松下 & 藤川12による実験結果（上段）と対応するモデルのシミュレーション結果（下段）。 (a)大きな枝が小さな枝を栄養から遮断する（現象I）、(b)近くに播種した2つのコロニーが互いに反発するように見える（現象II）、(c)シャーレの右側の栄養源に向かって成長する単一のコロニー（現象III）、が示されている。 (d)選別枝、(e)近接した2つのコロニー、(f)右側に栄養源がある場合の成長のシミュレーションは、格子ベースのモデルで計算されている。 種細胞は赤い点で示されている。 シミュレーションは次元L x = L y = 200の格子で、パラメータs = 3とc0 = 1で計算され、実験と同じ桁のΔの値になった。 図2（a）、（b）、（c）は、Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 168, Mitsugu Matsushita and Hiroshi Fujikawa, Diffusion-limited growth in bacterial colony formation, 498-506, 1990, よりElsevierの許可を得て転載。

細胞と栄養素の相互関係はこれら二つの量の相対拡散率の比較により広く定量的に把握できるかもしれない。 コロニーの成長は、上から見たときのコロニー面積の平均変化率Δmを計算することによって測定され、これは拡散率と同じ単位を持つ。 この量は、実験画像や離散モデルによるシミュレーションデータから容易に計算できる。 栄養素の広がりΔnは、栄養源としてよく使われるグルコースの拡散率であり、栄養素の違いによる拡散率の差が少ないため、グルコースの拡散率としている。 水中におけるグルコースの拡散率は、実験結果から約 \({D}_{0}=4.03times {10}^{-2})mm2 min-1であることが知られている36。 低密度の寒天ゲル中のグルコースの拡散率は

ここでwは寒天の重量％37で示される。 w=0.3%とすると、拡散率は4.01×10-2 mm2 min-2となり、この値を以後この研究で使用する。 拡散係数は寒天の量によってほとんど変化しないため、wが結果に与える影響は無視できるほど小さい。 これらの量から、比

これは、拡散の相対速度の無次元尺度を提供する計算を行う。 Δが小さいと、栄養塩の拡散は細胞の成長よりも速い時間スケールで行われ、栄養塩濃度の局所的な変動はコロニーの形態に影響を与えることなく消滅することを意味する。 Δが1以上であれば、少なくとも栄養塩の拡散と同程度の速度で細胞増殖が起こっており、栄養塩濃度の局所的な変動がコロニー形態に影響を与える可能性があることを示す。 3つの実験画像のうち、Δを計算するのに必要なスケールと時間の両方について十分な情報が提供されているのは、指示された成長の画像だけである。 この画像から、Δ ≈ 0.23であることがわかった。 モデルでs = 3とc0 = 1を設定すると、Δの値が0.3から0.5の間の解が得られ、これは実験結果と同じオーダーであるため、適切な比較を提供します。 これらのパラメータ値は、このサブセクションの残りの部分で使用される。 3 つのケースのそれぞれの挙動は、Binder ら38 のアプローチと同様に、以下に説明する空間指標を用いてさらに定量化される。 各シミュレーションは寸法L x = L y = 200の格子を使用しており、これは十分な解像度を持つ特徴を生成するのに十分な大きさでありながら、計算効率が良い。

分岐スクリーニング（現象I）を調べるために、栄養素は領域全体に均一にランダムに播かれ、単一のセルが格子の中心に配置される。 シミュレーションは細胞密度が0.2になるまで行われ、図2に示すような代表的なコロニーを形成する。 このコロニーでは、最初の中央のセルから大きな枝が伸び、その間に大きな枝によって栄養が遮断された短い枝が伸びており、著しく非一様な成長を示しています。 これは、松下&藤川12によって観察された挙動と一致する。 この形態は、まず原点を質量中心に置き、ある基準角度から反時計回りに測定した各細胞の角度を数えることで定量化できる。 カウントは均一にランダムに分布する細胞の期待値でスケーリングされ、不均一な成長の角度指数I θはスケーリングされたカウントの標準偏差と定義され、I θの値が大きいと不均一な成長のレベルが大きいことを示す。 実験画像は指数0.18、シミュレーションは指数0.2であり、両者はほぼ一致している。

反発するコロニー（現象II）の場合、栄養分は再び領域全体に均一にランダムに配置される。 2つの種細胞は領域内の中央に垂直に置かれ、それぞれ領域幅の8分の1ずつ中心から水平に離れ、細胞は領域幅全体の4分の1ずつ離されるように配置される。 シミュレーションは，セル密度が0.2になるまで計算される． 典型的なシミュレーションを図2に示すが、これは松下&藤川12によって観察された2つのコロニーの間のギャップを表示したものである。 反発するコロニーは、シミュレーションの最後に、細胞の総数νと2つの種細胞間の細胞数νcを数えることによって定量化することができる。 そして、反発の指数をI c = 1 – ν c / ν と定義し、2つのコロニーが均一に成長する場合は0.5に近く、隙間ができる場合は0.5より小さく、コロニーが互いに向かって成長する傾向を示す場合は0.5より大きくなるようにした。 実験画像における各コロニーの種細胞の位置は、枝に沿って線を引き、それが交差する場所を特定することで近似している。 実験画像とシミュレーションの指標はそれぞれ0.19と0.27であり、これは両者が2つのコロニー間に大きなギャップを持った類似の成長パターンを生み出していることを示唆している。

方向性成長（現象III）は、最初にドメインの右端の列にすべての栄養素を配置し、ドメインの中心に1つのセルを配置してシミュレーションされる。 その後、細胞密度が0.1になるまでシミュレーションが計算される。 典型的なコロニーを図2に示すが、これは松下&藤川の実験結果に酷似している12。 ドメインの片側への偏りを測定するために、ドメインの右側の細胞の割合I bを細胞の総数に対して計算し、I b∈となるようにした。 I bの値が0.5に近いほど偏りが少なく、I b < 0.5は右側に偏り、I b < 0.5は左側に偏っていることを示しています。 実験画像は指数0.92で、シミュレーションの指数0.93とほぼ一致します。

Ginovartら30が見出したように、実験画像とシミュレーションの間の良好な定性的一致は、DLGのみが枯草菌コロニーのスクリーニング、反発、および指向性成長をもたらすことができることを示す。 我々は、実験と数理モデルとの定量的な比較により、この比較をさらに強化した。 したがって、DLGが形態に影響を与えている場合には、これらの現象が見られると予想される。一方、これらの特徴が見られない場合には、他のメカニズムが成長パターンに関与していることが示唆される。

Inducing DLG

離散モデルがDLGの挙動を再現できることを示したので、ここではこれらの現象のモデルパラメータへの依存性を定量化し、DLG効果がいつ生じるかを予測する。 コロニーは再び寸法L x = L y = 200の格子上で前節と同じ3つの初期条件と停止基準を使ってシミュレーションされた。 シミュレーションは，栄養段階 s = 1, 5, …, 37 と初期濃度 c0 = 1, 2, …, 7 の各組で 50 回繰り返された．

分岐スクリーニング（現象I）を調べるために、均一な栄養場で単一細胞から成長したコロニーを考え、図3に示す50回の実現における対応する値の平均指数値 \({}bar{I}_{theta }} を計算する。 sとc0がともに小さいときに最も大きな値を示すが、これは2つの要因によるものである。 まず，栄養塩の拡散係数（実質的なs）が細胞増殖速度に対して小さいため，領域全体で栄養塩レベルの変動が発生する． 第二に、初期の栄養濃度c0が低いため、この変動によって栄養レベルが低すぎて細胞の成長を維持できない領域が生じる。 sとc0のどちらかが大きいと、これらの条件のうち少なくとも1つが発生しなくなり、DLGがコロニーに大きな影響を与えなくなったことを示す。 したがって、これらの結果は、細胞の成長速度に対する栄養拡散率と栄養濃度の両方が小さい場合にのみ、非一様なパターンが発生することを示している。

模擬微生物コロニーにおけるDLG効果の測定。 すべてのシミュレーションは、さまざまな栄養ステップsおよび初期栄養濃度c0を使用して、格子ベースのモデルを使用して計算される。 (a)ブランチスクリーニング（現象I）のmean index \({Ⓐ}_{theta }）、(b)repelling colonies（現象II）のmean index \({Ⓐ}_{c}）、(c)directed growth（現象III）のmean index \({Ⓐ}_{b}) が示される。

反発する場合（現象II）でも同様の挙動が見られ、図3にプロットされた平均指数♪({¥bar{I}_{c}})から分かるように。 sとc0の値が小さい時に指数の最大値が見られるが、これは \({Cheta }) と同じ理由で起こる。

指向性成長（現象III）の場合の挙動は、図3に示す平均指数 \({Chebar{I}}_{b}) から分かるように、異なるものである。 sが小さいとき、指数(index)Σ({Θbar{I}_{b}})は大きく、c0に対してほとんど変化しない。 sが大きくなるにつれて、閾値は小さくなり、c0への依存性が大きくなり、c0が小さくなると閾値が大きくなる。 このように、有向グラフが観測されるパラメータ値の範囲は、他の2つのDLG現象に比べて非常に大きい。 したがって、もし有向性成長が起こらなければ、他の2つの特徴も起こらないことになり、有向性成長は測定が簡単なDLGの最初のチェックとして有用である。

連続体モデル

DLG現象の出現は、2つの種の栄養濃度と拡散性の両方に依存している。 これらの現象の離散的な栄養ステップ数sと初期栄養濃度c0への依存性を測定する指標であるが、Δの値はモデルへの入力として指定するのではなく、シミュレーションデータから計算するしかなかった。 しかし、実験データを考慮する場合、Δは実験画像から容易に測定できるため、Δを用いて細胞と栄養分の相対的な広がりを特徴付けることが自然である。 このモデルでは、細胞密度と栄養塩濃度をモデル化した決定論的反応拡散方程式系を導入し、Δの設定と等価な各量の相対拡散係数を指定できます。 このモデルは、図2に見られるような細かい特徴を捉えるには適していませんが、最大のパラメータ範囲で生じることがわかった栄養源に向かう成長（現象 III）を再現することが可能です。 そこで、DLGが発生していることを容易に測定できるサインとして作用する、この側面に注目する。

我々は、モデルの一般的な挙動を説明するのに十分な1次元領域を考慮する29,32,39。 3節で述べた無次元位置x、時間t、細胞密度n(x,t)、栄養濃度g(x,t)を用いると、支配方程式は

$$frac{partial n}{partial t}=}{partial {x}^{2}}-{cn,cmn}{partial }^{2}n}{partial {x}^{2}}-{pattersmathrm{.}$$

(3b)

パラメータ D = D m /D n は、細胞の拡散係数 D m と栄養分の拡散係数 D n の比である。 これはΔ(2)の定義と同様で、コロニー面積の変化率の測定値の代わりに細胞拡散性を用いている。 両式の右辺の第一項は拡散の寄与を表し、第二項はそれぞれ栄養分の消費と新しい細胞の成長を表し、cは新しい細胞あたり消費される無次元栄養分量である。

初期条件として、

$$m(xmathrm{, 0)}={e}^{-L{(x-0.).5)}^{2}},$$

(4a)

$n(xmathrm{,0)}=N{e}^{-L{(x-0.75)}^{2}},$$

(4b)

ここでNは無次元栄養濃度として解釈しても良いだろう。 一般的な挙動を説明するために、N=1の初期条件を図4に示す。

1次元反応拡散モデルによる結果。 (a) N = 1の初期条件では、細胞はドメインの中央に集中し、栄養分は右側にあることがわかる。 (b)時間t=1までのI bの最大値をDとNの10進対数に対してプロットすると、特定のパラメータ値においてのみDLGが起こることが示唆される。 2つの代表的な例が示されている。 (c) D = 10-6 と N = 1 のときの I b の最大値では、細胞はまだ x = 0 についてほぼ対称であり、栄養濃度は実質的に一様になっている。 (d) D = 10-0.5、N = 105とすると、栄養分が最初に濃縮された右側に大きく偏る。

3節で示した典型的なパラメータ値を固定とすると、Nの値は栄養分の物理濃度により変化するだけである。 栄養剤だけを含む培地を考え、最大濃度を表すと、Nの値はおよそ105より大きくはならないことがわかる。 したがって、解は1≦N≦105で計算される。 典型的な実験的観察では、10-3 ≤ D ≤10-1 であることが示唆されているが、D によってどのように挙動が変化するかを理論的に検討するために、10-6 ≤ D ≤103 の値を考慮した。 これは成長の約119日に相当し、典型的な実験時間より大きいが、シミュレーション中にI bの最大値が観測されることを保証するものである。 図4は、計算された指数I bを、両軸とも10の底を持つ対数スケールでプロットしたものである。 log(N) < 1の場合、I bで測定される細胞の成長にはほとんど偏りがない。 Nが大きい場合、偏りの量はDの値に依存し、最大値は (D,N) = (1, 105) の近傍で発生した。 この D の値は、細胞と栄養分の拡散係数が同じ大きさに相当し、この値付近では、N が 101.5 と小さな値でも成長に偏りが見られることがある。 典型的な実験条件では、Nは大きさ2のオーダーを持ち、これはDLG効果がDがユニティーに近いときに最も観察されやすいことを示す。

2つの対照的な例からの分布を考えることによって、挙動の範囲がさらに説明される。 それぞれのケースで、解は最大のセルバイアスに対応する時間で示される。 図 4 に示す D = 10-6 と N = 1 の場合、細胞密度が、最初に栄養分が濃縮された右側への明らかな偏りを生じる前に、栄養分濃度は事実上一様になりました。 一方、D = 10-0.5、N = 105でプロットすると、細胞は明らかに右側のドメインに偏る。 Nは2桁の大きさなので、図4から明らかなように、Dが1桁に近いときのみDLGが観測されることが示唆される。 このことは、物理パラメータを用いて説明することもできる。 3節で示したパラメータ値を用いると、初期栄養濃度が最大の環境に置かれた拡散率({D}_{m}=3times {10}^{-2})mm2 min-1の微生物は、無次元値D = 0.75, N = 104にほぼ対応することになる。 図4から、この種は栄養源に向かって成長し、それゆえDLG挙動を示すと予想される。 もし、同じ微生物を最大栄養塩濃度の環境に置くと、Nの値は10に低下し、偏った成長は見られなくなる。 9250>

実験的比較

モデルの予測を検討した後、次にこれらを用いて微生物コロニーにおける支配的な成長機構を特定する。 図1に示した3つの代表的な実験例、枯草菌の2つのコロニーとS. cerevisiaeの1つのコロニーを考えてみる。 反応拡散モデルで必要とされる拡散比Dの適切な値が分からないため、代わりに相対的な広がりΔ（2）で成長を特徴づけます。 このパラメータは、上から見たときのコロニー面積の平均変化率とグルコースの拡散率の比を表し、画像から測定することができる。 栄養剤が均一に分配され、単一のコロニーのみが成長するため、これらの実施例における任意のDLGは、枝選別による不規則な成長（現象I）として現れると予想される。

成長速度Δmの計算値を、対応する相対速度Δとともに表1に示す。 これらの値は、枯草菌コロニーが酵母コロニーよりも2桁速く、グルコースの拡散率よりも1桁遅く成長していることを表している。 初期栄養塩濃度の典型的な値を用いると、この実験はNの値が2のオーダーに相当することが示唆される。 この推定値とΔの値をFig.4のモデル結果に当てはめると、枯草菌はDLGによる定位成長が起こる領域に対応することがわかる。 この推定は、細菌の対応する値よりも小さいと思われるS. cerevisiaeのコロニー内の細胞増殖率pを測定して行われたため、Nについては過小評価となり、Nの値が大きくなるほどDLGが観察される可能性が高くなることが予想される。 一方、S. cerevisiaeのコロニーではΔが-3桁となり、細胞の成長よりもはるかに速い時間スケールで栄養塩が拡散していることが分かる。 その結果、栄養塩濃度の局所的な変動は、コロニー形態に影響を与える前に消失すると考えられる。 このことから、コロニーの形態はDLGの影響を受けていないことがわかる。 このように、低栄養環境におけるバクテリアと酵母のコロニーの形状は強く類似しているにもかかわらず、この2つの形態は異なる現象によるものである。 バクテリアのコロニーは十分に速い時間スケールで成長するため、栄養拡散が成長を制限し、不規則なパターンになる可能性がある。 酵母コロニーの成長ははるかに遅いため、DLGは起こり得ず、その代わりに低栄養環境で生じる不均一なコロニー形態は、偽菌糸成長のみによるものでなければならない。

これらの結果をさらに確認するために、松下&藤川12とシミュレーション40で使用したセットアップを模倣して、S. cerevisiaeのコロニーで指向性成長（現象III）をテストすることを追求した。 シャーレに合成低アンモニウムデキストロース(SLAD)を入れ、シャーレの中央に栄養剤を置いた。 酵母細胞は中心からの距離を変えて播種し、16日間成長させた後に写真を撮った。 さらなる実験の詳細は、セクション 3 に示す。 限定栄養剤として、グルコースと硫酸アンモニウムの両方を使用し、それぞれの代表的な画像を図5に示す。 画像は、栄養剤を入れたシャーレの中心が右側になるように配置されている。 アンモニウムの水中での拡散率は約9.84×10-2 mm2 min-1 41である。 これはグルコースの拡散係数と同じオーダーであることから、各栄養源のΔは同程度の値になると考えられる。 いずれのコロニーも成長に顕著な偏りは見られず、偏り指数I bはどちらもほぼ正確に0.5となる。 各試験の有効拡散係数Δmと無次元拡散係数Δを表2に示す。 いずれの場合もΔは-3のオーダーであり、有向成長は見られないはずであり、以前の実験の結果と一致する。

S. cerevisiaeを用いた有向成長実験からの画像である。 画像は、対応する栄養素が、縦のテキストで示されるように、コロニーの右側にあるように方向付けられている。 コロニーは、(a) グルコースを右に添加したSLAD-G、(b) 硫酸アンモニウムを右に添加したSLAD-N上で生育させた。

成長モードのさらなる証拠は、コロニーの端付近の挙動によって提供される。 もしこのパターンがDLGによるものであれば、両方の培地で同じような挙動を示すと予想される。 しかし、この実験で使用したAWRI796株のような2倍体酵母は、SLAD-Nのような窒素2が奪われると偽菌糸成長に切り替わることが知られている。 このことから、図1のような酵母コロニーで観察される不均一な増殖は、DLGではなく偽菌糸の増殖によるものであると考えられる

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