Discreet model
De groei van een microbiële kolonie die een diffunderende voedingsstof verbruikt, wordt voorgesteld met behulp van het rooster-gebaseerde model dat door Matsuura23 werd geïntroduceerd en waarvan de details in hoofdstuk 3 worden gegeven. In het kort beschouwen we een rechthoekig rooster met L x- en L y-plaatsen in respectievelijk de x- en y-richting. Het aantal bezette cellen wordt aangeduid met ν en de overeenkomstige celdichtheid ρ = ν/(L x L y ). Elk element van het rechthoekige rooster mag ten hoogste één cel bevatten, maar mag een niet-negatief geheel getal aan voedingsdeeltjes bevatten, ongeacht of er zich op die plaats ook een cel bevindt. Bij elke tijdstap kunnen de gistcellen een voedingsdeeltje absorberen dat zich op dezelfde plaats bevindt en een enkele dochtercel produceren op een aangrenzende plaats in een kardinale richting, terwijl voedingsdeeltjes s stappen kunnen zetten, opnieuw in de kardinale richtingen. Als beginvoorwaarde worden cellen in een voorgeschreven patroon binnen het rooster uitgezaaid, terwijl een aantal voedingsdeeltjes uniform en willekeurig binnen het domein wordt geplaatst om een gespecificeerde gemiddelde beginconcentratie c0 te verkrijgen. De grenzen van het domein worden behandeld als massieve wanden, waarmee het experimentele gedrag binnen een petrischaal wordt nagebootst. Belangrijk is dat de door dit model geproduceerde patronen het resultaat zijn van de interactie tussen de cellen en de voedingsstof alleen, zodat alle door het model geproduceerde niet-uniforme morfologieën volledig aan DLG kunnen worden toegeschreven.
Karakteristieke DLG-morfologieën
Matsushita & Fujikawa12 gebruikte een kolonie van B. subtilis cellen om drie belangrijke verschijnselen te illustreren die door DLG ontstaan: (I) de “screening” van kortere takken door langere; (II) afstoting tussen naburige kolonies; en (III) groei gericht op een voedingsbron (Fig. 2). Eerder werd aangetoond dat deze kenmerken uitsluitend het gevolg zijn van DLG, gebruik makend van een rastermodel van koloniegroei gelijkaardig aan het hier gebruikte model30. We bevestigen eerst dat het hierboven beschreven discrete model dit gedrag kan reproduceren alvorens dit model te gebruiken om de geproduceerde patronen te kwantificeren.
Experimentele resultaten van Matsushita & Fujikawa12 (bovenste rij) met overeenkomstige modelsimulaties (onderste rij). Afgebeeld zijn (a) grotere takken die kleinere takken van voedingsstoffen afschermen (verschijnsel I), (b) twee dicht bij elkaar gezaaide kolonies die elkaar lijken af te stoten (verschijnsel II), en (c) een enkele kolonie die naar de voedingsbron aan de rechterkant van het petrischaaltje groeit (verschijnsel III). Simulaties van (d) screeningtakken, (e) twee kolonies in elkaars nabijheid en (f) groei met voedingsstof aan de rechterkant zijn berekend met behulp van het op rasters gebaseerde model. De zaadcellen zijn gemarkeerd met een rode stip. De simulaties zijn berekend op rasters met afmetingen L x = L y = 200 met parameters s = 3 en c0 = 1, die resulteren in een waarde van Δ van dezelfde orde van grootte als in de experimenten. De figuren 2(a), 2(b) en 2(c) zijn overgenomen uit Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 168, Mitsugu Matsushita en Hiroshi Fujikawa, Diffusion-limited growth in bacterial colony formation, 498-506, 1990, met toestemming van Elsevier.
De interactie tussen de cellen en de voedingsstof kan globaal worden gekwantificeerd door vergelijking van de relatieve verspreidingssnelheid van deze twee grootheden. De groei van de kolonie wordt gemeten door berekening van de gemiddelde veranderingssnelheid van het kolonieoppervlak Δ m van bovenaf gezien, die dezelfde eenheden heeft als de diffusiviteit. Deze grootheid kan gemakkelijk worden berekend aan de hand van een experimenteel beeld of van gesimuleerde gegevens, zoals die welke door het discrete model worden geproduceerd. Als diffusiegrootheid van de voedingsstof Δ n wordt de diffusiecoëfficiënt van glucose genomen, aangezien dit algemeen als voedingsbron wordt gebruikt en er weinig verschil is tussen de diffusiecoëfficiënt van verschillende voedingsstoffen. Op basis van experimentele waarnemingen is bekend dat de diffusiecoëfficiënt van glucose in water ongeveer {D}_{0}=4,03 keer {10}^{-2})mm2 min-1 bedraagt36. Voor glucose in een agar-gel met lage dichtheid wordt de diffusie gegeven door $
waarbij w het gewichtspercentage agar is37. Uitgaande van w = 0,3%, is de diffusie 4,01×10-2 mm2 min-2, de waarde die in het vervolg van deze studie wordt gebruikt. De diffusie verandert weinig met de hoeveelheid agar, zodat w een verwaarloosbaar effect heeft op de resultaten. Uit deze hoeveelheden berekenen we de verhouding
die een dimensieloze maat is voor de relatieve verspreidingssnelheden. Bij kleine waarden van Δ diffundeert de voedingsstof sneller dan de celgroei, hetgeen betekent dat plaatselijke variaties in de voedingsstofconcentratie zullen verdwijnen zonder de morfologie van de kolonie te beïnvloeden. Een waarde van Δ van 1 of meer geeft aan dat de celgroei minstens even snel verloopt als de nutriëntdiffusie en dat lokale variaties in de nutriëntconcentratie een impact kunnen hebben op de koloniemorfologie. Van de drie experimentele beelden heeft alleen het beeld van gerichte groei voldoende informatie over zowel de schaal als de tijd die nodig is om Δ te berekenen. Uit dit beeld vinden we dat Δ ≈ 0,23. Instelling van s = 3 en c0 = 1 in het model levert oplossingen op met waarden van Δ tussen 0,3 en 0,5, wat van dezelfde orde van grootte is als de experimentele resultaten en dus een geschikte vergelijking oplevert. Deze parameterwaarden worden voor het vervolg van deze paragraaf gebruikt. Het gedrag in elk van de drie gevallen wordt verder gekwantificeerd met behulp van ruimtelijke indices, die hieronder worden beschreven, vergelijkbaar met de aanpak van Binder et al.38. Elke simulatie maakt gebruik van een rooster met afmetingen L x = L y = 200, wat groot genoeg is om kenmerken met voldoende resolutie te produceren en toch rekenkundig efficiënt te zijn.
Om vertakkingsafscherming (verschijnsel I) te onderzoeken, wordt voedingsstof uniform willekeurig over het domein uitgezaaid en wordt een enkele cel in het midden van het rooster geplaatst. De simulatie wordt uitgevoerd totdat de totale celdichtheid 0,2 bereikt, zoals geïllustreerd door de representatieve kolonie in Fig. 2. Deze kolonie vertoont grote vertakkingen die uitgaan van de plaats van de initiële centrale cel, met daartussen kortere vertakkingen die door de grotere vertakkingen van voedingsstoffen zijn afgeschermd, en vertoont een aanzienlijke niet-uniforme groei. Dit komt overeen met het door Matsushita & Fujikawa12 waargenomen gedrag. De morfologie kan worden gekwantificeerd door eerst de hoeken tot elke cel te tellen, gemeten tegen de wijzers van de klok in ten opzichte van een referentiehoek met de oorsprong in het massamiddelpunt. De tellingen worden geschaald met de verwachte waarden voor cellen die willekeurig uniform verdeeld zijn, en de hoekindex van niet-uniforme groei I θ wordt gedefinieerd als de standaardafwijking van de geschaalde tellingen, zodat grotere waarden van I θ grotere niveaus van niet-uniforme groei aangeven. Het experimentele beeld heeft index 0,18, terwijl de simulatie index 0,2 heeft, wat aangeeft dat de twee in nauwe overeenkomst zijn.
Voor het geval van afstotende kolonies (verschijnsel II), wordt de voedingsstof opnieuw uniform willekeurig over het domein geplaatst. Twee zaadcellen worden verticaal in het midden van het domein geplaatst, elk een achtste van de breedte van het domein horizontaal van het centrum verwijderd, zodat de cellen worden gescheiden door een kwart van de totale breedte van het domein. De simulatie wordt doorgerekend tot de totale celdichtheid 0,2 bereikt. Een typische simulatie wordt getoond in fig. 2, waarin de door Matsushita & Fujikawa12 waargenomen kloof tussen de twee kolonies wordt weergegeven. Afstotende kolonies kunnen worden gekwantificeerd door aan het eind van de simulatie het totale aantal cellen ν en het aantal cellen ν c tussen de twee zaadcellen te tellen. De afstotingsindex wordt dan gedefinieerd als I c = 1 – ν c /ν, die dicht bij 0,5 ligt wanneer de twee kolonies gelijkmatig groeien, kleiner is dan 0,5 wanneer zich een kloof vormt, en groter is dan 0,5 wanneer de kolonies een voorkeur vertonen om naar elkaar toe te groeien. De locaties van de zaadcellen voor elke kolonie in het experimentele beeld worden benaderd door lijnen langs de takken te trekken en na te gaan waar deze elkaar snijden. Het experimentele beeld en de simulatie hebben indices van respectievelijk 0,19 en 0,27, hetgeen suggereert dat beide vergelijkbare groeipatronen produceren met een aanzienlijke kloof tussen de twee kolonies.
Gerichte groei (verschijnsel III) wordt gesimuleerd door aanvankelijk alle voedingsstoffen in de meest rechtse kolom van het domein te plaatsen, met een enkele cel in het midden van het domein. De simulatie wordt vervolgens doorgerekend totdat de celdichtheid 0,1 bereikt. Een typische kolonie wordt getoond in fig. 2, die sterk overeenkomt met het experimentele resultaat van Matsushita & Fujikawa12. Om de bias naar één kant van het domein te meten berekenen we het aandeel I b van cellen aan de rechterkant van het domein ten opzichte van het totale aantal cellen, zodat I b ∈ . Waarden van de index I b dicht bij 0,5 wijzen op weinig vertekening, terwijl I b < 0,5 wijst op vertekening naar rechts en I b < 0,5 wijst op vertekening naar links. Het experimentele beeld heeft index 0,92, wat dicht bij de simulatie-index van 0,93 ligt. In beide gevallen wijzen de indices op een grote bias van de groei in de richting van de initiële voedingslocatie.
Zoals gevonden door Ginovart et al.30, tonen de goede kwalitatieve overeenkomsten tussen de experimentele beelden en de simulaties aan dat DLG alleen de screening, afstoting en gerichte groei van B. subtilis-kolonies kan produceren. Wij hebben deze vergelijking nog versterkt door het gebruik van een kwantitatieve vergelijking tussen de experimenten en een mathematisch model. Zo verwachten wij dat deze verschijnselen aanwezig zijn wanneer DLG de morfologie beïnvloedt, terwijl de afwezigheid van deze kenmerken suggereert dat andere mechanismen verantwoordelijk zijn voor het groeipatroon. Van cruciaal belang is dat de overeenkomst tussen het discrete model en het door Ginovart et al. voorgestelde model aantoont dat het hier gebruikte discrete model een bevredigende voorstelling van DLG geeft en dus kan worden gebruikt om dit gedrag te kwantificeren.
Induceren van DLG
Nadat we hebben aangetoond dat het discrete model in staat is DLG-gedrag te repliceren, kwantificeren we hier de afhankelijkheid van deze verschijnselen van de modelparameters om te voorspellen wanneer DLG-effecten zullen optreden. De kolonies worden opnieuw gesimuleerd op een rooster met afmetingen L x = L y = 200, met dezelfde drie beginvoorwaarden en stopcriteria als in de vorige subparagraaf. Simulaties worden 50 keer herhaald voor elk paar voedingsstappen s = 1, 5, …, 37 en beginconcentraties c0 = 1, 2, …, 7. Voor elk parameterpaar berekenen we de desbetreffende gemiddelde index over de 50 realisaties.
Om de screening van vertakkingen (verschijnsel I) te onderzoeken, beschouwen we kolonies die zijn gegroeid uit één enkele cel in een uniform voedingsveld, met de overeenkomstige waarden van de gemiddelde index \({\bar{I}}_{\theta } }) over de 50 realisaties die in fig. 3 worden getoond. De grootste waarden van ({\bar{I}}_{\theta } }) ontstaan wanneer zowel s als c0 klein zijn, wat te wijten is aan twee factoren. Ten eerste, omdat de diffusie van voedingsstoffen, effectief s, klein is in verhouding tot de snelheid van de celgroei, ontstaan er fluctuaties in de voedingsstofniveaus over het hele domein. Ten tweede betekent de lage aanvankelijke nutriëntenconcentratie c0 dat deze schommelingen regio’s doen ontstaan waar het nutriëntenniveau te laag is om de celgroei te ondersteunen. Wanneer s of c0 groter is, kan ten minste één van deze condities zich niet voordoen en wordt de waarde van DLG kleiner, wat erop wijst dat DLG niet langer een significante invloed op de kolonie heeft. Deze resultaten geven dus aan dat niet-uniforme patronen alleen kunnen optreden wanneer zowel de diffusie van voedingsstoffen, in verhouding tot de snelheid van de celgroei, als de voedingsstofconcentratie klein zijn.
Metingen van DLG-effecten in gesimuleerde microbiële kolonies. Alle simulaties zijn berekend met het rastermodel met een reeks voedingsstappen s en aanvankelijke voedingsstofconcentraties c0. Afgebeeld zijn (a) de gemiddelde index \({\bar{I}}_{\theta }}) voor vertakkingsafscherming (verschijnsel I), (b) de gemiddelde index \({\bar{I}}_{c}}) voor afstotende kolonies (verschijnsel II), en (c) de gemiddelde index \({\bar{I}}_{b}}) voor gerichte groei (verschijnsel III).
Hetzelfde gedrag wordt waargenomen voor het afstotende geval (verschijnsel II), zoals blijkt uit de gemiddelde index \({\bar{I}}_{c}}) die in fig. 3 is uitgezet. De grootste waarden van de index worden gevonden bij kleine waarden van s en c0, wat om dezelfde redenen gebeurt als voor \({\bar{I}}_{theta}}).
Het gedrag voor gerichte groei (verschijnsel III) is anders, zoals blijkt uit de gemiddelde index \({\bar{I}}_{b}}) die in fig. 3 is uitgezet. Bij kleine waarden van s is de index ({\bar{I}}_{b}}) groot en varieert hij weinig met c0. Naarmate s toeneemt, neemt \({\bar{I}}_{b}}) af en is er een grotere afhankelijkheid van c0, met grotere waarden van \({\bar{I}}_{b}}) bij lagere c0. Het bereik van parameterwaarden waarbinnen gerichte groei kan worden waargenomen is veel groter dan voor de andere twee DLG verschijnselen. Als gerichte groei niet optreedt, zullen de andere twee verschijnselen dat ook niet doen, en dus is gerichte groei een nuttige eerste controle voor DLG die eenvoudig te meten is. Deze eigenschap zal in de rest van dit werk worden gebruikt om DLG te testen.
Continuummodel
Het ontstaan van DLG-verschijnselen hangt af van zowel de nutriëntenconcentratie als de diffusiviteiten van de twee soorten. Hoewel de indices de afhankelijkheid van deze verschijnselen meten van het aantal discrete voedingsstappen s en de aanvankelijke voedingsstofconcentratie c0, kon de waarde van Δ alleen uit de gesimuleerde gegevens worden berekend en niet als invoer in het model worden gespecificeerd. Bij het beschouwen van experimentele gegevens is het echter natuurlijk om de relatieve spreiding van de cellen en de voedingsstof te karakteriseren met Δ, aangezien deze gemakkelijk kan worden gemeten aan de hand van experimentele beelden. Wij introduceren hier een deterministisch stelsel van reactie-diffusievergelijkingen die de celdichtheid en de voedingsstofconcentratie modelleren en de specificatie van de relatieve diffusie van elke grootheid mogelijk maken, wat overeenkomt met de instelling van Δ. Hoewel dit model niet geschikt is om de fijne kenmerken die in Fig. 2 worden waargenomen te vatten, is het in staat om gerichte groei naar een voedingsbron (fenomeen III) te repliceren, wat bleek op te treden over het grootste bereik van parameters. Wij concentreren ons daarom op dit aspect van DLG, dat fungeert als een gemakkelijk meetbaar teken dat DLG optreedt.
Wij beschouwen een eendimensionaal domein, dat voldoende is om het algemene gedrag van het model te illustreren29,32,39. Met behulp van de dimensieloze positie x, tijd t, celdichtheid n(x,t) en nutriëntenconcentratie g(x, t), beschreven in hoofdstuk 3, worden de regerende vergelijkingen gereduceerd tot
Als beginvoorwaarden worden de cellen in het midden van het domein geplaatst, waarbij de voedingsstof naar rechts wordt gebundeld volgens
waarbij N kan worden geïnterpreteerd als een dimensieloze nutriëntenconcentratie. Ter illustratie van het algemene gedrag zijn de beginvoorwaarden voor N = 1 weergegeven in fig. 4.
Resultaten van het eendimensionale reactie-diffusiemodel. (a) De begintoestand voor N = 1 toont de cellen geconcentreerd in het midden van het domein met de voedingsstof naar rechts. (b) De maximumwaarden van I b tot het tijdstip t = 1, uitgezet tegen de logaritme van D en N op basis 10, wijzen erop dat DLG slechts bij bepaalde parameterwaarden optreedt. Twee representatieve voorbeelden zijn aangegeven. (c) Bij de grootste waarde van I b bij D = 10-6 en N = 1 zijn de cellen nog vrijwel symmetrisch rond x = 0, terwijl de voedingsstofconcentratie effectief uniform is geworden. (d) Bij gebruik van D = 10-0,5 en N = 105 ontstaat een aanzienlijke afwijking naar het rechterlid, waar de voedingsstof aanvankelijk geconcentreerd was.
Wanneer de typische parameterwaarden van hoofdstuk 3 als vast worden beschouwd, varieert de waarde van N alleen als gevolg van de fysische voedingsstofconcentratie. Wanneer men uitgaat van een medium dat uitsluitend voedingsstoffen bevat, hetgeen een maximale concentratie vertegenwoordigt, vinden we dat de waarde van N niet groter kan zijn dan ongeveer 105. De oplossingen worden dus berekend voor 1 ≤ N ≤ 105. Terwijl typische experimentele waarnemingen suggereren dat 10-3 ≤ D ≤10-1, beschouwen wij waarden voor 10-6 ≤ D ≤103 om theoretisch na te gaan hoe het gedrag verandert met D. Voor verschillende waarden van deze parameters berekenen wij de maximumwaarde van I b die tot tijdstip t = 1 wordt waargenomen. Dit komt overeen met ongeveer 119 dagen groei, wat weliswaar groter is dan de typische experimentele tijd, maar toch garandeert dat de maximumwaarde van I b tijdens de simulatie wordt waargenomen. De berekende indices I b zijn uitgezet in Fig. 4, waarbij voor beide assen een logaritmische schaal in basis 10 is gebruikt. Voor log(N) < 1 is er weinig of geen bias in de groei van de cellen, zoals gemeten door I b . Bij grotere waarden van N hangt de mate van vertekening af van de waarde van D, met een maximum in de buurt van (D,N) = (1, 105). Deze waarde van D komt overeen met even grote cel- en voedingsstoffendiffusies en rond deze waarde is het mogelijk een vertekening in de groei waar te nemen voor waarden van N die zo klein zijn als 101,5. Onder typische experimentele omstandigheden heeft N orde van grootte 2, hetgeen erop wijst dat DLG-effecten het meest waarschijnlijk worden waargenomen wanneer D dicht bij eenheid ligt.
Het gedragsbereik wordt verder geïllustreerd door de verdelingen van twee contrasterende voorbeelden te beschouwen. In elk geval wordt de oplossing getoond op het tijdstip dat overeenkomt met de maximale celvertekening. Voor D = 10-6 en N = 1, getoond in Fig. 4, is de voedingsstofconcentratie effectief uniform geworden voordat de celdichtheid een duidelijke vertekening naar rechts, waar de voedingsstof aanvankelijk geconcentreerd was, kan ontwikkelen. Wanneer daarentegen D = 10-0,5 en N = 105, eveneens afgebeeld in fig. 4, vertonen de cellen een duidelijke voorkeur voor het rechterdeel van het domein.
De analyse van het continuümmodel suggereert dat, als D(D)1, dan gerichte groei, en dus eventuele DLG-effecten, alleen zullen optreden bij waarden van N die ten minste zo groot zijn als 103. Aangezien schattingen aangeven dat N ordegrootte 2 heeft, suggereert dit dat DLG alleen zal worden waargenomen wanneer D dicht bij eenheid ligt, zoals blijkt uit Fig. 4. Dit kan ook worden geïllustreerd aan de hand van fysische parameters. Uitgaande van de in hoofdstuk 3 gegeven parameterwaarden zouden microben met een diffusiviteit ↪({D}_{m}=3 keer {10}^{-2})mm2 min-1, geplaatst in een omgeving met een maximale initiële nutriëntenconcentratie ↪({N}_{0}}mathrm{=3,8} keer {10}^{-3})g mm-2, ongeveer overeenkomen met de dimensieloze waarden D = 0,75 en N = 104. Uit fig. 4 kan worden afgeleid dat deze soort naar een voedingsbron toe zou groeien en dus DLG-gedrag zou vertonen. Als dezelfde microben in een omgeving met een maximale nutriëntenconcentratie van {N}_{0}}3,8} maal {10}^{-6})g mm-2 zouden worden geplaatst, zou de waarde van N dalen tot 10 en zou er geen vertraagde groei meer worden waargenomen. De resultaten van dit hoofdstuk bieden dus een kader om te bepalen wanneer DLG wordt verwacht op basis van alleen schattingen van D en N.
Experimentele vergelijkingen
Nu we de modelvoorspellingen hebben onderzocht, gebruiken we deze om het dominante groeimechanisme in microbiële kolonies te identificeren. We beschouwen de drie representatieve experimentele voorbeelden in Fig. 1: twee kolonies van de bacterie B. subtilis en één kolonie van S. cerevisiae. Aangezien wij de juiste waarde van de diffusieverhouding D, die door het reactie-diffusiemodel wordt vereist, niet kennen, wordt de groei in plaats daarvan gekarakteriseerd door de relatieve spreiding Δ (2). Deze parameter is de verhouding tussen de gemiddelde veranderingssnelheid van de oppervlakte van de kolonie, van bovenaf gezien, en de diffusie van glucose en kan aan de hand van de beelden worden gemeten. Aangezien de voedingsstof uniform is verdeeld en slechts één kolonie wordt gekweekt, zal DLG zich in deze voorbeelden naar verwachting manifesteren als onregelmatige groei met vertakking (fenomeen I).
De berekende waarden van de groeisnelheden Δ m worden gegeven in tabel 1, samen met de overeenkomstige relatieve snelheden Δ. Deze waarden geven aan dat de B. subtilis-kolonies twee orden van grootte sneller groeien dan de gistkolonie en één orde van grootte langzamer dan de diffusie van glucose. Gebruik van typische waarden voor de aanvankelijke voedingsstofconcentratie suggereert dat de experimenten overeenkomen met een waarde van N die orde van grootte 2 heeft. Overeenstemming van deze schatting en de waarden van Δ met de modelresultaten van Fig. 4 geeft aan dat B. subtilis overeenkomt met een regime waarin gerichte groei ten gevolge van DLG zal optreden. Aangezien deze schatting werd gemaakt door meting van de celdeling p binnen een kolonie van S. cerevisiae, die waarschijnlijk kleiner is dan de overeenkomstige waarde voor bacteriën, zal dit naar verwachting een onderschatting zijn voor N en verhoogt een grotere waarde van N de waarschijnlijkheid dat DLG wordt waargenomen. Daarentegen heeft de S. cerevisiae kolonie een Δ met orde van grootte -3, hetgeen erop wijst dat de nutriënt zich op een veel snellere tijdschaal verspreidt dan die van de celgroei. Bijgevolg wordt verwacht dat lokale variaties in de nutriëntenconcentratie zullen verdwijnen vooraleer ze een invloed hebben op de morfologie van de kolonie. Dit wijst erop dat de morfologie niet wordt beïnvloed door DLG. Ondanks de sterke gelijkenis tussen de vormen van bacterie- en gistkolonies in omgevingen met een laag nutriëntengehalte, zijn deze twee morfologieën dus het gevolg van verschillende verschijnselen. Bacteriële kolonies groeien op een voldoende snelle tijdschaal dat diffusie van voedingsstoffen de groei kan beperken, wat resulteert in een onregelmatig patroon. De veel tragere groei van gistkolonies betekent dat DLG niet kan optreden en dat in plaats daarvan de niet-uniforme koloniemorfologie die in omgevingen met weinig voedingsstoffen ontstaat, uitsluitend te wijten moet zijn aan pseudohyfengroei.
We probeerden deze resultaten verder te bevestigen door te testen op gerichte groei (verschijnsel III) in kolonies van S. cerevisiae, waarbij de opstelling werd nagebootst die werd gebruikt door Matsushita & Fujikawa12 en in de simulaties40. Een petrischaal werd gevuld met synthetische laag-ammonium dextrose (SLAD) met voedingsstof geplaatst in het midden van de petrischaal. Gistcellen werden op verschillende afstanden van het centrum uitgezaaid en na 16 dagen groei gefotografeerd. Verdere experimentele details worden gegeven in hoofdstuk 3. Zowel glucose als ammoniumsulfaat werden als beperkte voedingsstof gebruikt; de representatieve beelden voor beide worden in fig. 5 getoond. De afbeeldingen zijn zo georiënteerd dat het midden van het petrischaaltje, waar de voedingsstof was geplaatst, zich aan de rechterkant bevindt. De diffusiecoëfficiënt van ammonium in water bedraagt ongeveer 9,84×10-2 mm2 min-1 41. Aangezien dit van dezelfde orde van grootte is als de diffusie van glucose, zal elke voedingsbron naar verwachting resulteren in een vergelijkbare waarde van Δ. Geen van beide kolonies vertoont een merkbare bias in de groei in welke richting dan ook, en beide produceren biasindices I b die bijna precies gelijk zijn aan 0,5. De effectieve diffusiviteiten Δ m en de dimensieloze diffusiviteiten Δ voor elke proef zijn vermeld in tabel 2. In beide gevallen heeft Δ orde van grootte -3, wat erop wijst dat geen gerichte groei mag worden waargenomen en overeenstemt met de resultaten van de vorige experimenten.
Afbeeldingen van de experimenten met gerichte groei met S. cerevisiae. De afbeeldingen zijn zo georiënteerd dat de overeenkomstige voedingsstof zich aan de rechterkant van de kolonie bevindt, zoals aangegeven door de verticale tekst. De kolonies werden gekweekt op (a) SLAD-G met glucose toegevoegd aan de rechterkant en (b) SLAD-N met ammoniumsulfaat toegevoegd aan de rechterkant. De schaalbalken stellen 5 mm voor.
Verder bewijs voor de groeimodus wordt geleverd door het gedrag nabij de rand van de kolonies. Er zijn duidelijke tekenen van niet-uniforme groei rond de rand van de kolonie gekweekt op SLAD-N, maar niet op de kolonie gekweekt op SLAD-G. Als dit patroon te wijten was aan DLG, zouden we een vergelijkbaar gedrag op beide media verwachten. Het is echter bekend dat diploïde gisten, zoals de AWRI796-stam die in dit experiment werd gebruikt, overschakelen op pseudohyfengroei wanneer ze verstoken zijn van stikstof2, zoals SLAD-N. Dit suggereert dat de niet-uniforme groei die in gistkolonies wordt waargenomen, zoals in Fig. 1, te wijten is aan pseudohyfale groei en niet aan DLG.