結果と考察

我々の新しいAMHS法は、ハチの循環系の解剖学的／機能的構造によって促進されている。 循環は背側と腹側の横隔膜の脈動収縮によって強制的に行われ、血流を心臓に送り込む。 次に、大動脈が血液リンパを頭部へと輸送し（図 1F）、ハチの脳と触角に血液リンパを供給する。

TCHS と比較して、AMHS はより短時間かつ少人数で 80-100μL の無菌血液リンパを収集することができ、黒化リスクを最小化することができました。 血リンパ採取の際には、空気との接触時間を短くすることが重要であると考えています。 採取時間を短くし、冷却工程に早く移行することで、メラニン化のリスクを低減することができます。 採集時間の短縮に加え、昆虫の使用が減ることも、TCHSに比べたAMHSの大きな利点である。 セイヨウミツバチの研究は常に、危害を加えなければならないハチの数を最小限にするよう設計する必要があります。 AMHS を用いて必要な量の血リンパを採取するために必要なハチの数を減らすことは、研究において動物をより倫理的に使用するための指導原則に合致している。

血リンパは、心臓、背側または腹側胸郭洞、背側大動脈を穿刺するなど、さまざまな方法を用いて毛細管で採取することがほとんどである。 これらの方法は、いずれも心室を穿刺してしまい、腸の内容物で試料が汚染される危険性がある。 このような汚染は、サンプルを使用できなくするだけでなく、次の使用までにキャピラリーを新しいものに交換するか、洗浄・消毒する必要があるため、全体の血球採取時間が長くなってしまいます。 また、血流の無菌性は、腹部のセグメントをつなぐ膜に穴を開けることによっても損なわれることがあります。 AMHSを使用することで、このような毛細血管に関連する問題を解消することができます。 さらに、断頭による血 清採集では、ハチの胃から漏れる花蜜で血 清が汚染される可能性がある。 私たちの新しいAMHSは、生物学的品質の高い血リンパサンプルを得ることができました。 AMHSによって得られた各血液サンプルには、血球がはっきりと確認できた（図1C）。 各顕微鏡スライドの分析から、AMHS で得られた血リンパサンプルは、汚染物 (花粉粒など) がなく、純粋で透明であることがわかった。

AMHS の性能として、エタノール消毒と血リンパ滴とハチの体の限られた接触により、サンプルの無菌性が保証されると予想された。 この予想は、微生物学的アッセイによって確認された。 AMHS によって得られた血 清を MRS およびサブロー寒天培地で培養したところ、血 清の無菌性が確認された。 100滴の血リンパをプレーティングしても、微生物の増殖は観察されなかった。 したがって、ここでは定量的な結果は示していない。 培養期間終了後、各ドロップの周囲に黒褐色の円状にメラニン化した血リンパが観察されたのみであった。 このメラニン化は、サンプリング中ではなく、インキュベーション期間中に起こった（Fig.1DおよびFig.1E）。 注目すべきは、採取した血液リンパを微生物学的検査に使用しない場合、消毒のステップを省略できることである。 5094>

方法論以外の要因も、血リンパの採取効率に影響を与える可能性がある。 我々の以前の研究では、ハチから採取した血 清の量はハチのカーストや年齢だけでなく、血 清採取前に摂取した花蜜やシュガーシロップの量に基づ いて測定した水分補給の度合いにも依存することが確認され た。 Ptaszyńska 他は、高齢のハチから適切な量の血 清をサンプリングしてもあまり効果がないと報告している。 さらに、サンプリング効率は研究者の実験技術に依存する可能性がある。 これらの要因により、異なる研究室で行われ、異なる生物を使用した研究間で、異なる血 清サンプリングプロトコルの定量的特性を比較することは困難である。 注目すべきは、これまでの研究において、我々は AMHS や TCHS を含む他の方法を用いて数千匹のハチから血 清をサンプリングしてきたことである。 私たちの研究所のスタッフは、年齢や種族が異なるハチから血液リンパを採取した経験が豊富である。 この経験は、異なるサンプリング方法の比較に役立った。なぜなら、実験室スタッフのスキルのばらつきによる誤差の影響を受けなかったからである。 AMHS 以外の方法では、一般的にマイクロキャピラリーチューブなどの追加装置を必要とする。 さらに、マイクロキャピラリーチューブから血リンパを除去するためには、特別なポンプを使用するか、チューブを砕いてビーズで遠心分離する必要がある。 AMHSのもう一つの利点は、ピペットスケールを使って、どのハチから採取した血精液の量も測定できる可能性があることです。 これは、例えば酵素活性の測定など、微量サンプルの生化学的分析を行う際に特に有用である。 AMHS 以外の方法を適用する場合、サンプリング前のチューブ内の血球シンナー量とサンプリング後の血球シンナー量の測定値から、純粋な血球量を間接的に計算できることは注目に値する。 しかし、このような方法では、さらに誤差が生じる可能性があるため、研究者の中には、ハミルトン社のシリンジを使用している人もいます。

Mayack and Naug法（触角を切り取った蜂を回転させて血リンパを採取する）は、AMHSに類似している。 しかし、彼らの方法は実験室用の遠心分離機を必要とし、また、汚染の可能性を防ぐために、アピアの口部分を接着剤で閉じなければならなかった。 さらに、彼らの研究では、紡糸の前にノゼマ・セラネの感染を評価するために、ミツバチの内臓を解剖している。 この工程がなければ、内臓が汚染源となる可能性が高い。 彼らの方法では、ハチを遠心分離機のチューブに入れ、16,000 RCF で 30 秒間回転させ、血リンパを採取した。 このプロセスでは、血球成分（タンパク質や血球など）が層状化する可能性があり、微生物汚染や血球のメラニン化（上述参照）のリスクも高まる。 彼らの研究のように、あらかじめ内臓を取り除いたミツバチの採餌者の血リンパ糖レベルを分析するには理想的かもしれませんが、微生物学的・遺伝学的研究や酵素活性の調査には全く適していません。 その点、我々の新しいAMHS法は、簡便で一般的な使用に適しており、様々な種類の研究に幅広く適用できる可能性がある

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