Het opzetten van systemen voor genetische transformatie heeft wetenschappers in staat gesteld vreemd DNA in filamenteuze schimmels te transformeren en zo de gewenste stammen voor industriële doeleinden te verkrijgen. We kunnen nu ten volle profiteren van het superieure secretievermogen van schimmels en hun uitstekende efficiëntie in de productie van waardevolle metabolieten.

Protoplast-gemedieerde transformatie (PMT)

PMT is de meest gebruikte schimmel transformatie methode, die afhankelijk is van een groot aantal bevoegde schimmel protoplasten. Het principe bestaat erin enkele in de handel verkrijgbare enzymen te gebruiken om de complexe celwandcomponenten van de schimmel te verwijderen en zo protoplasten te genereren. Vervolgens worden enkele chemische reagentia (zoals PEG) gebruikt om de fusie van exogene nucleïnezuren en protoplasten te bevorderen, zoals hieronder nader wordt beschreven. De componenten van de schimmelcelwand zijn zeer variabel bij verschillende stammen. Zelfs de componenten van de sporehuid verschillen aanzienlijk van die van hyphen van dezelfde stam. Er bestaat dus geen universele transformatiemethode die op verschillende schimmelstammen kan worden toegepast. De bereiding van protoplasten kan nauwelijks worden gestandaardiseerd. Een deel van de moeilijkheden is te wijten aan onze beperkte kennis van celwandhydrolasen. De ontwikkeling van een geoptimaliseerde PMT-methode voor schimmels vergt nog aanzienlijke inspanningen.

PMT is een routinematig gebruikte transformatiemethode. De methode is voortdurend verbeterd om een hogere efficiëntie te bereiken voor genetische transformatie en voor het richten van geschikte genloci door middel van gen-editing. Voor de bereiding van protoplasten moet de celwand worden verwijderd, wat voornamelijk wordt bereikt door enzymatische behandeling. Er zijn ook niet-enzymmethoden voor de bereiding van protoplasten gerapporteerd, zoals fysische methoden met inbegrip van malen en supersonische golfschok. Zij worden echter niet op grote schaal gebruikt wegens het praktische ongemak en de lage opbrengst van protoplasten. Een samenvatting van protoplast-gemedieerde transformatieprotocollen voor verschillende schimmelsoorten worden gegeven in tabel 1.

Basisstappen van de PMT-methode

PMT werd voor het eerst toegepast op Saccharomyces cerevisiae. Onderzoekers bereidden protoplasten met de commerciële snailase, en gebruikten sorbitol om protoplasten te bewaren. Later werd deze methode toegepast op filamenteuze schimmels, zoals Neurospora crassa, en A. nidulans. Hoewel de transformatiemethoden zijn verbeterd, blijven de basisstappen in wezen dezelfde. De basisstappen van de PMT-methode worden gegeven in Fig. 1.

Basisstappen van de protoplast-gemedieerde transformatie

Voorbereiding van de protoplasten

De eerste stap bij de protoplastvoorbereiding is de verwijdering van de celwand door enzymatische vertering. De schimmelcelwand bestaat uit glucan, mannan en chitine. De structuur van de schimmelcelwand is zeer dynamisch, en de celwand varieert tijdens de celdeling en groei van schimmels, alsook bij de kieming van de sporen, de vertakking van de hyfen en de vorming van het diafragma. De celwandbestanddelen zijn ook verschillend bij verschillende schimmelsoorten, zodat verschillende enzymen in combinatie moeten worden gebruikt. Er is gerapporteerd dat de selectie van een geschikt enzymmengsel een sleutelfactor is bij het protoplastpreparaat .

In het algemeen zijn de hyfen gevoelig voor een geschikt enzym dat de celwand hydrolyseert tijdens de logaritmische fase. In de PMT-procedure van Neurospora worden de protoplasten bereid door hydrolyse van de pasgeboren hyphae (cultuur gedurende 4-6 uur bij 25-30 °C). Op dezelfde wijze kunnen ook protoplasten worden bereid met conidiosporen. Bijvoorbeeld, voor Aspergillus en Penicillium, kan men kiezen voor germinale sporen of thalli .

Protoplasten zijn gevoelig voor osmotische druk, zorg moet worden genomen om een stabiele osmotische druk te handhaven om de protoplasten intact te houden tijdens de enzymmolyse van celwanden. Derhalve moeten osmotische stabilisatoren (zoals sorbitol, natriumchloride en kaliumchloride) worden opgenomen in alle buffers voor protoplastbereiding om breuk van cellen te voorkomen. Zo wordt bijvoorbeeld een sorbitoloplossing met een concentratie van 0,8-1,2 M gebruikt in de protoplastbereiding van N. crassa , Aspergillus sp. en Trichoderma sp. om de osmotische stabiliteit van de protoplasten te handhaven. Een samenvatting van de parameters voor de protoplastbereiding voor enkele veelvoorkomende schimmelsoorten wordt gegeven in tabel 2.

Opname van exogeen DNA

De oplossing die wordt gebruikt om protoplasten in suspensie te brengen, bevat gewoonlijk calciumionen en osmotische stabilisatoren. Calcium wordt verondersteld om kanalen in het cytomembraan te openen, die ingang van exogeen DNA in de cel vergemakkelijkt, terwijl de osmotische stabilisator noodzakelijk is voor het handhaven van de morfologie van de protoplasten. Gewoonlijk wordt een bepaalde hoeveelheid polyethyleenglycol (PEG) toegevoegd samen met gezuiverd DNA (dit kan zowel circulair dubbelstrengs DNA als gelineariseerd DNA zijn). PEG is een algemeen gebruikte celfusiebevorderaar. Het kan de moleculaire brug vormen tussen cellen of tussen cytomembraan en DNA, en bevordert zo de adhesie. Bovendien kan het ook ongeordende ladingen op het cytomembraanoppervlak induceren, de membraanpermeabiliteit veranderen, en de toegang van exogene nucleïnezuren tot cellen vergemakkelijken

PEG is een cruciale stof die de transformatie-efficiëntie verhoogt. Lage transformatie-efficiëntie kan in de meeste gevallen worden verbeterd door meer PEG toe te voegen. Onder normale omstandigheden is de werking van PEG met een laag molecuulgewicht (zoals PEG3000) superieur aan die van PEG met een hoog molecuulgewicht (zoals PEG8000). Dit moet echter worden geoptimaliseerd voor verschillende soorten.

De omzettingsefficiëntie wordt ook beïnvloed door de temperatuur. In het algemeen moet het DNA en protoplast mengsel worden geplaatst op ijs voor 15-30 min, zodat het DNA kan hechten aan het oppervlak van protoplasten .

Regeneratie van protoplasten

Om een goede recuperatie van levensvatbare protoplasten te garanderen, worden protoplasten toegestaan om te recupereren op de plaat zonder selectiedruk voor een bepaalde hoeveelheid voordat ze worden overgebracht naar een selectieve plaat. Een osmotische stabilisator moet in de regeneratiecultuur worden opgenomen. Stabiele osmotische druk is de sleutelfactor voor protoplasten om celwand te regenereren. Alleen de protoplasten die exogene nucleïnezuren dragen kunnen groeien op het selectieve medium.

Commentaren op de PMT methode

Protoplast transformatie methode is eenvoudig en effectief met geen behoefte aan dure apparatuur. Maar het protocol omvat vele stappen en kritische reagentia. Elke stap moet worden geoptimaliseerd en de kwaliteit van de reagentia moet kritisch worden getest. De groeistatus van schimmels die worden getransformeerd moet zorgvuldig worden gecontroleerd. Ervaring is van cruciaal belang voor de succesvolle uitvoering van deze methode.

Agrobacterium-gemedieerde transformatie (AMT)

Agrobacterium is een Gram-negatieve bacterie die algemeen wordt aangetroffen in de bodem. Agrobacterium tumefaciens kan gewonde planten infecteren. Het tumor-inducerende plasmide van > 200 kb, dat ook wel het Ti plasmide wordt genoemd, kon in het vroege stadium van de infectie worden geïsoleerd. Wanneer A. tumefaciens een plant infecteert, dringt hij de plant binnen via de wond, en integreert een deel van het Ti plasmide in het genoom van de geïnfecteerde plantencellen. Het geïntegreerde DNA-fragment van het Ti plasmide wordt doorgaans transfer-DNA of T-DNA genoemd. Het T-DNA wordt als monoklonaal willekeurig in het plantengenoom ingebracht. Het T-DNA wordt geflankeerd door twee richtingsgebonden imperfecte herhalingen (de zogenaamde linker- en rechterrand) en bevat genen die coderen voor enzymen die verantwoordelijk zijn voor de vorming van plantenhormonen, die tumorgroei veroorzaken . Een binaire vector werd zo ontworpen dat het doelgen tussen de linker- en rechterrand van het T-DNA werd ingevoegd, en het recombinante plasmide werd getransformeerd in Agrobacterium tumefaciens. De positieve Agrobacterium-kloon werd gebruikt als medium om het doelgen in het schimmelgenoom te integreren. De specifieke stappen worden hieronder in detail besproken.

De AMT-methode is stabieler en efficiënter gebleken dan conventionele transformatiemethoden sinds het eerste artikel meldde dat deze methode op schimmelentransformatie kon worden toegepast. De AMT-methode werd voor het eerst toegepast om S. cerevisiae te transformeren. Een plasmide met een hygromycine-resistentiegen wordt gewoonlijk gebruikt om Aspergillus awamori te transformeren. De AMT-methode is toegepast op veel Ascomyceten, met inbegrip van de Aspergillus , en Monascus purpureus . De basisstappen van de AMT-methode zijn weergegeven in Fig. 2. Een samenvatting van Agrobacterium-gemedieerde transformatie protocol voor verschillende schimmelsoorten wordt gegeven in tabel 3.

De basisstappen van de Agrobacterium-gemedieerde transformatie

Factoren die de AMT-efficiëntie beïnvloeden

Vele factoren zijn van invloed op de AMT-efficiëntie, waaronder het type uitgangsmateriaal van de schimmel (protoplast, spore, hypha en vruchtlichaamweefsel), de concentratie van acetosyringon, de verhouding tussen schimmel en Agrobacterium, en de conditie voor co-cultuur.

1. Het type uitgangsmateriaal van de schimmel Bij de AMT-methode kunnen de protoplasten, sporen, hyfen en vruchtlichaampjes van schimmels als recipiënt worden gebruikt. Voor verschillende stammen moeten geschikte uitgangsmaterialen worden geselecteerd. Zo werkt de AMT-methode alleen voor de protoplasten van Rhizopus. oryzae en Mucor circinelloides, terwijl sporen of kiemsporen geen transformanten zouden opleveren.

2. De concentratie van acetosyringon (AS) AS werkt in op twee stadia tijdens het AMT-proces. Het ene is het inductieproces, en het andere het transformatieproces. AS wordt over het algemeen gebruikt om de expressie van het Vir-domein van T-DNA te induceren, en het gen in het Vir-domein activeert de overdracht van T-DNA. Talrijke studies hebben aangetoond dat een passende hoeveelheid AS noodzakelijk was tijdens het transformatieproces. De toevoeging van AS is echter niet absoluut noodzakelijk tijdens de pre-cultuurfase van het Agrobacterium, waardoor de omzettingsefficiëntie voor sommige stammen zou kunnen verminderen. De concentratie van AS is een belangrijke factor die van invloed is op de transformatie-efficiëntie tijdens het schimmel-Agrobacterium co-cultuurproces in de AMT van Aspergillus awamori.

3. De verhouding tussen schimmels en Agrobacterium Binnen bepaalde grenzen zal de transformatie-efficiëntie het maximale niveau bereiken met de toename van de hoeveelheid schimmel of Agrobacterium. Een optimale verhouding voor de AMT voor verschillende schimmels moet empirisch worden bepaald. De verhouding tussen schimmel- en bacteriecellen moet voor verschillende schimmel-Agrobacterium-transformatiesystemen worden geoptimaliseerd.

4. De voorwaarde voor co-cultuur De voorwaarden voor co-cultuur zijn een belangrijke factor in de AMT-methode. Deze omvatten kweektijd, temperatuur, pH, en de keuze van het filter. De temperatuur en de tijd voor de co-cultuur zijn de sleutelfactoren bij de AMT-stappen. Bij de schimmel-Agrobacterium-transformatie is een geschikte startconditie een temperatuur van 20-28 °C en een co-cultuurtijd van 16-96 uur. Een lagere temperatuur (20-25 °C) is meestal gunstig voor de AMT-methode. Het filter, dat hydrofiel is en als drager dient voor de co-cultuur van schimmel-Agrobacterium, vergemakkelijkt het overbrengen van afzonderlijke kolonies op de screeningsplaat. Een nitrocellulose membraan, nylon membraan, filtreerpapier, cellofaan en polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan kan worden gebruikt als de filter .

Commentaren op de Agrobacterium-gemedieerde transformatie

De AMT-methode opent een nieuwe laan voor die schimmels recalcitrant voor transformatie door conventionele methoden. De AMT-methode is vooral geschikt voor het genereren van knock-in mutaties in schimmels, omdat T-DNA willekeurig in het genoom als een enkel exemplaar invoegt. Bovendien kan AMT een hoge homologe recombinatie-efficiëntie bereiken in verschillende gen-doelwitexperimenten.

De belangrijkste voordelen van de AMT-methode zijn: ten eerste, gediversifieerde ontvangers voor transformatie, met inbegrip van protoplasten, hyfen en sporen; ten tweede, de mogelijkheid om exogene genen in het genoom te integreren om stabiele transformanten te vormen; en ten derde, hoge transformatie-efficiëntie die resulteert in een groot aantal transformanten. Meerdere factoren moeten in aanmerking worden genomen bij de optimalisatie van het transformatieproces. Dit is een belangrijke beperking van de AMT-methode.

Elektroporatie transformatie

Elektroporatie is een eenvoudige, snelle en efficiënte transformatie methode voor filamenteuze schimmels. In electroporation, worden de elektrische lasten opgeslagen in een condensator om een hoog voltage te bouwen, wordt de steekproef geraakt door het impulsvoltage, en het exogene nucleic zuur kan onmiddellijk in cellen worden overgebracht. Gewoonlijk worden vierkante golven of exponentiële-afname-golven gebruikt bij de transformatie van schimmels. Exponentieel-verval pulsen worden eenvoudig gegenereerd door het laden en ontladen van een condensator. Het elektrische veld daalt exponentieel vanaf de piekwaarde. Een blokgolf is een niet-sinusoïdale periodieke golfvorm (die kan worden voorgesteld als een oneindige sommatie van sinusoïdale golven), waarin de amplitude bij een constante frequentie wisselt tussen vaste minimum- en maximumwaarden. Verschillende golfvormen van elektroporatie worden gebruikt voor verschillende soorten. Een overzicht van de bij elektroporatie voor verschillende soorten gebruikte golfvormen wordt gegeven in tabel 4.

Wanneer een cel wordt blootgesteld aan het elektrische veld, zal de structuur van het cytomembraan worden veranderd door een spanning die tussen het cytomembraan wordt geïnduceerd. Na de elektrische schok kunnen microporiën in het cytomembraan worden gevormd. De geïnduceerde celwandpermeabiliteit is omkeerbaar binnen de drempels van het voltage en de duur, anders zal het onomkeerbare schade aan de cellen veroorzaken. Daarom blijken de microporiën in het cytomembraan twee patronen te vertonen na elektrische schok, het omkeerbare en het onomkeerbare patroon. De lipide- en proteïnemoleculen in het cytomembraan kunnen de oorspronkelijke structuur herstellen wanneer een geschikte veldintensiteit wordt toegepast, terwijl de irreversibele elektrische schok aanleiding zal geven tot onherstelbaarheid of uiterst traag herstel, wat uiteindelijk tot celdood leidt . Exogeen DNA kan door middel van elektroporatie worden overgebracht in bacteriën, plantenprotoplasten, dierlijke cellen en draadvormige schimmels. Deze methode is met succes toegepast op meerdere schimmels. Ozeki et al. ontdekten dat kiemsporen meer vatbaar zijn voor transformatie door elektroporatie. In de afgelopen jaren is elektroporatie een betrouwbare methode geworden voor gentransformatie van enkele veelvoorkomende stammen. Een samenvatting van elektroporatie-gemedieerde transformatieprotocollen voor verschillende schimmelsoorten wordt gegeven in tabel 5.

Factoren die van invloed zijn op elektroporatietransformatie

Elektroporatieparameters

1. Elektrische veldintensiteit Elektrische veldintensiteit is de belangrijkste factor die van invloed is op de elektroporatie-efficiëntie. Wanneer de intensiteit van het toegepaste elektrische veld de grootte van kV/cm en de pulsbreedte van μs-ms bereikt, zal het cytomembraan worden veranderd en zullen veel microporiën op de celwanden worden gegenereerd. Een hoge elektrische veldsterkte wordt geassocieerd met een hoge opnamesnelheid van exogene nucleïnezuren en een lagere overlevingskans van de cel. Verschillende soorten cellen vereisen echter verschillende elektrische veld intensiteiten als gevolg van verschillen in cytomembraan componenten. Er worden weinig microporiën gevormd wanneer de elektrische veldsterkte de vereiste drempel niet overschrijdt. Integendeel, een te hoge elektrische veldintensiteit zal resulteren in onomkeerbare schade aan het cytomembraan, wat leidt tot celdood.

2. Capaciteit Tijdens het elektroporatieproces zijn de variatie in elektrische ladingen en de elektrische veldintensiteit die op de celsuspensie wordt toegepast, afhankelijk van de capaciteit en de pulsduur. De intensiteit en de duur van de puls worden ook beïnvloed door de capaciteit, daarom heeft een grotere capaciteit betere omzettingseffecten.

3. Pulsduur en frequentie De duur van de perforatie in het cytomembraan, die rechtstreeks verband houdt met de omzettingsefficiëntie van de elektroporatie, wordt beïnvloed door de pulsduur en de frequentie.

Elektroporatie-omgeving en externe factoren

1. Bufferoplossing De bufferoplossing biedt een belangrijke omgeving voor elektroporatie van cellen, en de pH-waarde van de elektroshockbufferoplossing is van groot belang. Normaliter wordt een buffer van pH 7,0 gebruikt. Cellen worden gemakkelijk doorgeprikt en gedood bij een pH hoger dan 7,0 .

2. Temperatuur Tijdens het elektroporatieproces wordt een grote hoeveelheid warmte geproduceerd, die in de bufferoplossing vrijkomt. Daarom wordt een lagere temperatuur (0-4 °C) aanbevolen voor een beter effect. Bovendien kan het ijsbaden van het mengsel vóór de elektroshock ook de efficiëntie van de elektroshock verbeteren.

3. Concentratie van exogeen nucleïnezuur In het algemeen neemt de efficiëntie van de elektroporatie toe met de concentratie van exogeen nucleïnezuur. Compact superhelix-DNA komt gemakkelijker de cellen binnen via het cytomembraan. In 1995 meldde een studie dat elke 1 μg plasmide-DNA 100 transformanten kon genereren voor A. niger .

Opmerkingen over de elektroporationmethode

De elektroporationmethode is uitgebreid toegepast op talrijke celtypes, waaronder prokaryoten en eukaryoten. Deze technologie heeft het potentieel om de methode bij uitstek te worden voor de transformatie van onontgonnen schimmelsoorten. In vergelijking met de PMT-methode, waarbij ingewikkelde stappen moeten worden doorlopen, is elektroporatie eenvoudig en gemakkelijker. Het mechanisme van elektroporatie is echter nog steeds onduidelijk. De perforatiesnelheid van het cytomembraan is afhankelijk van vele parameters van het elektrische veld. Bovendien vereist het geschikte buffercondities om optimaal effectief te zijn.

Biolistische transformatie

Biolistische transformatie is ook bekend als deeltjesbombardement. Het principe is dat vreemd DNA wordt geadsorbeerd aan het oppervlak van wolfraam- of gouddeeltjes. Onder invloed van hoge druk worden de deeltjes in gastheercellen geïnjecteerd. Deeltjesbombardement kan zowel stabiele als voorbijgaande transformatie realiseren.

Verschillende factoren beïnvloeden de efficiëntie van bombardement in patronen van complexe interacties . Biologische parameters (celtype, groei conditie, en celdichtheid) en instrumentele instellingen (deeltjes type en grootte, vacuüm en druk niveau, doel afstand) zijn belangrijke variabelen.

Particle bombardment is de meest krachtige onder alle genetische transformatie methoden. Het is niet onderworpen aan de beperkingen van celtypes van gastheer of soorten. Voor schimmels is deeltjesbombardement voldoende efficiënt voor die organismen die moeilijk te kweken zijn of waarvan protoplasten moeilijk te bereiden zijn. Deeltjesbombardement is gemakkelijk en handig in het gebruik. De instrumenten en verbruiksgoederen voor deeltjesbombardement zijn echter duur. Deze methode wordt alleen in overweging genomen wanneer andere methoden niet werken. Momenteel is deeltjesbombardement gebruikt om met succes A. nidulans en T. reesei te transformeren, enz.

Shock-wave-mediated transformation (SWMT)

SWMT maakt gebruik van het principe van energietransformatie en -overdracht om voorbijgaande drukstoring en verdraaiingskracht over cellen te genereren om voorbijgaande cavitatie-effecten te vormen. Deze methode is toegepast bij medische behandelingen zoals orthopedie en het vergruizen van nierstenen. SWMT verandert de permeabiliteit van celmembranen door akoestische cavitatie, wat leidt tot de opname van exogeen nucleïnezuur in cellen. De methode is met succes toegepast bij de introductie van exogeen nucleïnezuur in Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa en Salmonella typhimurium . In 2013 rapporteerden Denis Magaña-Ortíz et al. voor het eerst de toepassing van SWMT voor schimmels, waaronder A. niger, Fusarium oxysporum, en Phanerochaete chrysosporium . In dit artikel werden drie voordelen van de SWMT-methode opgemerkt. Ten eerste is deze methode, vergeleken met conventionele transformatiemethoden, in staat om direct in te werken op sporen maar niet op protoplasten. Ten tweede waren de fysische parameters gemakkelijk te controleren; alleen het aantal sporen, de energie en de snelheid van de schokgolf moesten nauwkeurig worden gecontroleerd. Ten derde was de omzettingsefficiëntie uitstekend. Resultaten van Denis Magaña-Ortíz et al. gaven aan dat, vergeleken met de Agrobacterium transformatiemethode, de SWMT-methode de transformatie-efficiëntie met een factor 5400 kon verbeteren voor A. niger .

Maar er waren ook enkele beperkingen in deze transformatiemethode merkbaar. Aangezien een groot deel van het DNA beschadigd wordt bij de schokgolfbehandeling, was de transformatie-efficiëntie, bepaald door de verhouding DNA-cellen, vrij laag. Voor het aantal betrokken cellen was de transformatie-efficiëntie echter aanzienlijk hoger. Bij de evaluatie van de efficiëntie moet men twee aspecten in aanmerking nemen: de hoeveelheid DNA en het aantal cellen. Bijvoorbeeld, in het experiment uitgevoerd door Magana-Ortiz et al. , in het algemeen, plasmide DNA gebruikt in protoplast transformatie en elektroporatie is ongeveer 1-10 ug . Het is duur en onpraktisch om een dergelijke grote hoeveelheid plasmide in het laboratorium te produceren voor de SWMT-methode. Bovendien zijn de schokgolfbronnen en -instrumenten duur omdat zij in de eerste plaats voor medische doeleinden zijn ontworpen. Dit blijkt een grote belemmering te zijn om deze methode toe te passen in een microbiologisch laboratorium met beperkte middelen.