遺伝子組換えシステムの確立により、糸状菌に外来DNAを組込み、工業的に目的の菌株を取得できるようになった。

Protoplast-mediated transformation (PMT)

PMTは最も一般的な真菌の形質転換法で、多数の有能な真菌プロトプラストに依存するもので、真菌プロトプラストを用いた形質転換法である。 原理は、プロトプラストを生成するために、いくつかの市販の酵素を用いて真菌の複雑な細胞壁成分を除去することである。 その後、以下に詳述するように、いくつかの化学試薬（PEGなど）を用いて、外来核酸とプロトプラストの融合を促進させる。 真菌の細胞壁の構成成分は、菌株によって大きく異なる。 胞子膜の成分でさえ、同じ株の菌糸のものとは大きく異なる。 従って、異なる菌種に適用できる普遍的な形質転換法は存在しない。 また、プロトプラストの調製も標準化されているとは言い難い。 また、細胞壁加水分解酵素の知識が乏しいことも、この困難さの一因である。 真菌に最適なPMT法の開発には、まだ大きな努力が必要である

PMT は日常的に使用されている形質転換法である。 この方法は、遺伝的形質転換の効率化や、遺伝子編集による適切な遺伝子座のターゲティングを実現するために、常に改良が続けられてきた。 プロトプラストの調製には細胞壁の除去が必要であり、主に酵素処理によって達成される。 また、酵素を用いない方法として、粉砕や超音速波動衝撃などの物理的な方法も報告されています。 しかし，実用上の不便さやプロトプラストの収量が少ないことから，あまり利用されていない。 表1 菌種ごとのプロトプラストによる形質転換プロトコルの概要

PMT法の基本手順

PMTが最初に応用されたのはSaccharomyces cerevisiaeのときであった。 市販のスネラーゼでプロトプラストを調製し、ソルビトールを用いてプロトプラストの保存を行いました。 その後，Neurospora crassa や A. nidulans などの糸状菌に適用された。 このように、形質転換法は改良されてきたが、基本的な手順は変わっていない。 図1にPMT法の基本的な手順を示す。 1

Preparation of the protoplasts

Protoplast preparationの最初のステップは酵素分解によって細胞壁を除去することである。 真菌の細胞壁はグルカン、マンナン、キチンから構成されている。 真菌細胞壁の構造は非常に動的であり、真菌の細胞分裂や成長、胞子発芽、菌糸分岐、横隔膜の形成などの過程で細胞壁が変化する。 また、真菌の種類によって細胞壁成分が異なるため、様々な酵素を組み合わせて使用する必要がある。 プロトプラスト調製において適切な酵素ミックスの選択が重要な要素であることが報告されている。

一般に菌糸は対数期にその細胞壁を加水分解する適切な酵素に感受性がある。 NeurosporaのPMT法では，生まれたばかりのハイファを加水分解してプロトプラストを調製する（25〜30℃で4〜6時間培養する）． 同様に、分生子胞子を用いてプロトプラストを調製することも可能である。 例えば、AspergillusやPenicilliumでは、胚胞子やタリーを選ぶことができる。

プロトプラストは浸透圧に敏感なので、細胞壁の酵素分解時にプロトプラストを無傷に保つために、浸透圧を安定に保つよう注意しなければならない。 したがって、細胞の破裂を避けるために、浸透圧安定剤（ソルビトール、塩化ナトリウム、塩化カリウムなど）をプロトプラスト調製用のすべての緩衝液に含める必要がある。 例えば、N. crassa , Aspergillus sp. , Trichoderma sp.のプロトプラスト調製には、プロトプラストの浸透圧安定性を保つために、0.8-1.2M濃度のソルビトール溶液が使用される。

Uptake of exogenous DNA

プロトプラストを懸濁する溶液には通常カルシウムイオンと浸透圧安定化剤が入っています。 カルシウムは細胞膜のチャネルを開いて外来DNAの細胞内への侵入を容易にすると考えられ、浸透圧安定剤はプロトプラストの形態を維持するために必要である。 通常、精製DNA（円形二本鎖DNAと直鎖DNAがある）と共に、一定量のポリエチレングリコール（PEG）が添加される。 PEG は、一般的に使用される細胞融合促進剤です。 PEGは、細胞間あるいは細胞膜とDNAの間の分子橋を形成し、接着を促進することができる。 また、細胞膜表面の電荷を乱し、膜透過性を変化させ、外来核酸の細胞内への侵入を促進することができる。 ほとんどの場合、低い形質転換効率は、より多くのPEGを添加することによって改善することができる。 通常の条件下では、低分子量PEG（PEG3000など）の性能は高分子量PEG（PEG8000など）の性能よりも優れています。 しかし、これは様々な種に対して最適化する必要がある。

形質転換効率は温度にも影響される。 一般に、DNAとプロトプラストの混合物は、DNAがプロトプラストの表面に付着できるように、15-30分間氷上に置くべきである。

Regeneration of protoplasts

生きたプロトプラストの良い回収を保証するには、選択プレートに移す前に一定時間、選択圧のないプレート上でプロトプラストを回復させる。 再生培養には浸透圧安定剤を入れることが望ましい。 プロトプラストが細胞壁を再生するためには、浸透圧の安定が重要な要素である。 2259>

PMT 法に関するコメント

Protoplast transformation methodは高価な装置を必要とせず、簡単で効果的である。 しかし、そのプロトコールには多くのステップと重要な試薬が含まれている。 各ステップは最適化される必要があり、試薬の品質は厳密にテストされる必要がある。 また、形質転換される菌の生育状態を注意深く観察する必要がある。

Agrobacterium -mediated transformation (AMT)

Agrobacteriumは土壌中に普通に見られるグラム陰性細菌である。 Agrobacterium tumefaciensは傷ついた植物に感染することができる。 感染初期にTiプラスミドとも呼ばれる> 200kbの腫瘍誘導プラスミドを単離することができた。 A. tumefaciensが植物に感染すると、傷口から植物体内に侵入し、Tiプラスミドの一部を感染した植物細胞のゲノムに組み込む。 Tiプラスミドが組み込まれたDNA断片は、一般に転移DNAまたはT-DNAと呼ばれる。 T-DNAは、モノクローンとしてランダムに植物ゲノムに挿入される。 T-DNAは2つの方向性不完全反復配列（left and right borderと呼ばれる）を挟んでおり、腫瘍の成長を引き起こす植物ホルモンの形成に関与する酵素をコードする遺伝子を含んでいる。 このT-DNAの左右の境界の間に目的遺伝子を挿入したバイナリーベクターを設計し、その組換えプラスミドをアグロバクテリウム・ツメファシエンスに形質転換した。 この陽性アグロバクテリウムクローンをビークルとして、標的遺伝子を菌体ゲノムに組み込むことができた。 具体的な手順については後述する。

AMT法は、この方法が真菌の形質転換に適用できることを最初に報告した論文以来、従来の形質転換法よりも安定で効率的であることが示されている。 AMT法は、最初にS. cerevisiaeの形質転換に適用された。 また、アスペルギルス・アワモリの形質転換には、ハイグロマイシン耐性遺伝子を導入したプラスミドを用いるのが一般的である。 AMT法は、Aspergillus 、Monascus purpureus などの多くの子嚢菌類に適用されている。 AMT法の基本的なステップをFig.2に示す。 表3はアグロバクテリウムを用いた真菌の形質転換プロトコルの概要である。 2

アグロバクテリウムによる形質転換の基本ステップ

AMT効率に影響を与える要因

多くの要因がAMT効率に影響を与えます。 出発菌体の種類（プロトプラスト、胞子、菌糸、子実体組織）、アセトシリンゴン濃度、菌とAgrobacteriumの比率、共培養の条件などです。

1. 出発菌体の種類 AMT法では、菌体のプロトプラスト、胞子、菌糸、子実体組織を受け皿として使用することができる。 株によって適切な出発物質を選択する必要がある。 例えば、AMT法はRhizopus.oryzaeとMucor circinelloidesのプロトプラストに対してのみ有効であり、胞子や胚芽は形質転換体を作らない。

2. アセトシリンゴン（AS）AS濃度はAMTプロセス中の2つのステージに作用している。 一つは誘導過程であり、もう一つは形質転換過程である。 ASは一般にT-DNAのVirドメインの発現を誘導し、Virドメインの遺伝子がT-DNAの転移を活性化するために使用される。 多くの研究により、形質転換の過程では適量のASが必要であることが証明されている。 しかし、アグロバクテリウムの前培養段階でのASの添加は絶対に必要というわけではなく、株によっては形質転換効率を低下させる可能性がある。 ASの濃度はAspergillus awamoriのAMTにおける菌-アグロバクテリウム共培養過程での形質転換効率に影響を与える重要な因子である。

3. 菌-アグロバクテリウム比 ある限度において、菌またはアグロバクテリウム量の増加により形質転換効率は最大レベルに到達すると考えられている。 菌の種類によってAMTの最適な比率を経験的に決定する必要がある。

4. 共培養の条件 共培養の条件はAMT法において重要な因子である。 これには、培養時間、温度、pH、フィルターの選択などがある。 共培養の温度と時間は、AMT法のステップの中でも重要なファクターである。 菌類-アグロバクテリウムの形質転換では、開始時の適切な条件は温度20～28℃、共培養時間16～96時間である。通常、AMT法では低温（20～25℃）が有利となる。 親水性で菌-アグロバクテリウム共培養の支持体となるフィルターは、シングルコロニーのスクリーニングプレートへの移し替えを容易にする。 フィルターとしては、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ろ紙、セロファン、ポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜などが使用できる。

アグロバクテリウムによる形質転換に関するコメント

AMT 法は従来法では困難な菌類に対して新しい道を開くものであった。 AMT法はT-DNAがランダムにゲノムに挿入されるため、特に菌類のノックイン変異の生成に適している。 また、様々な遺伝子ターゲティング実験において高い相同組換え効率を達成することができる。

AMT法の主な利点は、第一にプロトプラスト、ハイファ、胞子など多様な形質転換体、第二に外来遺伝子をゲノムに組み込んで安定な形質転換体を形成できる、第三に高い形質転換効率により多くの形質転換体が得られる、である。 また、形質転換プロセスの最適化において、複数の要因を考慮する必要がある。 これはAMT法の大きな限界である。 .

Electroporation transformation

Electroporation は糸状菌の簡単、迅速、効率的な形質転換法である。 エレクトロポレーション法では、電荷をコンデンサーに蓄えて高電圧を作り、そのインパルス電圧で試料を叩き、外来核酸を瞬時に細胞内に移行させることができる。 菌類の形質転換には、通常、矩形波や指数関数的減衰波が使われる。 指数関数的減衰波は、コンデンサーの充電と放電を繰り返すだけで発生するパルスである。 電界はピーク値から指数関数的に減衰する。 矩形波は、正弦波の無限和として表現できる非正弦波の周期波形で、振幅が一定の最小値と最大値の間で一定の周波数で交互に変化する。 エレクトロポレーションは、生物種によって異なる波形が利用されます。 表4 異なる種のエレクトロポレーションに使用される波形の概要

細胞が電界にさらされると、細胞膜の構造は、細胞膜の間に誘導される電圧で変化します。 電気ショック後、細胞膜に微細孔が形成されることがある。 この細胞壁透過性は、電圧と時間の閾値の範囲内では可逆的であるが、そうでなければ、細胞に不可逆的な損傷を与えることになる。 したがって、電気ショック後の細胞膜の微細孔は、可逆的なパターンと不可逆的なパターンの2パターンがあるように見える。 細胞膜の脂質やタンパク質分子は、適切な電界強度をかけると元の構造に戻るが、不可逆的な電気ショックは、修復不能または極めて遅い回復を生じ、最終的には細胞死に至る …………………..。 エレクトロポレーション法により、細菌、植物プロトプラスト、動物細胞、糸状菌に外来DNAを導入することができます。 この方法は、多くの菌類に適用され成功している。 小関らは、胚芽胞子がエレクトロポレーション法による形質転換に適していることを発見した。 近年、エレクトロポレーション法は、いくつかの一般的な菌株の遺伝子形質転換のための信頼性の高い方法となっている . 表5 種々の真菌のエレクトロポレーションによる形質転換プロトコルの概要

エレクトロポレーションによる形質転換に影響を与える因子

エレクトロポレーションパラメータ

1. 電界強度 電界強度はエレクトロポレーション効率に影響する最も重要な因子である。 電界強度がkV/cm、パルス幅がμs-msになると、細胞膜が変化し、細胞壁に多くの微細孔が発生します。 電界強度が高いほど、外来核酸の取り込み率が高く、細胞の生存率が低くなる。 しかし、様々な種類の細胞は、細胞膜の構成成分の違いから、異なる電界強度を必要とする。 電界強度が必要な閾値を超えない場合、微小孔はほとんど形成されない。 逆に電界強度が強すぎると、細胞膜に不可逆的な損傷を与え、細胞死に至る。

2. Capacitance エレクトロポレーションプロセスにおいて、電荷の変化と細胞懸濁液にかかる電界強度は、静電容量とパルス時間に依存する。

3. パルス幅と周波数 エレクトロポレーションによる細胞膜への穿孔は、パルス幅と周波数に影響され、エレクトロポレーション変換効率に直接関係します。

エレクトロポレーション環境と外部要因

1. 緩衝液 緩衝液は細胞のエレクトロポレーションに重要な環境を提供し、電気ショック緩衝液のpH値は非常に重要であり、この緩衝液のpH値は、細胞のエレクトロポレーションに重要な環境である。 通常、pH7.0の緩衝液が使用される。 pHが7.0より高いと細胞は簡単に穿刺され、死んでしまいます。 .

2. 温度 エレクトロポレーション処理中に大量の熱が発生し、バッファ溶液に放出されます。 したがって、より良い効果を得るためには、温度を下げる（0～4℃）ことが推奨されます。 さらに、電気ショック前の混合液を氷水で冷やすと、電気ショックの効率が向上します。

3. 外来核酸の濃度 全体として、電気穿孔の効率は、外来核酸の濃度が高いほど高くなります。 コンパクト超らせんDNAは、細胞膜を通してより容易に細胞内に侵入する。 1995年、ある研究では、1μgのプラスミドDNAごとにA. nigerの形質転換体を100個生成できると報告している。

エレクトロポレーション法に関するコメント

エレクトロポレーション法は原核生物、真核生物など多くの種類の細胞に広く適用されている。 この技術は、未開拓の真菌類の形質転換法として期待されている。 複雑な手順を要するPMT法に比べ、エレクトロポレーション法はシンプルで利便性が高い。 しかし、エレクトロポレーションのメカニズムはまだ解明されていない。 細胞膜の穿孔速度は電場の多くのパラメータに依存する。 また、最適に効果を発揮するためには、適切な緩衝条件を必要とします。

Biolistic transformation

Biolistic transformationは、粒子照射法としても知られています。 その原理は、タングステンや金の粒子の表面に外来DNAを吸着させるというものである。 高圧力で、粒子を宿主細胞に注入する。 このように、粒子衝撃法は、安定した形質転換と一過性の形質転換の両方を実現することができる。

さまざまな要因が、複雑な相互作用のパターンにおける粒子衝撃法の効率に影響を与える。 生物学的パラメータ（細胞タイプ、成長条件、および細胞密度）および機器設定（粒子タイプおよびサイズ、真空および圧力レベル、ターゲット距離）は重要な変数です。

Particle bombardmentは、すべての遺伝子変換法の中で最も強力な方法です。 宿主の細胞の種類や種による制約を受けない。 菌類では、培養が困難な菌やプロトプラストの調製が困難な菌に対しても、粒子線照射は十分に有効である。 粒子線照射は操作が簡単で便利である。 しかし、粒子線照射のための器具や消耗品は高価である。 他の方法でうまくいかない場合にのみ検討される。 現在、粒子線照射はA. nidulansやT. reeseiなどの形質転換に利用されています。

Shock-wave-mediated transformation (SWMT)

SWMT はエネルギーの変換と伝達の原理を利用して、細胞全体に過度の圧力撹乱とねじれ力を発生させて過度のキャビテーション効果を形成させるものです。 この方法は、整形外科や腎臓結石の破砕などの医療に応用されている。 SWMTは、音響キャビテーションによって細胞膜の透過性を変化させ、その結果、外来核酸を細胞内に取り込むことができる。 この方法は、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ・チフィムリウムへの外因性核酸の導入に成功しました。 2013年には、Denis Magaña-Ortízらが、A. niger、Fusarium oxysporum、Phanerochaete chrysosporiumなどの真菌に対するSWMTの適用を初めて報告した 。 この論文では、SWMT法の3つの利点が指摘されている。 第一に，従来の形質転換法と比較して，プロトプラストではなく胞子に直接作用させることが可能である。 第二に、物理的パラメータの制御が容易であり、胞子の数、衝撃波のエネルギーと速度のみを正確に制御する必要があった。 第三に、形質転換の効率が優れていることである。 Denis Magaña-Ortízらの結果によると、Agrobacteriumによる形質転換法と比較して、SWMT法はA. nigerの形質転換効率を5400倍に高めることができた

しかしこの形質転換法にはいくつかの限界もあった。 衝撃波処理ではDNAの大部分が損傷するため、細胞に対するDNAの割合で決まる形質転換効率はかなり低かった。 しかし、関与する細胞数については、形質転換効率はかなり高かった. この効率を評価するためには、DNAの量と細胞の数の2つの側面を考慮する必要があります。 例えば、Magana-Ortiz らの実験では、一般的にプロトプラスト形質転換やエレクトロポーレーションに使用するプラスミド DNA は約 1-10 μg であった。 このような大量のプラスミドをSWMT法のために実験室で製造することは、高価で不便である。 さらに、衝撃波の発生源や機器は主に医療用に設計されているため、高価である。 このことは、資源に限りのある微生物研究所でこの方法を採用する際の大きな障害となることが判明した。