Results and Discussion
Onze nieuwe AMHS methode wordt vergemakkelijkt door de anatomische/functionele structuur van de bijen bloedsomloop systeem. Circulatie wordt geforceerd door pulserende contractie van de dorsale en ventrale diafragma’s, die hemolymfe pompen in het hart. Vervolgens de aorta transporteert hemolymfe in het hoofd (Fig 1F), het leveren van hemolymfe aan de hersenen van de bij en antennes.
Vergeleken met de TCHS, AMHS maakte de verzameling van 80-100 pi steriele hemolymfe binnen een kortere tijd en van een kleiner aantal individuen, die het minimaliseren van het risico van melanisatie. Wij zijn van mening dat tijdens hemolymfe collectie, is het belangrijk om de tijd van het contact met lucht te minimaliseren. Het risico op melanisatie wordt verminderd door een kortere verzameltijd en een snellere overgang naar de koelstap. Naast de kortere verzameltijd is ook het geringere gebruik van insecten een belangrijk voordeel van het AMHS ten opzichte van TCHS. Het onderzoek aan apidae moet altijd zo worden opgezet dat zo min mogelijk bijen worden geschaad. Het gebruik van AMHS om het aantal bijen dat nodig is om een vereist hemolymfevolume te verzamelen, te verminderen, is in overeenstemming met de leidende beginselen voor een ethischer gebruik van dieren in onderzoek.
Uw huidige resultaten toonden ook aan dat een grotere insectengrootte geassocieerd was met gemakkelijkere en snellere hemolymfebemonstering, en met grotere volumes verzamelde hemolymfe (tabel 1). Hemolymfebemonstering van Apis mellifera carnica en Apis cerana werksters duurde langer en vereiste meer insecten dan hemolymfebemonstering van hommels, aangezien de eerstgenoemde soorten aanzienlijk kleiner zijn en minder hemolymfe hebben.
Hemolymfe wordt meestal verkregen met capillairen via verschillende methoden, bijvoorbeeld door het hart, de dorsale of ventrale sinus van de thorax, of de dorsale aorta te doorprikken. Bij elk van deze procedures bestaat het risico dat de ventriculus wordt doorgeprikt, hetgeen leidt tot verontreiniging van het monster met de darminhoud. Een dergelijke verontreiniging maakt niet alleen het monster onbruikbaar, maar vereist ook dat het capillair moet worden vervangen door een nieuwe of gereinigd en gedesinfecteerd vóór het volgende gebruik, waardoor de totale hemolymfe collectie tijd. De steriliteit van de hemolymfe kan ook in het gedrang komen door het doorprikken van het membraan dat de abdomen segmenten verbindt. Gebruik van het AMHS elimineert deze capillair-gerelateerde problemen. Bovendien kan bij hemolymfecollectie door onthoofding het hemolymfe besmet raken met nectar die uit de maag van de bij lekt. Ons nieuwe AMHS resulteerde in hemolymfemonsters van hoge biologische kwaliteit. Hemocyten waren duidelijk zichtbaar in elk hemolymfe monster verkregen door AMHS (Fig 1C). Analyse van elk microscoopglaasje toonde aan dat de met AMHS verkregen hemolymfemonsters zuiver en transparant waren, zonder verontreiniging (bijv. stuifmeelkorrels).
We verwachtten dat bij de uitvoering van AMHS de ontsmetting met ethanol en het beperkte contact tussen de hemolymfdruppel en het bijenlichaam de steriliteit van het monster zou waarborgen. Deze verwachting werd bevestigd door microbiologische tests. De incubatie van hemolymfe verkregen door AMHS op zowel MRS als Sabouraud agar mediums bevestigde de hemolymfe steriliteit. Op geen van de 100 uitgeplaatste hemolymfedruppels werd groei van micro-organismen waargenomen. Daarom worden hier geen kwantitatieve resultaten gepresenteerd. Na beëindiging van de incubatieperiode zagen we alleen donkerbruine cirkels van gemelaniseerde hemolymfe rond elke druppel. Deze melanisatie trad op tijdens de incubatieperiode, niet tijdens de bemonstering (Fig 1D en 1E). Met name wanneer de verzamelde hemolymfe niet wordt gebruikt voor microbiologische tests, kan de desinfectiestap worden weggelaten. Het is mogelijk dat ethanol aangebracht op het antennale gebied de enzym- of hormoonactiviteiten kan beïnvloeden.
Factoren anders dan methodologie kunnen de efficiëntie van de hemolymfe collectie beïnvloeden. In onze eerdere studies , hebben we waargenomen dat de hoeveelheid hemolymfe verzameld van een bij hangt niet alleen af van de bij kaste en leeftijd, maar ook van de mate van hydratatie gemeten op basis van het volume van nectar of suikersiroop verbruikt voorafgaand aan hemolymfe bemonstering. Ptaszyńska et al. melden dat de bemonstering van het juiste hemolymfevolume minder doeltreffend is bij oudere bijen. Bovendien kan de efficiëntie van de bemonstering afhangen van de laboratoriumvaardigheden van de onderzoeker. Deze factoren maken het moeilijk om de kwantitatieve kenmerken van verschillende hemolymfe-bemonsteringsprotocollen te vergelijken tussen studies die in verschillende laboratoria zijn uitgevoerd en waarbij verschillende organismen zijn gebruikt. In onze vorige onderzoeken hebben wij hemolymfe van duizenden bijen bemonsterd met behulp van AMHS, maar ook met andere methoden, waaronder TCHS. Ons laboratoriumpersoneel heeft veel ervaring met het verzamelen van hemolymfe van bijen van verschillende leeftijden en kasten. Deze ervaring heeft ons geholpen om de verschillende bemonsteringsmethoden te vergelijken, aangezien onze bevindingen niet werden beïnvloed door fouten als gevolg van variabele vaardigheden van het laboratoriumpersoneel. Uit onze huidige resultaten bleek dat het AMHS een efficiënte, schone en zeer nauwkeurige methode was (tabel 1) die minder tijd in beslag nam dan TCHS.
Hemolymfebemonstering met behulp van andere methoden dan het AMHS vereist meestal extra apparatuur, zoals micro-capillaire buisjes. Bovendien vereist het verwijderen van hemolymfe uit micro-capillaire buisjes ofwel het gebruik van een speciale pomp, ofwel het pletten van de buisjes en centrifugeren met behulp van korrels. Een ander voordeel van het AMHS is de mogelijkheid om met behulp van een pipetschaal het hemolymfevolume te meten dat van een enkele bij is verzameld. Dit is bijzonder nuttig bij het uitvoeren van biochemische analyses van micromonsters, bijvoorbeeld voor het bepalen van enzymactiviteiten. Opgemerkt zij dat bij toepassing van andere methoden dan AMHS het volume zuivere hemolymfe indirect kan worden berekend, op basis van het volume hemolymfe verdunner in een buisje vóór de bemonstering en het gemeten volume hemolymfe verdunner na de bemonstering. Een dergelijke methode kan echter tot extra fouten leiden; daarom gebruiken sommige onderzoekers Hamilton-injectiespuiten. Het AMHS vermijdt de kosten en het extra werk (b.v. spuitontstopping, ontsmetting, enz.) van het gebruik van Hamilton-spuiten.
De methode van Mayack en Naug (hemolymfe wordt verkregen door bijen met afgeknipte voelsprieten te spinnen) is vergelijkbaar met het AMHS. Hun methode vereist echter een laboratoriumcentrifuge, en de monddelen van de bijen moesten worden dichtgelijmd om elke mogelijke besmetting te voorkomen. Bovendien ontleedden zij in hun studie de ingewanden van de bijen om de Nosema ceranae-infectie te beoordelen alvorens de bijen te centrifugeren. Zonder deze stap zouden de ingewanden een waarschijnlijke bron van besmetting zijn. Hun methode hield in dat de bijen in centrifugebuizen werden geplaatst en gedurende 30 seconden bij 16.000 RCF werden gecentrifugeerd om hemolymfe te verkrijgen. Dit proces kan leiden tot gelaagdheid van de hemolymfebestanddelen (bv. eiwitten en hemocyten) en houdt een verhoogd risico in op microbiologische verontreiniging en melanisatie van de hemolymfe (zie bespreking hierboven). Hoewel het ideaal kan zijn voor het analyseren van hemolymfe suiker niveaus bij de honingbijen foeragers met eerder verwijderde ingewanden (zoals in hun studie), is het niet geheel geschikt voor microbiologische en genetische studies of onderzoeken van enzymactiviteiten. In deze context is onze nieuwe AMHS-methode meer geschikt voor algemeen gebruik, omdat ze gemakkelijk en eenvoudig is, en waarschijnlijk kan worden toegepast in een breed scala van verschillende soorten studies.