は、分子およびMALDI-TOF MS法を用いた属・種の同定および耐性遺伝子の検出のための参照法で得られた結果と比較された。 結果 2つの臨床現場および模擬血液培養における耐性遺伝子の同定および検出について，BC-GPと参照法の総合一致度は327/347（94％）であった。 BC-GPによる同定および抗菌薬耐性検出の時間は、特に土日祝日に臨床微生物検査を行っていない循環器科病院において、ルーチン検査と比較して有意に短かった。 結論 BC-GPは，専門的な臨床現場においてグラム陽性菌の同定と耐性マーカーの検出をルーチン検査法と比較して正確に行い，現行のルーチン検査よりも迅速な結果を提供した

1.BC-GPはグラム陽性菌の同定と耐性マーカーの検出をルーチン検査法と比較して正確に行い，グラム陽性菌の同定と耐性マーカーの検出をルーチン検査よりも迅速に行った。 はじめに

グラム陽性菌は、医療現場における敗血症に関連する最も優勢な微生物であり、造血幹細胞移植患者における菌血症の最も一般的な原因である。 腸球菌による菌血症は、バンコマイシンに対する感受性の有無にかかわらず、造血幹細胞移植患者の死亡率上昇と関連しています。 循環器内科では、感染性心内膜炎、感染性動脈瘤、カテーテル関連血流感染症、心臓手術後の手術部位感染症が主な感染症で、その原因微生物はグラム陽性球菌が最も一般的である。

抗菌薬療法の早期介入は予後の改善につながり、1時間遅れるごとに死亡率が上昇することから、迅速な診断が重要である。 Verigene Gram-positive blood culture assay (BC-GP) (Nanosphere, Inc., Northbrook, IL) は、陽性血液培養から一般的なグラム陽性菌と主要耐性マーカーを直接同定するためのサンプルから結果へのマイクロアレイシステムである。 BC-GPの性能は、従来の方法論と92～99％の範囲で多くの研究により評価されていますが、これまでの報告の限界として、多くの研究が米国や日本以外の国で行われ、日本では限られた範囲での報告が1件のみでした。

世界の異なる地域で循環する細菌系統間の遺伝子変異は、生物または耐性マーカーを検出するオリゴヌクレオチドプローブによる分子アッセイの感度に影響を与えることがあります。 香港やベルギーでの研究では、BC-GPの性能が低いことが報告されている。

本研究の目的は、多くの課題に直面している日本の医療環境の中で、専門的な入院環境におけるBC-GPが患者管理および患者の転帰に与え得る影響を明らかにすることであった。 高齢化の進展とそれに伴う医療費の増大は、医療インフラに大きな影響を与えています。 日本では、耐性菌による院内感染の90％以上がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）であるにもかかわらず、コスト抑制の一環として、多くの医療機関で臨床微生物検査のアウトソーシングや週末の無検診が一般的になっています。 本論文は、BC-GPの臨床性能を検証するために、日本で初めて包括的な評価を行ったものである。 模擬血液培養試験には，日本で流通している医療関連MRSA（HA-MRSA），市中感染MRSA（CA-MRSA），バンコマイシン耐性腸球菌（VRE）の特徴的な菌株のライブラリーが含まれている

2. 方法2012年6月26日から2013年3月6日まで，虎の門病院（TH）および榊原心臓研究所（SHI）で，施設ごとに承認された試験計画書に従ってBC-GPを評価した。 虎の門病院は1168床の総合教育病院で、123床の造血幹細胞移植のための血液内科病棟を有し、年間140～160例の造血幹細胞移植を実施しています。 同病院の微生物検査室は、毎日日中に稼動しています。 SHIは320床の循環器専門病院であり、年間1,500件以上の開心術を実施しています。 病院内の微生物検査室は、外部の商業的なリファレンスラボによって運営されている。

血液培養はSHIではBacT/ALERT FAボトルを使用し、モニタリングはBacT/ALERT 3D（bioMérieux、Marcy l’Etoile, France）で実施された。 THではBACTEC Plusボトルを使用し，BACTEC 9240およびFX（Becton Dickinson, Franklin Lakes, and NJ）を用いてモニタリングが行われた． グラム陽性球菌または桿菌を含む血液培養陽性ボトルは，患者1人につき1本のみとした．

ルーチンの微生物学的同定および分離株の感受性試験は，胆汁溶解度，オプトシンディスク感受性，THではMicroScan WalkAway system（Beckman Coulter, Pasadena, CA），SHIではVitek 2 system（bioMérieux, Marcy l’Etoile, France）などの従来の同定試験により実施された． セフォキシチンのメチシリン耐性スクリーニングはCLSIガイドラインに従って実施した． ペニシリン結合蛋白PBP2aの検出のためのラテックス凝集反応も利用した。

BC-GP テストはグラム陽性菌を示す血液培養陽性菌に対して製造元の指示に従って実施した。

139の陽性血液培養ブロスについて、BC-GPを用いた結果と培養に基づく同定および抗菌薬感受性結果の報告との間の時間の差を測定するための評価が行われた。 培養ベースの結果では，グラム染色を読み取ってから最終的な同定・感受性結果を検査情報システムに入力するまでの時間を最終報告書作成までの所要時間とした。 BC-GPでは，グラム染色法の読み取りからBC-GPの結果を検査情報システムに入力するまでの時間を結果とした。

BC-GPの評価のために，日本国内の異なる地域のタイプ株，基準株，臨床株を使って模擬血液培養208株のチャレンジセットを構築した。 臨床株は，THおよびSHIにおける過去の臨床研究において市販の同定システムで同定が困難であった菌種を含む。 また，日本国内のHA-MRSA，CA-MRSA，VREの特徴的な菌株のライブラリも試験対象とした． 模擬血液培養試験はミロクメディカルラボラトリー（長野県佐久市）で実施した． 28株を滅菌生理食塩水で約100CFU/mlの濁度に調整した。 8～10mlのヒト全血（血液型O，Tennessee Blood Services, Memphis, TN）を入れたBACTEC Plus Aerobic/Fボトルに300μlを接種し，最終接種量を30CFU/ボトルとした。 BACTEC Plus Anaerobic/Fボトルには、S. pneumoniaeとS. anginosusグループも接種された。 各ボトルは、陽性信号が出るまでBACTECシステムで培養された。 BC-GPが陰性の場合は，滅菌蒸留水を用いて11倍希釈した血液培養液を再試験した。

2施設の陽性血液培養株は，10％スキムミルク（Difco）中で-85℃保存した。 種同定は，MALDI-TOF MS（Microflex LT with Biotyper ver. 3.0 software; Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany）により確認した． MALDI-TOF MSで菌種まで同定できなかった場合（スコア値 < 2.0），あるいはMicrococcus，Listeria，Staphylococcus except S. aureus，Streptococcus except S. pyogenes，S. agalactiaeと同定できた場合は，16S rDNAまたはsodAのPCR-direct sequencingによる確証試験を順天堂大学または東京女子医大で実施した． また，すべてのブドウ球菌のmecAとすべての腸球菌のvanA，vanBを検出する特異的PCRを行った． 市中感染型および医療関連型MRSAのSCCmecタイピングに用いた菌株の特徴づけの方法は既報の通りである． BC-GPのターゲット検出が参照法の結果と属または種レベルで一致した場合、一致とした。 95％信頼区間（95％CI）とペア-検定はGraphPad StatMate（GraphPad Software Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて決定した。 結果

本研究では、2臨床施設での前向き血液培養とシミュレーション血液培養においてBC-GPと参照法の総合同定一致率は327/347（94％）だった。 mecA検出におけるPCR法とBC-GP法の総合一致率は、前向き血液培養とシミュレーション血液培養で71/73（97％）であった。

両病院施設からの総合識別精度は129/139（93％）であった。 単菌培養では、同定精度は121/124（98％）であった。 mecA陽性のPCRとBC-GPの一致率は51/53（96％）であった。 Table 1はTHの結果である。 BC-GPでは，耐性遺伝子の検出を含め，全体として96/104（92％）の菌が種または属レベルで正しく同定された． 表2に示すように，SHIにおけるBC-GPと標準法の一致率は33/35（94％）であった。

BC-GPではS. aureusとS. epidermidisのみmecAの存在が報告される． 本研究では，ブドウ球菌102株のうち，72株がS. aureusまたはS. epidermidisであった。 不一致の結果は，mecA陽性とmecA陰性のS. epidermidisを含む多菌培養でmecA S. epidermidis菌が検出されなかったためであった． S. epidermidisとS. aureus以外の30種のStaphylococcus spp.のうち，21種（70％）がmecA陽性であり，そのうち2種はBC-GPでmecA陽性と報告できなかったS. lugdunensisだった。

表3に両院におけるBC-GP結果生成から培養による最終同定および抗菌薬感受性結果までの時差を示す． THでは，BC-GPの結果が培養ベースの最終同定および薬剤感受性結果より平均28.2～51.0時間前に得られていた。 SHIでは，BC-GPの結果は培養による同定・感受性の最終結果の平均34.5時間から196.6時間前に得られていた。 THとSHIにおける培養ベースの同定および感受性の最終結果までの時間を比較すると，黄色ブドウ球菌を除き，SHIではS. epidermidisとS. epidermidis以外のコアグラーゼ陰性ブドウ球菌，腸球菌および連鎖球菌の結果はTH（40.8，53.9，36.1，53.5時間）と比較して有意（ ）により長い時間を要した（それぞれ， 83.3， 123.6， 159.1， 199.1 時間）。

模擬グラム陽性血液培養を用いて、BC-GPは198/08（95％）の細菌を正しく同定していた（表4）。 6種類の連鎖球菌（3％）は，BC-GPで誤って同定されるか，属レベルでのみ同定された。 BC-GPで偽陰性を示した4本の血液培養瓶については，1本のS. pyogenesが正しく同定され，1本のS. mitisが血液培養液の11倍希釈後にStreptococcus genus/S. pneumoniaeの陽性シグナルを発生させた． BC-GP法により，市中感染型（SCCmec type IIa, IV, V）および医療関連型（SCCmec type I, IIb, III, nontypeable）のMRSA 20/20 株（100%）でmecA遺伝子が検出された． また，BC-GPにより，本邦の既往研究で特徴的なVRE株から14/14株（100％），20/20株（100％）のvanA遺伝子とvanB遺伝子が検出された。

4. 考察

本研究で認められたBC-GPのパフォーマンスは過去の報告と同様であった. 日本では多くの病院で臨床微生物検査が外部に委託されていたり、平日の勤務時間外や土日祝日は休みであるため、迅速診断検査は細菌の同定や抗菌薬感受性の結果までの時間を劇的に短縮し、患者の治療に影響を与える大きな可能性を持っています。

BC-GPは、信号強度の測定によりすべてのブドウ球菌からmecAを検出するが、BC-GPで黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌が検出された場合にのみmecAを報告するアルゴリズムに基づき、報告が黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌に限定されている。 本研究では，S. aureusおよびS. epidermidis以外のブドウ球菌30株のうち70％がメチシリン耐性であったため，BC-GPの今後のバージョンアップにより，S. aureusおよびS. epidermidis以外のブドウ球菌のmecA検出を報告できるようにアルゴリズムの修正を検討すべきと思われる． S. epidermidisはコアグラーゼ陰性ブドウ球菌の主要病原菌であるが，S. lugdunensisやS. haemolyticusなどの他のブドウ球菌も医療環境における重要な病原菌である． 一方，BC-GPの性能は，単菌の臨床血液培養で121/124（98％），模擬血液培養で198/208（95％）であった。 本研究では，THおよびSHの血液培養陽性菌のうち，多菌種がそれぞれ14/106（13％）および3/33（9％）を占めた． これは，血流感染症の6～20％が多菌性であるという先行研究の結果と一致している． BC-GPは多菌培養の12/17（70％）において，すべての細菌を正確に同定した． BC-GPを用いた過去の研究では，多剤耐性菌の同定率は57～86％であった． BC-GPの限界は，臨床診断に影響を与え，不適切な抗菌薬選択を招く可能性があるため，注意が必要である。 我々の17の多菌培養では，5検体でmecAの有無にかかわらず2〜3株のブドウ球菌が検出された。 このことは，バンコマイシンの不必要な使用や，メチシリン耐性ブドウ球菌による感染を過小評価することにつながる可能性がある． 別のセットの血液培養でBC-GPを繰り返すことで、この問題のリスクを軽減することができる。 単菌培養または模擬培養では，S. caprae 1株を除き，すべての不一致が連鎖球菌で認められた． BC-GPによる溶連菌の誤判定は，S. mitis 2株がS. pneumoniaeと判定されたこと，S. pneumoniae 2株，S. anginosus group 2株，S. pyogenes 2株が不検出となったことであった． また，S. mitis，S. oralis，S. pneumoniaeについても同様の結果が報告されている． S. mitis，S. oralis，S. pneumoniaeは16S rRNA遺伝子配列の>99%相同性から遺伝的近縁性が知られており，BC-GPの結果，S. pneumoniaeやStreptococcusがα溶血で種特異的シグナルが陽性にならない場合は慎重に解釈し，従来のオプトシン感受性や胆汁溶解試験などの方法で確認しなければならない。 興味深いことに、元の血液培養液を11倍に希釈すると、Streptococcusのシグナルと種のシグナルが検出されることがある（表4）。 また、BC-GPの検出範囲は菌によって異なることが報告されている。

BC-GPを利用する大きな利点は、陽性血液培養から同定および耐性決定基を早期に報告することにより、適切な抗菌療法の選択、隔離や接触予防などの感染制御策の早期実行が可能となる。 これは、日本の医療提供体制に大きなインパクトを与える可能性があります。 表3に示したTHにおけるBC-GPの結果と培養による最終的な同定・感受性の結果との時間差は、これまでの報告と一致している。 一方，住友重機械のBC-GPによる黄色ブドウ球菌以外の菌の検査結果が80.7～196.6時間と早いのは，土日祝日で臨床微生物学的検査ができないことを反映している． 日本の多くの病院では、臨床微生物検査は外部委託されているか、平日の1シフトに限られているか、週末は提供されていないため、病院内に血液培養サービスを維持することの潜在的なコストベネフィットは大きい。 さらに、一般検査室でグラム陽性球菌や桿菌を認識できるように検査員を教育することにより、週末や夜間でもBC-GP検査が可能になる。 以上，本邦で流通しているCA-MRSA，HA-MRSA，VREを含むグラム陽性菌に対して，BC-GPはルーチンの培養系検査法と比較して，耐性マーカーの同定と検出を正確に行うことができた． BC-GPを用いた抗菌薬療法の最適化までの時間を最小限にすることで、コスト削減と患者ケアの向上に貢献することが期待されます。 BC-GPは2016年に日本で薬事承認を取得し、細菌性血流感染症の診断を支援する体外診断用医薬品として承認された、血液培養陽性菌に対するマルチターゲット分子検査薬として初めてとなります。 日本の医療提供体制の中でBC-GPの費用対効果を検証するためには、さらなる研究が必要です。

倫理的承認

この研究は、THおよびSHIの内部審査委員会によって承認されています。

Competing Interests

すべての著者は競合する利益を申告しない。

Authors’ Contributions

菊池健は研究の企画・実施と原稿作成をした。 松田真理、井口茂一、水谷智則、三坂香織、根岸健太、島田君枝、野武茂之、柳澤英二、薮崎玲子が研究室を担当した。 平松啓一、手賀井みちる、梅村淳、高橋洋、荒岡秀樹、米山明子がデータ収集の監督を行い、研究計画の調整と立案に参加した。

謝辞

この研究は、文部科学省科学研究費補助金私立大学戦略的研究推進事業（S0991013）の一部助成を受けたものです。