Abstract

Achtergronden. Vroegtijdige opsporing van Gram-positieve bacteriëmie en tijdige passende antimicrobiële therapie zijn nodig om de mortaliteit van patiënten te verlagen. Het doel van onze studie was het evalueren van de prestaties van de Verigene Gram-positieve bloedkweektest (BC-GP) in twee speciale gezondheidszorgomgevingen en het bepalen van de potentiële impact van snelle bloedkweektests voor Gram-positieve bacteriëmie binnen het Japanse gezondheidszorgsysteem. Bovendien omvatte de studie gesimuleerde bloedkweken, waaronder een bibliotheek van goed gekarakteriseerde methicillineresistente Staphylococcus aureus (MRSA) en vancomycineresistente enterokokken (VRE) isolaten die verschillende geografische regio’s in Japan weerspiegelen. Methoden. In totaal werden 347 BC-GP assays uitgevoerd op klinische en gesimuleerde bloedkweken. BC-GP resultaten werden vergeleken met resultaten verkregen met referentiemethoden voor genus/soort identificatie en detectie van resistentiegenen met behulp van moleculaire en MALDI-TOF MS methodologieën. Resultaten. Voor identificatie en detectie van resistentiegenen op twee klinische locaties en gesimuleerde bloedkweken was de algemene concordantie van BC-GP met referentiemethoden 327/347 (94%). De tijd voor identificatie en detectie van antimicrobiële resistentie door BC-GP was aanzienlijk korter in vergelijking met routinetesten, vooral in het cardiologisch ziekenhuis, dat geen klinische microbiologiediensten aanbiedt in het weekend en op feestdagen. Conclusie. BC-GP genereerde nauwkeurige identificatie en detectie van resistentiemarkers in vergelijking met routinemethoden voor Gram-positieve organismen in gespecialiseerde klinische settings en leverde snellere resultaten op dan de huidige routinetests.

1. Inleiding

Gram-positieve bacteriën zijn de meest voorkomende micro-organismen geassocieerd met sepsis in gezondheidszorgomgevingen en de meest voorkomende oorzaak van bacteriëmie bij patiënten met hematopoëtische stamceltransplantatie. Enterokokkenbacterie wordt geassocieerd met een verhoogd risico op sterfte bij patiënten met een hematopoëtische stamceltransplantatie, ongeacht de gevoeligheid voor vancomycine. Op cardiologische afdelingen zijn infectieuze endocarditis, infectieus aneurysma, katheter-gerelateerde bloedbaaninfecties of operatieplaatsinfecties na hartoperaties de belangrijkste infecties waarvan de meest voorkomende oorzakelijke micro-organismen Gram-positieve cocci zijn. Op beide medische afdelingen is vroegtijdige opsporing van Gram-positieven en resistente markers zeer kritisch voor het beheer van de patiëntenzorg, antibioticastewardship, en het voorkomen van verspreiding van resistente micro-organismen.

Aangezien vroeg ingrijpen met antimicrobiële therapie wordt geassocieerd met een betere prognose, waarbij elk uur vertraging wordt geassocieerd met een verhoogde mortaliteit, is een snelle diagnose van cruciaal belang . De Verigene Gram-positieve bloedkweek assay (BC-GP) (Nanosphere, Inc., Northbrook, IL) is een sample to result microarray systeem voor identificatie van veel voorkomende Gram-positieve bacteriën en belangrijke resistentie markers direct uit positieve bloedkweek. Hoewel een aantal studies eerder BC-GP rapportage prestaties hebben geëvalueerd variërend van 92 tot 99% overeenstemming met conventionele methodologie , een beperking van eerdere rapporten is dat veel van de studies zijn uit de Verenigde Staten en landen buiten Japan met slechts een gepubliceerd rapport van beperkte omvang in Japan.

Genetische variatie tussen bacteriële lineages circulerend in verschillende geografische regio’s van de wereld kan de gevoeligheid van moleculaire assays gebaseerd op oligonucleotide probes voor het detecteren van organismen of resistentie markers beïnvloeden. Studies in Hong Kong en België hebben lagere BC-GP prestaties gerapporteerd.

Het doel van deze studie was het bepalen van de potentiële impact op het patiëntenbeheer en het resultaat van BC-GP in gespecialiseerde gehospitaliseerde settings binnen de Japanse gezondheidszorgomgeving, die voor een aantal uitdagingen staat. Een steeds ouder wordende bevolking en de daarmee gepaard gaande stijgende totale kosten van de gezondheidszorg hebben de infrastructuur van de gezondheidszorg op de proef gesteld. Ondanks het feit dat meticilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) verantwoordelijk is voor meer dan 90% van de ziekenhuisinfecties veroorzaakt door resistente bacteriën in Japan, is het uitbesteden van klinische microbiologie testen of geen weekenddekking gebruikelijk in veel zorginstellingen als onderdeel van kostenbeperking. Dit artikel is de eerste uitgebreide evaluatie van BC-GP in Japan om de klinische prestaties te valideren. De gesimuleerde bloedkweekstudie omvat een bibliotheek van goed gekarakteriseerde gezondheidszorg-geassocieerde MRSA (HA-MRSA), gemeenschap-verworven MRSA (CA-MRSA), en vancomycineresistente enterokokken (VRE) stammen die in Japan circuleren.

2. Methoden

BC-GP werd geëvalueerd in Toranomon Hospital (TH) en Sakakibara Heart Institute (SHI), in overeenstemming met site-specifieke institutionele beoordelingsraad goedgekeurde studieprotocollen, gedurende 26 juni 2012 tot 6 maart 2013. Het TH is een algemeen opleidingsziekenhuis met 1168 bedden en een 123 bedden tellende hematologische zorgafdeling voor hematopoëtische stamceltransplantatie, waar 140 tot 160 hematopoëtische stamceltransplantaties per jaar worden uitgevoerd. Het microbiologisch laboratorium van het ziekenhuis is dagelijks overdag in bedrijf. SHI is een opleidingsziekenhuis met 320 bedden dat gespecialiseerd is in hart- en vaatziekten en jaarlijks meer dan 1.500 openhartoperaties uitvoert. Het microbiologisch laboratorium in het ziekenhuis wordt beheerd door een extern commercieel referentielaboratorium. Het microbiologisch laboratorium werkt tijdens de dagdienst op weekdagen en is gesloten tijdens het weekend en op feestdagen.

Bloedkweken werden bij SHI uitgevoerd met behulp van BacT/ALERT FA flessen en controle met BacT/ALERT 3D (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankrijk). TH gebruikte BACTEC Plus-flesjes en controle met BACTEC 9240 en FX (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Per patiënt werd slechts één positief bloedkweekflesje met Gram-positieve cocci of bacillen in het onderzoek opgenomen. Twee ml positief bloedkweekmedium werd bewaard bij -85C voor hertesten.

Routinematige microbiologische identificatie en gevoeligheidstests van isolaten werden uitgevoerd met behulp van conventionele identificatietests zoals galoplosbaarheid, gevoeligheid voor optochin-schijven, en het MicroScan WalkAway-systeem (Beckman Coulter, Pasadena, CA) bij TH en het Vitek 2-systeem (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Frankrijk) bij SHI. Cefoxitinescreening op methicillineresistentie werd uitgevoerd volgens de CLSI-richtsnoeren. Een latexagglutinatietest voor de detectie van penicillinebindend eiwit PBP2a werd ook gebruikt.

BC-GP-tests werden uitgevoerd op positieve bloedkweken met Gram-positieve organismen volgens de instructies van de fabrikant. Kort gezegd werd een goed gemengd monster van 350 μl van de bloedkweekmedia in de monsterput van de BC-GP nucleïne-extractietray gepipetteerd, op de Verigene Processor SP geplaatst voor verwerking en analyse door de Verigene Reader.

Een beoordeling werd uitgevoerd om het verschil in tijd te bepalen tussen de rapportering van resultaten met behulp van BC-GP en op kweek gebaseerde identificatie en antimicrobiële-gevoeligheidsresultaten voor 139 positieve bloedkweekbouillons. Voor op kweek gebaseerde resultaten was de tijd die nodig was tot het genereren van het eindrapport de tijd tussen het aflezen van de Gram-kleuring en het invoeren van de definitieve identificatie- en gevoeligheidresultaten in het laboratoriuminformatiesysteem. Voor BC-GP was de tijd tot het resultaat de tijd tussen het aflezen van de Gram-kleuring en het invoeren van de BC-GP-resultaten in het laboratoriuminformatiesysteem.

Een challenge set van 208 gesimuleerde bloedkweken werd samengesteld met behulp van type-, referentiestammen en klinische stammen uit verschillende geografische regio’s in Japan om BC-GP te evalueren. De klinische stammen omvatten organismen die in eerdere klinische studies bij TH en SHI problemen opleverden voor commerciële identificatiesystemen. Bovendien werd ook een bibliotheek van goed gekarakteriseerde HA-MRSA-, CA-MRSA- en VRE-stammen uit Japan getest. Gesimuleerde bloedkweekstudies werden uitgevoerd in het Miroku Medical Laboratory (Saku City, Nagano Prefecture, Japan). Tweehonderdacht stammen werden aangepast tot een troebelheid van ongeveer 100 CFU/ml in steriele zoutoplossing. Driehonderd μl werd geënt in BACTEC Plus Aerobic/F-flessen met 8-10 ml menselijk volbloed (bloedgroep O, Tennessee Blood Services, Memphis, TN) voor een uiteindelijk inoculum van 30 CFU/fles. Een BACTEC Plus Anaerobic/F-flesje werd ook geënt voor S. pneumoniae en de S. anginosus-groep. Elke fles werd geïncubeerd in het BACTEC-systeem tot een positief signaal werd gegenereerd. Indien BC-GP negatieve resultaten opleverde, werd een 11-voudige verdunning van het bloedkweekmedium met steriel gedestilleerd water opnieuw getest.

Elk van de positieve bloedkweekisolaten op de twee ziekenhuislocaties werd bewaard in 10% magere melk (Difco) bij -85C. Identificatie van de soorten werd bevestigd met behulp van matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) (Microflex LT met Biotyper ver. 3.0 software; Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Duitsland) voor alle stammen. Als het organisme niet tot op soortniveau werd geïdentificeerd door MALDI-TOF MS (scorewaarde < 2,0) of werd geïdentificeerd als Micrococcus, Listeria, Staphylococcus andere dan S. aureus, Streptococcus andere dan S. pyogenes, en S. agalactiae, werden bevestigingstests door PCR-directe sequenering van 16S rDNA of sodA uitgevoerd aan de Juntendo Universiteit of de Tokyo Women’s Medical University . Specifieke PCR voor het opsporen van mecA in alle stafylokokken en vanA, vanB in alle enterokokken werd uitgevoerd. De methoden gebruikt voor SCCmec typering van community-verworven of gezondheidszorg-geassocieerde MRSA gebruikt om stammen te karakteriseren zijn eerder beschreven .

Overeenstemming werd bepaald in vergelijking met de resultaten van de referentiemethoden. Er was overeenstemming indien de detectie van het BC-GP-doel overeenkwam met die van de referentiemethode, hetzij op het niveau van het geslacht, hetzij op het niveau van de soort. De vijfennegentig procent betrouwbaarheidsintervallen (95% CI) en de gepaarde -test werden bepaald met GraphPad StatMate (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

3. Resultaten

In deze studie was de algehele identificatieovereenstemming tussen BC-GP en de referentiemethode 327/347 (94%) voor prospectieve bloedkweken op twee klinische locaties en gesimuleerde bloedkweken. De gecombineerde overeenkomst tussen PCR en BC-GP voor mecA-detectie was 71/73 (97%) voor prospectieve bloedkweken en gesimuleerde bloedkweken.

De gecombineerde identificatienauwkeurigheid van beide ziekenhuislocaties was 129/139 (93%). Voor monomicrobiële kweken was de identificatienauwkeurigheid 121/124 (98%). De overeenkomst tussen PCR en BC-GP voor mecA-positiviteit was 51/53 (96%). Tabel 1 toont de resultaten van TH. In totaal werden 96/104 (92%) organismen door BC-GP correct geïdentificeerd tot op soort- of genusniveau, inclusief detectie van resistentiegenen. Zoals blijkt uit tabel 2, was de totale overeenkomst van BC-GP met de referentiemethode bij SHI 33/35 (94%) organismen.

BC-GP rapporteert de aanwezigheid van mecA alleen voor S. aureus en S. epidermidis. In deze studie waren 72 van de 102 stafylokokkenstammen S. aureus of S. epidermidis. Discordante resultaten waren te wijten aan niet-detecteerbare mecA S. epidermidis-organismen in polymicrobiële kweken die zowel mecA-positieve als mecA-negatieve S. epidermidis bevatten. Van de 30 Staphylococcus spp., anders dan S. epidermidis en S. aureus, waren 21 (70%) positief voor mecA, waaronder 2 S. lugdunensis, die door BC-GP niet als mecA-positief konden worden gerapporteerd.

Tabel 3 toont het verschil in tijd tussen het genereren van BC-GP-resultaten en op kweek gebaseerde definitieve identificatie en antimicrobiële gevoeligheidresultaten in beide ziekenhuizen. BC-GP-resultaten waren gemiddeld 28,2 tot 51,0 uur vóór de op kweek gebaseerde definitieve identificatie- en gevoeligheidsresultaten in TH beschikbaar. Bij SHI genereerde BC-GP gemiddeld 34,5 tot 196,6 uur eerder resultaten. Bij vergelijking van de tijd tot definitieve op kweek gebaseerde identificatie- en vatbaarheidsresultaten bij TH en SHI, hadden, met uitzondering van S. aureus, resultaten voor S. epidermidis en coagulase-negatieve stafylokokken anders dan S. epidermidis, enterokokken, en streptokokken aanzienlijk () meer tijd nodig bij SHI (83,3, 123,6, 159,1, en 199,1 uur, resp.) in vergelijking met TH (40,8, 53,9, 36,1, en 53,5 uur, resp.).

Gebruik makend van gesimuleerde Gram-positieve bloedkweken, identificeerde BC-GP 198/208 (95%) van de organismen correct (Tabel 4). Zes streptokokken (3%) werden ofwel onjuist geïdentificeerd of alleen door BC-GP op genusniveau geïdentificeerd. Met betrekking tot de 4 BC-GP vals-negatieve bloedkweekflessen werd 1 S. pyogenes correct geïdentificeerd en 1 S. mitis genereerde een positief Streptococcus genus/S. pneumoniae signaal na 11-voudige verdunning van het bloedkweekmedium. Het mecA-gen werd door BC-GP gedetecteerd in 20/20 (100%) MRSA-organismen die door de gemeenschap verworven (SCCmec type IIa, IV, en V) en door de gezondheidszorg geassocieerde (SCCmec type I, IIb, III, en niet-typeerbare) stammen vertegenwoordigen. BC-GP detecteerde 14/14 (100%) vanA- en 20/20 (100%) vanB-genen in goed gekarakteriseerde VRE-stammen uit eerdere studies in Japan.

4. Discussie

De prestaties van BC-GP waargenomen in onze studie was vergelijkbaar met eerdere rapporten . Aangezien klinische microbiologische diensten zijn uitbesteed of niet actief tijdens off-shifts tijdens weekdagen en gesloten in het weekend en op feestdagen in veel ziekenhuizen in Japan, snelle diagnostische testen heeft een aanzienlijk potentieel om de patiëntenzorg beïnvloeden door drastisch verminderen van de tijd tot organisme identificatie en antimicrobiële gevoeligheid resultaten.

BC-GP detecteert mecA in alle stafylokokken op basis van meting van de signaalintensiteit; de rapportage is echter beperkt tot S. aureus en S. epidermidis op basis van een algoritme waarin mecA alleen wordt gerapporteerd wanneer S. aureus of S. epidermidis door BC-GP wordt gedetecteerd. Toekomstige versies van BC-GP moeten een wijziging van het algoritme overwegen om de melding van mecA-detectie voor andere stafylokokken dan S. aureus of S. epidermidis mogelijk te maken, aangezien 70% van de 30 niet-S. aureus- en S. epidermidis-stammen in onze studie methicillineresistent waren. Hoewel S. epidermidis de belangrijkste coagulase-negatieve stafylokokkenpathogeen is, zijn andere stafylokokken zoals S. lugdunensis en S. haemolyticus belangrijke pathogenen in de gezondheidszorg.

Polymicrobieel positieve bloedkweken veroorzaakten het merendeel van de discordantie. Daarentegen was de prestatie van BC-GP 121/124 (98%) bij monomicrobiële klinische bloedkweken en 198/208 (95%) bij gesimuleerde bloedkweken. In deze studie vertegenwoordigden polymicrobiële bloedkweken respectievelijk 14/106 (13%) en 3/33 (9%) van de positieve bloedkweken bij TH en SH. Gecombineerd vertegenwoordigden polymicrobiële kweken 17/139 (12%) van de prospectieve klinische bloedkweken, wat consistent is met eerdere studies die meldden dat 6 tot 20% van alle bloedbaaninfecties polymicrobieel was. BC-GP identificeerde alle organismen in 12/17 (70%) van de polymicrobiële kweken correct. In eerdere BC-GP-studies varieerden de percentages correcte identificaties in polymicrobiële kweken van 57 tot 86%. Aangezien misleidende informatie de klinische diagnose kan beïnvloeden, resulterend in ongepaste selectie van antimicrobiële middelen, is het nodig om de beperkingen van BC-GP te begrijpen.

Een bijkomend punt van zorg bij polymicrobiële kweken is de klinische interpretatie van mecA-detectie en staphylococcendetectie. In onze 17-polymicrobiële kweken leverden 5 monsters 2 of 3 stafylokokkenstammen op met of zonder mecA. Dit kan leiden tot onnodig gebruik van vancomycine of onderschatting van de infectie veroorzaakt door meticillineresistente stafylokokken. Herhaling van BC-GP op een andere reeks bloedkweken kan het risico op dit probleem verkleinen. Voor monomicrobiële kweken of gesimuleerde kweken werden alle discrepanties waargenomen bij streptokokken, behalve voor 1 S. caprae-stam. BC-GP foute identificatie voor streptokokken omvatte 2 S. mitis geïdentificeerd als S. pneumoniae, geen detectie van 2 S. pneumoniae, 2 S. anginosus groep, en 2 S. pyogenes. Eerdere rapporten hebben ook soortgelijke resultaten gemeld voor S. mitis, S. oralis, en S. pneumoniae . Aangezien genetische verwantschap tussen S. mitis, S. oralis, en S. pneumoniae goed bekend is op basis van >99% homologie van 16S rRNA-gensequenties , moeten BC-GP-resultaten voor S. pneumoniae of Streptococcus met alfa-hemolyse zonder enige positieve soortspecifieke signalen zorgvuldig worden geïnterpreteerd en bevestigd met conventionele methoden zoals optochinegevoeligheid of de galoplosbaarheidstest. Interessant is dat een 11-voudige verdunning van het oorspronkelijke bloedkweekmedium kan leiden tot detectie van het Streptococcus-signaal en het species-signaal (tabel 4). Er is een detectiebereik, afhankelijk van het organisme, door BC-GP gerapporteerd.

Het grote voordeel van het gebruik van BC-GP is dat identificatie en resistentiebepalende factoren van positieve bloedkweken eerder kunnen worden gerapporteerd, zodat eerder een passende antimicrobiële therapie kan worden gekozen en maatregelen voor infectiebeheersing, zoals isolatie en voorzorgsmaatregelen bij contacten, kunnen worden genomen. Dit kan een aanzienlijk effect hebben op het Japanse gezondheidszorgsysteem. Het verschil in tijd tussen de BC-GP-resultaten en de uiteindelijke op kweek gebaseerde identificatie- en gevoeligheidresultaten, zoals weergegeven in tabel 3 bij TH, is in overeenstemming met eerdere verslagen . Aan de andere kant weerspiegelen de eerdere resultaten van 80,7 tot 196,6 uur voor andere organismen dan S. aureus met behulp van BC-GP bij SHI de onbeschikbaarheid van klinische microbiologiediensten tijdens weekenden en vakanties. Aangezien klinische microbiologiediensten in veel ziekenhuizen in Japan worden uitbesteed of beperkt zijn tot één ploeg tijdens weekdagen of niet worden aangeboden tijdens het weekend, zijn de potentiële kosten-baten van het behouden van bloedkweekdiensten in ziekenhuizen aanzienlijk. Bovendien zal de opleiding van laboratoriumpersoneel in het algemene laboratorium om Gram-positieve cocci en bacillen te herkennen het mogelijk maken BC-GP-tests zowel in het weekend als ’s avonds en ’s nachts uit te voeren. BC-GP biedt ziekenhuizen de mogelijkheid om een zeer kritische laboratoriumdienst in huis te houden.

In conclusie, BC-GP zorgde voor nauwkeurige identificatie en detectie van resistentiemarkers in vergelijking met routinematige op kweek gebaseerde laboratoriummethoden voor Gram-positieve organismen waaronder CA-MRSA, HA-MRSA, en VRE-stammen die in Japan circuleren. Het minimaliseren van de tijd tot het optimaliseren van antimicrobiële therapie met behulp van BC-GP kan bijdragen aan lagere kosten en verbeterde patiëntenzorg. In 2016 kreeg BC-GP wettelijke goedkeuring in Japan en werd daarmee de eerste multitarget moleculaire test voor positieve bloedkweken die is goedgekeurd als in-vitro diagnostisch hulpmiddel voor de diagnose van bacteriële bloedbaaninfecties. Aanvullende studies zullen nodig zijn om de kosteneffectiviteit van BC-GP te valideren binnen de context van het Japanse gezondheidszorgsysteem.

Ethische goedkeuring

Deze studie werd goedgekeurd door de interne beoordelingsraden van TH en SHI.

Belangen

Alle auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Bijdragen van de auteurs

Ken Kikuchi ontwierp en voerde de studie uit en stelde het manuscript op. Mari Matsuda, Shigekazu Iguchi, Tomonori Mizutani, Kaori Sansaka, Kenta Negishi, Kimie Shimada, Shigeyuki Notake, Hideji Yanagisawa, en Reiko Yabusaki voerden de laboratoriumwerkzaamheden uit. Keiichi Hiramatsu, Michiru Tega-Ishii, Jun Umemura, Hiroshi Takahashi, Hideki Araoka, en Akiko Yoneyama hielden toezicht op de gegevensverzameling en coördineerden en werkten mee aan de opzet van de studie.

Acknowledgments

Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door een Grant-in-Aid (S0991013) van het Ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap, en Technologie, Japan (MEXT), voor de Stichting van Strategische Onderzoeksprojecten in Particuliere Universiteiten.