INTRODUÇÃO

Yoghurt é um produto lácteo preparado por fermentação de leite com Lactobacillus spp. Agora um dia, as propriedades terapêuticas, profiláticas e nutricionais do iogurte são amplamente aceitas (Boor, 2001). Quando administrado em quantidade suficiente, os probióticos dão benefício à saúde do hospedeiro e aumentam o equilíbrio microbiano (Fuller, 1989; Guarner et al., 2005). Assim, os probióticos são microorganismos vivos, não patogénicos e amigáveis que desempenham papéis benéficos no compartimento da microflora do hospedeiro (Schrezenmeir e de Vrese, 2001). As Bactérias Ácidas Lácticas (LAB) são o grupo probiótico mais importante de microrganismos, especialmente Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp. e Enterococcous sp. (Klein et al., 1998). As qualidades dietéticas e terapêuticas do produto lácteo são determinadas pelo microorganismo probiótico (Boor, 2001).

Yoghurt é uma fonte potencial de Lactobacillus spp. O iogurte é também conhecido como o alimento probiótico mais rico em contaminação probiótica. O valor nutricional do produto lácteo é aumentado pelos microrganismos probióticos e metabólitos produzidos como resultado da fermentação. O consumo regular de iogurte reduz o excesso de gordura do fígado e aumenta com a secreção. Também é necessário para quem sofre de doenças cardíacas, aterosclerose, hipertensão e inflamação. O suco gástrico que é secretado pela ação do iogurte leva a uma alta capacidade digestiva. O efeito benéfico dos microrganismos probióticos, especialmente Lactobacillus sp., que existe nos produtos lácteos e que, além disso, muitas investigações estudaram os efeitos dos microrganismos probióticos contra os organismos patogénicos utilizando diferentes métodos (Mercenier et al., 2003).

Lactobacilli são membros das bactérias do ácido láctico cujo produto final da fermentação primária é o ácido láctico. São bactérias comercialmente importantes com uma grande variedade de aplicações tanto na indústria alimentar como não alimentar devido ao seu estatuto de “Generally Recognized As Safe” (GRAS). Os Lactobacilos têm sido amplamente estudados pela sua biologia molecular para melhorar as suas características benéficas específicas (Pouwels e Leer, 1993).

O modo de acção dos probióticos baseia-se na capacidade das bactérias probióticas de ligar patogénios no tecido epitelial intestinal. A ação anti-patogênica dos probióticos consiste na produção de ácido láctico que diminui o pH, interage com as toxinas produzidas pelos patógenos com a produção de peróxido de hidrogênio e bacteriocina de síntese (Corcionivoschi et al., 2010).

Um produto probiótico eficaz requer a correta identificação e caracterização de uma espécie bacteriana utilizada. A seleção de organismos probióticos que possam ser úteis terapêutica e nutricionalmente seria baseada em propriedades específicas (Fuller, 1989; Quewand e Vesterlund, 2004).

O objetivo desta pesquisa foi coletar iogurtes de várias regiões de Bangladesh e identificação de lactobacilos por PCR bacteriológica, bem como por PCR específica do gênero e análise de suas propriedades probióticas após a interferência no crescimento bacteriano patogênico.

MATERIAIS E MÉTODOS

Recolha de amostras e isolamento de Bactérias Ácidas Lácticas (LAB): Dois tipos de amostras de iogurte foram coletadas em diferentes superstores de Chittagong e Bogra city em Bangladesh que eram azedas (amostra M1, M2 e M3) e doces (amostra S2) no sabor. Em seguida, as amostras foram armazenadas imediatamente após a coleta em geladeira a baixa temperatura (4°C), de forma asséptica, para proteger a contaminação e a deterioração da forma. O Lactobacillus spp. foi isolado de amostras de iogurte por diluições apropriadas com solução salina a 0,9%. Para o crescimento do organismo foram utilizados o caldo MRS (Man, Rogosa e Sharpe) e meios de ágar MRS (Man, Rogosa e Sharpe). O pH dos meios foi ajustado para 6,5. As placas foram incubadas aerobicamente a 37°C por 48 h. Finalmente, a colônia única de Lactobacillus foi isolada pela observação da morfologia da colônia e alguns testes bioquímicos como a coloração grama, catalase e teste de oxidase. Colónias bem isoladas foram recolhidas e transferidas para caldo MRS para enriquecimento de Lactobacillus a 37°C.

Identificação de Bactérias Ácidas Lácticas (LAB) por análise bacteriológica: A identificação foi realizada de acordo com os métodos descritos no manual de bacteriologia sistêmica de Bergeys. Sem o uso de condições anaeróbicas todas as estirpes cresceram bem em ágar MRS a 37°C por 48 h para o crescimento seletivo de lactobacilos. A partir de diluições apropriadas uma colónia representativa foi escolhida e tentativamente identificada como lactobacilos após reacção de coloração de Gram, aspecto da colónia, morfologia celular, teste de catalase, teste de oxidase, teste de indole, teste de vermelho de metilo, teste de voges-proskauer, teste de utilização de citrato e padrões de fermentação de hidratos de carbono como delineado pelo manual de Bergeys (Hensyl, 1994).

Retirada de ADN de isolados: O DNA foi extraído de 4 amostras isoladas de iogurte de acordo com o método clássico Heat-thaw (Salehi et al., 2005). A cultura bacteriana pura de ágar MRS slant foi subcultivada em meio de caldo MRS do qual 1,5 mL de caldo de cultura foi retirado em tubo eppendorf e centrifugado a 10.000 rpm durante 5 min. Depois disso, o sobrenadante foi descartado e o grânulo foi coletado. Cerca de 200 μL de água deionizada autoclavada foi adicionada à pelota e dissolvida por agitação dos dedos. A tampa do tubo eppendorf foi perfurada com agulha esterilizada e depois o tubo foi fervido em banho-maria a 100°C durante 10 min. Logo após a ebulição, o tubo de eppendorf foi mantido em gelo durante 10 min e depois centrifugado a 10.000 rpm durante 10 min. Depois 100-150 μL foi recolhido o sobrenadante contendo ADN cromossómico bacteriano.

Amplificação por PCR específica do geno: Para determinar a afiliação ao nível do género dos 4 isolados, a PCR foi realizada com o conjunto de primers específicos do género LbLMA1-rev (5′-CTCAA AACTAAAAAGTTTC-3′) e R16-1 (5′-CTTGTACACACCG CCCGTCA-3′) desenhados por Dubernet et al. (2002). A análise PCR foi feita com base na região do espaçador intergénico RNA ribossómico 16-23S como descrito anteriormente (Dubernet et al., 2002).

A mistura de reacção (20 μL) continha 1 μL (100 ng μL1) de cada primário adicionado com 10 μL 10× PCR Master Mix, 6 μL de água PCR e 2 μL de modelo. A condição de execução foi a desnaturação inicial a 95ºC durante 5 min, seguida de 30 ciclos consistindo em desnaturação a 95ºC durante 30 seg, recozimento a 55ºC durante 30 seg, extensão a 72ºC durante 30 seg e um passo final de extensão de 7 min a 72ºC. Os produtos foram armazenados a 4°C até a análise. Os produtos amplificados foram submetidos a electroforese em géis de agarose a 1% em tampão TAE (40 mM Tris acetato, 1 mM EDTA, pH 8,2). Os géis foram corados com brometo de etídio (5 μg mL1) e visualizados sob transiluminador UV (Biometra GmBH, Alemanha).

Análise de características probióticas: As características probióticas foram determinadas através da análise dos seguintes testes.

Teste de tolerância a NaCl: Para a determinação da tolerância ao NaCl, foram cultivados Lactobacilos isolados em caldo de MRS contendo nove tubos de ensaio que foram ajustados com diferentes concentrações de NaCl (1-9%). Após autoclavagem por 15 min em pressão de 15 Ibs a 121°C, cada tubo de ensaio foi inoculado com 10 μL durante a cultura noturna de Lactobacillus e incubado anaerobiamente a 37°C durante 24 h. Após 24 h de incubação, o crescimento bacteriano foi medido usando um espectrofotômetro a 560 nm (Graciela e Maruia, 2001).

Teste de tolerância à sal biliar: A taxa de crescimento das culturas bacterianas foi determinada em caldo de MRS contendo diferentes níveis (0,05, 0,1, 0,15, 0,3 e 0,5%) de sais biliares. As culturas recentemente preparadas foram inoculadas (1%) em meio e incubadas a 37°C durante 24 h sob condição anaeróbica. Em seguida, a densidade óptica de cada amostra foi medida usando um espectrofotômetro a 560 nm (Graciela e Maruia, 2001).

Determinação do pH ótimo para o crescimento: Para a determinação do pH óptimo para o crescimento, 100 μL de cultura de Lactobacillus fresco durante a noite foi inoculado em tubos de ensaio contendo MRS com pH variável entre 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 e 8,0. Para determinar o efeito do pH no tampão de acetato de crescimento (pH -4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5), foram utilizados tampão Tris-HCl (pH-7) e tampão de borato (pH-8). O caldo inoculado foi incubado em condições anaeróbias durante 24 h a 37°C. Após a incubação, o crescimento das bactérias foi medido usando um espectrofotômetro a 560 nm contra caldo controle não inoculado.

Quantificação do ácido orgânico e determinação do valor do pH: De acordo com Hoque et al. (2010), foi realizada a quantificação dos ácidos orgânicos produzidos pelos isolados e a determinação de seus valores de pH. O caldo MRS complementado com 10% de leite desnatado inoculado com 1% (v/v) ou 100 μL cultura noturna dos isolados e incubado em condição anaeróbica a 37°C por 72 h. Amostras fermentadas foram coletadas a cada 24, 48 e 72 h e líquidos de leite coagulado foram separados por filtração. Após a filtração, o pH do líquido separado foi registrado usando um eletrodo digital medidor de pH e a quantificação do ácido orgânico foi feita através de titulação com NaOH 0,1 N usando fenóftalieno como indicador de pH (Hoque et al., 2010).

Processamento de interferência com bactérias patogênicas: As atividades antibacterianas das Lactobacillus spp. isoladas contra algumas bactérias patogênicas foram determinadas pelo método de agar overlay modificado (Aween et al., 2012). Oito diferentes patógenos humanos, Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli e Shigella sonnei foram usados neste estudo como patógenos de teste. A atividade antibacteriana foi ainda caracterizada pela determinação se bacteriostática ou bactericida. O teste foi realizado através de esfregaço da zona de inibição de crescimento. O esfregaço foi estriado na placa de ágar nutriente e incubado aerobicamente a 37°C por 72 h. A presença de crescimento na placa de ágar nutriente foi interpretada como uma atividade inibitória, ou seja, bacteriostática, enquanto nenhum crescimento foi interpretado como bactericida.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Identificação de bactérias através de testes bacteriológicos e bioquímicos: Os quatro isolados foram cultivados em meio Man, Rogosa e Sharpe (MRS) a pH 6,5. Todos os isolados foram produzidos de forma pequena, irregular e redonda com creme esbranquiçado brilhante ou de cor acastanhada, morfologicamente semelhantes a Lactobacillus spp.

Então todos os isolados foram examinados sob microscópio de campo brilhante para observar suas características microscópicas. Estes isolados foram encontrados com bactérias não formadoras de esporos, em forma de haste curta e média (Fig. 1a-d) que os indicam como membros de Lactobacillus spp. (Thamaraj e Shah, 2003).

Os isolados foram encontrados catalase e oxidase negativos e no teste IMViC (indole, methyl-red, voges proskauar, utilização de citrato) todos os isolados também foram encontrados negativos, assim estes podem confirmar que os isolados foram Lactobacillus spp. (Dhanasekaran et al., 2010).

Neste estudo, todos os quatro isolados foram capazes de fermentar 11 carboidratos diferentes, ou seja, glicose, sacarose, frutose, lactose, xilose, ribose, galactose, maltose, manitol, ramnose e dextrose indicando que eles são capazes de crescer em vários habitats utilizando diferentes tipos de carboidratos. Os resultados resumidos de todos os testes bacteriológicos e bioquímicos são apresentados na Tabela 1. Todos estes resultados são encontrados relevantes para os achados de Chowdhury et al. (2012).

Identificação molecular através de PCR específica do gênero: Neste estudo, utilizamos um primer específico do gênero preparado pela análise das semelhanças entre as sequências nucleotídicas da região espaçadora entre os genes RNA ribossômico 16 e 23S de Lactobacillus (Dubernet et al., 2002). A especificidade deste primer específico do gênero combinado com um primer universal foi testada contra 23 cepas de Lactobacillus de origem variada. Os produtos PCR foram submetidos a eletroforese em gel em 1% de agarose e visualizados por transiluminador UV. Foi encontrada uma faixa aguda esperada de 200 bp amplicon para cada amostra (M1, M2, M3 e S2) que corresponde à região do espaçador intergênico 16-23S rRNA de Lactobacillus spp. (Dubernet et al., 2002). Assim, todos os 4 isolados foram confirmados a nível do género como Lactobacillus spp. O controlo negativo sem qualquer modelo não deu qualquer banda, o que sugere que todos os 4 produtos PCR foram correspondência do ADN modelo (Fig. 2).

Análise das características probióticas: As bactérias probióticas produzem uma variedade de substâncias com propriedades antibacterianas, incluindo ácido orgânico, H2O2, bacteriocinas que afectam o metabolismo bacteriano ou a produção de toxinas (Rafter, 2003; Rolfe, 2000; Vandenbergh, 1993).

Para isso, devem ser capazes de suportar a condição desfavorável no intestino como NaCl e sal biliar.

Teste de tolerância de NaCl: O Lactobacillus spp. isolado, dos iogurtes foi capaz de tolerar 1-9% de NaCl. Para determinar a tolerância de NaCl dos isolados, a densidade óptica foi medida a 560 nm e os dados foram plotados. Os isolados M1, M2, M3 e S2 cresceram bem na concentração de NaCl a 1%. O crescimento máximo (DO) dos isolados M1, M2, M3 e S2 foi encontrado 1.420, 2.143, 1.662 e 2.207, respectivamente em 1% de NaCl (Fig. 3). Alta tolerância ao sal é uma propriedade desejável para o organismo ser usado como probiótico.

Sabe-se que o NaCl é uma substância inibitória que pode inibir o crescimento de certos tipos de bactérias. Neste estudo, os resultados mostraram que Lactobacillus spp., isolados de iogurtes, foram capazes de tolerar 1-9% de NaCl e o crescimento ótimo foi observado em 1-5% de NaCl (Hoque et al., 2010).

Teste de tolerância ao sal biliar: Lactobacillus spp. isolado, foi capaz de sobreviver em 0,05, 0,1, 0,15 e 0,3% de ácido biliar. O Lactobacillus spp. isolado, também foi capaz de se multiplicar em concentrações acima mencionadas de ácido biliar. A densidade óptica foi medida a 560 nm e os dados foram plotados. Todos os isolados crescem bem na concentração de 0,05% de sal da bílis. Os crescimentos máximos (DO) dos isolados M1, M2, M3 e S2 foram encontrados 1,741, 2,213, 1,758 e 2,125, respectivamente. A taxa de crescimento foi diminuída com o aumento da concentração de sal da bílis (Fig. 4).

Neste experimento foram utilizados 0,05-0,3% da concentração biliar que pode ser encontrada no trato intestinal humano e a concentração máxima da bílis que está presente no homem saudável é de 0,3% (Graciela e Maruia, 2001). É relatado que, antes de selecionar uma bactéria probiótica para consumo humano, ela deve ser tolerável a 0,3% de concentração biliar (Gilliland et al., 1984). Com base no resultado, sugere-se que, estas cepas podem ser potenciais para uso como organismo probiótico porque todos os isolados foram resistentes e capazes de crescer em 0,3% de concentração de sal biliar.

Determinação do pH ótimo para o crescimento: Os Lactobacillus spp. isolados, de iogurtes, foram capazes de crescer em pH entre 4,0-8,0. A densidade óptica foi medida a 560 nm e os dados foram plotados. Crescimento máximo (DO) dos isolados M1, M3 e S2 foram encontrados 2,201, 2,0619 e 2,237, respectivamente a pH 6,0 enquanto que o crescimento máximo dos isolados M2 foi de 2,259 a pH 6,5 (Fig. 5). Os isolados foram capazes de crescer a pH entre 4,0 e 8,0, mas o crescimento ótimo foi observado a pH entre 5,0 e 6,5 quando cultivados em caldo de MRS a 37°C. Deste estudo pode-se concluir que a taxa de crescimento de Lactobacillus spp., diminui em determinado estágio quando a concentração de pH aumenta (Chowdhury et al.., 2012).

Quantificação do ácido orgânico e determinação do valor do pH: Para a quantificação do ácido orgânico, foi utilizado o método de titulação.

Quantificação do ácido orgânico = V×N×D

Em que V é volume de NaOH, N é força de NaOH e D é factor de diluição. O resultado da produção de ácido orgânico é apresentado na Tabela 2.

Este estudo indica que a produção de ácido orgânico foi aumentada com o tempo de incubação mas ao mesmo tempo o pH do meio diminuiu com o aumento da produção de ácido. A partir do resultado (Tabela 2), a maior acidez (1,9%) e o menor pH 3,64 foi observado após 72 h de incubação a 37°C para o probiótico Lactobacillus isolado do iogurte Bogra. Outras bactérias probióticas isoladas do iogurte de diferentes supermercados de Chittagong apresentaram a maior acidez 1,83, 2,11 e 2,11% e o menor pH 3,9, 3,68 e 3,65, respectivamente após 72 h de incubação.

Existe uma pequena variação na produção de ácido orgânico por lactobacilos devido às suas diferenças regionais, indicando que estes isolados são ligeiramente dependentes do clima e ambiente (Hoque et al, 2010).

Processamento de interferência com bactérias patogénicas: Os probióticos incluindo Lactobacillus, Bifidobacterium e Streptococcus spp., são conhecidos por serem inibidores do crescimento de uma ampla gama de patógenos intestinais no ser humano. Além dos efeitos favoráveis contra doenças causadas por um desequilíbrio da microflora intestinal, Dunne et al. (2001) e Wollowski et al. (2001) relatam várias observações experimentais de bactérias contra o desenvolvimento de tumores no cólon.

Os resultados experimentais mostraram que a maior atividade inibitória do isolado M1 foi demonstrada contra Bacillus cereus (51,20±1,22 mm) e a menor zona de inibição foi (23,46±1,00 mm) contra Shigella sonnei após 72 h de incubação. O maior diâmetro da zona de inibição do isolado M2 foi demonstrado contra E. coli (38,43±1,00 mm) e a menor zona (20,10±1,00 mm) contra Bacillus megaterium após 72 h de incubação. Similarmente, o maior diâmetro da zona de inibição do isolado M3 foi mostrado contra P. aeruginosa (42,90±1,20mm) e a menor zona (17,83±1,10mm) contra S. aureus. E finalmente, no isolado S2, a zona mais alta foi observada contra E. coli (43,80±1,20mm) e a zona mais baixa (21,63±1,10mm) contra S. aureus após 72 h de incubação. Os resultados relacionados a Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae e Escherichia coli foram encontrados relevantes para os achados de Chowdhury et al. (2012).

Neste estudo, os isolados M1, M2, M3 e S2 mostraram resultados satisfatórios em relação à atividade bacteriocida e bacteriostática. Isolado M1 foi bactericida para Bacillus megaterium, Vibrio cholera, Shigella sonnei e bacteriostático para Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, P. aeruginosa, S. aureus e E. coli. Isolado M2 foi bactericida para Bacillus cereus, Shigella sonnei e bacteriostático para Shigella dysenteriae, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus megaterium, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, Escherichia coli. Isolado M3 foi bactericida para Shigella dysenteriae, Bacillus megaterium e Staphylococcus aureus e bacteriostático para Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Escherichia coli e Shigella sonnei e isolado S2 foi bactericida a Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae e Shigella sonnei e bacteriostático a Bacillus megaterium e Escherichia coli.

CONCLUSÃO

Neste estudo o Lactobacillus spp.., foram isolados e identificados a partir de iogurtes regionais selectivos. Para a identificação das bactérias foram realizados vários testes bacteriológicos e bioquímicos. Além disso foi realizada uma PCR utilizando os primers específicos do gênero (LbLMA-rev) e universal (primer R16-1) correspondentes à região do espaçador intergênico 16-23S rRNA de Lactobacillus spp., para confirmar a identificação bacteriológica. Os Lactobacillus spp. isolados foram capazes de tolerar substâncias inibitórias como NaCl (1-9%) e sal biliar (0,05-0,3%) e também capazes de sobreviver em condições alcalinas (pH 8,0). Todos esses isolados (M1, M2, M3 e S2) foram capazes de utilizar carboidratos como glicose, xilose, sacarose, frutose, galactose, lactose, maltose, ribose, ramnose, manitol e dextrose. Além disso, o Lactobacillus spp. isolado, de todos os 4 isolados (M1, M2, M3 e S2) foi capaz de produzir ácido orgânico no leite. Esta investigação indica que existe uma pequena variação na produção de ácido orgânico por Lactobacillus devido à sua variação regional. A presença de atividades antibacterianas de todos os 4 isolados (M1, M2, M3 e S2) contra oito bactérias patogênicas humanas comuns foi considerada satisfatória e os isolados produzem bacteriocina extra celular. Um probiótico deve ser capaz de inibir os organismos patogênicos e deve ser capaz de tolerar as condições severas do intestino humano, tais como alto sal, baixo pH e alta concentração de sal biliar. Todos os Lactobacillus spp. isolados cumpriram estes critérios e, portanto, podem ser considerados como potenciais probióticos para a saúde humana.