Abstract

Infecção do trato urinário (ITU) é um problema global. A maioria das pesquisas de IU concentra-se na etiologia gram-negativa. Foi descoberto que as Enterobacteriaceae são as infecções UTI mais prevalentes, constituindo mais de 80% de todos os casos relatados. As principais bactérias gram-positivas nos casos de IU são Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae. Os patógenos gram-positivos foram relatados em vários países, tanto em casos de IU não complicados como complicados. A terapia antibiótica das bactérias gram-positivas é completamente diferente da dos patógenos gram-negativos do ITU. No entanto, os sintomas associados com IU causados por gram-positivos e gram-negativos são muito semelhantes. Sem um diagnóstico adequado, há uma grande possibilidade de se obter um diagnóstico errado e uma antibioticoterapia subsequente. Estudos muito limitados estão disponíveis focando a etiologia e suas suscetibilidades antibióticas na perspectiva de Bangladesh. O nosso objectivo é procurar, nesta área de pesquisa de preenchimento de lacunas. Este estudo detectou 8,2% de bactérias gram-positivas em pacientes com IU. A prevalência mostra a harmonia com os relatórios publicados anteriormente. Verificou-se que homens e mulheres foram igualmente infectados por patógenos gram-positivos de ITU. A maioria das publicações anteriores mostra que as fêmeas são mais vulneráveis a bactérias gram-negativas de IU. Improvável que os nossos achados pareçam que os machos são igualmente vulneráveis por gram-positivos em comparação com as fêmeas. Outros estudos com mais tamanhos de amostra podem justificar os resultados preliminares. Análises antibiográficas mostraram amikacina e gentamicina como os antibióticos mais eficazes contra os nossos isolados testados. Em contraste, a nitrofurantoína foi encontrada como a droga mais ineficaz neste estudo. Os achados do estudo podem ajudar na prescrição de antibióticos deste estudo baseado em evidências.

Palavras-chave

urofogênio, IU, resistência antimicrobiana, tratamento empírico, Bangladesh

A abreviações

API: Analytic Profile Index; CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute; CLED: Ágar Cisteína Lactose Deficiente em Eletrolíticos; MDR: Multi Drug Resistant; MHA: Muller Hinton Agar; PBS: Fosfato salino tamponado; ITU: Infecção do trato urinário

Introdução

Infecção do trato urinário (ITU) é uma das doenças infecciosas mais comuns. Os principais agentes causadores das IU são Escherichia coli e outras Enterobacteriaceae. As restantes proporções estão associadas a uma variedade de organismos, incluindo a bactéria Gram-positiva Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae (Streptococcus do grupo B, GBS), e outros organismos menos frequentemente isolados. As bactérias uropatogênicas gram-positivas mais prevalentes incluem Staphylococcus saprophyticus e Enterococcus facecalis . Gram-positivos uropatogênicos foram relatados em vários países, tanto em IU descomplicadas quanto em IU complicadas . Não existem estudos exclusivos deste tipo na população de Bangladesh para procurar a etiologia do IU gram-positivo. Sem um diagnóstico adequado, há uma grande possibilidade de obter medicamentos errados e inapropriados e subseqüentes efeitos colaterais adversos do tratamento associado. As bactérias gram-positivas são mais frequentemente encontradas como agentes etiológicos de IU entre mulheres grávidas e idosos. Além disso, as IU complicadas ocorrem frequentemente em ambientes nosocomiais e/ou institucionais e estes indivíduos têm um risco maior de IU gram-positivas e polimicrobianas. Ela é responsável por uma grande proporção do consumo de antibióticos e tem um grande impacto sócio-econômico e pode contribuir para a resistência bacteriana . Os médicos frequentemente enfrentam problemas na escolha do antibiótico adequado para a terapia empírica para o tratamento das IU . No Bangladesh, o uso indiscriminado de antibióticos traz muitos resultados adversos para os pacientes com IU clinicamente, com uma carga econômica prolongada. Este estudo teve como objectivo avaliar o perfil de susceptibilidade dos uropatógenos gram-positivos contra os diferentes antibióticos prescritos. Nosso estudo tinha racionalizado a necessidade de monitoramento contínuo dos pacientes infectados pelo trato urinário para uma melhor compreensão da sua epidemiologia atual por cepas de bactérias gram-positivas na população do Bangladesh.

Métodos e materiais

Recolha de dados

Informação sociodemográfica do paciente, histórico de tratamento (se os pacientes foram tratados com terapia antimicrobiana), e qualquer informação clínica relevante (pedras nos rins, gravidez, uso recente de cateteres) foram registrados por um questionário estruturado.

Desenho do estudo e coleta da amostra

Um estudo transversal foi realizado entre julho de 2018 e dezembro de 2018 para procurar isolar bactérias gram-positivas de pacientes com infecção do trato urinário. Este estudo foi desenhado com base em investigações laboratoriais de amostras de urina coletadas de pacientes com infecções urinárias em diferentes hospitais comunitários na área de Savar. Para acionar o planejamento, prováveis pacientes com IU que procuraram aconselhamento médico no Hospital Gonosastha e no Colégio Médico Enam em Savar, Dhaka, foram solicitados a participar deste estudo. O estudo inclui pacientes consentidos com evidência clínica de IU com sintomas há menos de sete dias apresentando no departamento ambulatorial dos hospitais e aqueles admitidos por menos de 48 h.

Isolamento e identificação bacteriana

Isolar o patógeno IU, amostras de urina limpa no jato médio foram coletadas em tubos de vidro estéreis e inoculadas em um meio de cultura diferencial, cisteína, lactose e ágar com deficiência de eletrólitos (CLED) (Lyophilchem, Itália). Os pacientes foram previamente explicados sobre o procedimento padrão de coleta de amostras em meio de cultura limpa, para evitar contaminação com bactérias comensais. Para evitar resultados falso-positivos, as amostras de urina foram tratadas em 2 h após a colheita. O uso do ágar CLED oferece vantagens de suporte ao crescimento da maioria dos uropatógenos potenciais, incluindo cocos gram-positivos como Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, e Enterococcus spp. Paralelamente, foi inoculado ágar salino de Manitol (MSA) para o crescimento de IU gram-positivo. As culturas de urina foram incubadas durante a noite a 35ºC-37ºC no ar ambiente. Culturas quantitativas de urina foram feitas, e contagens de colônias de 102 ou 103 UFC/mL foram consideradas para definir a provável infecção por IU nos respectivos pacientes. As contagens de colónias inferiores a 102 UFC/mL foram consideradas como potencial contaminação. As colónias bacterianas purificadas foram identificadas por coloração grama, procedimentos bioquímicos convencionais seguidos por um kit de teste bioquímico rápido (API 20E, BioMe’rieux, Durham, NC) constituído por um conjunto de painéis cromogénicos, baterias de hidratos de carbono e substratos enzimáticos. A identificação bacteriana foi ainda validada por genotipagem usando 16S rRNA dos isolados em parte.

Avaliação da sensibilidade antimicrobiana

Isolados foram submetidos a teste de sensibilidade antibiótica in vitro pelo método de difusão de disco Kirby-Bauer padrão e zona de inibição foram interpretados seguindo as recomendações CLSI (Clinical amp; Laboratory Standards Institute-2010). Seis discos de antibióticos de beta-lactam, nitrofurantoína e fluoroquinolona foram colocados no gramado bacteriano e incubados a 37ºC para determinar o padrão de sensibilidade. As bactérias sensíveis deram uma zona clara ao redor do disco antibiótico e o diâmetro da zona foi medido para comparar com o padrão.

Detecção dos genes resistentes a β-lactamase e quinolona

Isolados que apresentavam fenótipo resistente foram submetidos a PCR para a detecção do gene blaTEM e qnrS. Um total de seis lisados bacterianos foram preparados. A PCR foi realizada em tubo PCR contendo lisado bacteriano como modelo de ADN (1 µl) com um volume final de 12 µl contendo pré-mistura de ADN 2x (6 µl), 5 pmol de cada primer (1 µl) e água desionizada (4 µl). A PCR foi realizada num termociclador e as condições de ciclo para bla TEM e qnrS foram: desnaturação inicial a 94°C durante 5 min seguida de 32 ciclos de amplificação com desnaturação a 94°C durante 30 s, recozimento a 50°C durante 30 s (blaTEM) e 55°C durante 30 s (qnrS) e extensão a 72°C durante 1min, terminando com uma extensão final a 72°C durante 7 min. Produtos PCR do tamanho esperado foram purificados e sequenciados usando os mesmos primers usados para gerar os produtos PCR.

Análises estatísticas

Como descrito, a versão Bangla validada do questionário foi usada para a recolha de dados. Os formulários de recolha de dados preenchidos foram novamente verificados pelos supervisores de recolha de dados. Análises de laboratório a 10% escolhidas aleatoriamente foram feitas duas vezes por diferentes pesquisadores para garantir a autenticidade dos dados de laboratório e para avaliar os enviesamentos entre pesquisadores. Os dados verificados foram introduzidos e posteriormente analisados utilizando o editor de dados estatísticos SPSS da IBM (versão 21). Os dados em falta foram excluídos da análise bivariada. A estatística descritiva foi relatada como frequência, percentagem e média quando aplicável, juntamente com o desvio padrão. A susceptibilidade antimicrobiana das bactérias de teste foi avaliada por uma escala categórica de 3 tipos como suscetível (antibiótico indicado como totalmente eficaz), intermediário (indicado como parcialmente eficaz), e resistente (indicado como não eficaz). Para a associação de teste entre os dados categóricos, foi utilizado o teste qui-quadrado de Pearson, e a correção de Yate para continuidade foi aplicada quando apropriado. Como tal, foi calculada a exposição de antimicrobianos à aquisição de genes resistentes a antibióticos. O coeficiente de correlação foi calculado para verificar a força da associação. Testes t de amostra independentes foram realizados ao comparar as médias das variáveis contínuas. Um valor de p bilateral menor que 0,05, foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

Demografia da população estudada

Apresentamos pacientes que freqüentaram médicos do Gonosatha Medical College com suas complicações associadas ao ITU. Incluímos 147 pacientes neste estudo que apresentavam sintomas clínicos graves. Destes, 36 (24,5%) eram do sexo masculino e os 111 (75,5%) restantes eram do feminino. Portanto, quase três vezes os pacientes com IU foram encontrados do sexo feminino em comparação com o sexo oposto (Figura 1). O teste do qui-quadrado mostrou gênero feminino associado a um número significativamente maior de eventos de IU (p = 0,04). A distribuição etária dos casos de nosso estudo é de abaixo de um ano a acima de 70 anos. Entretanto, a infecção mais freqüente por IU foi na faixa etária entre 21-30 anos. A distribuição global de casos por idade foi descrita na tabela 1. Um total de cinco dos 12 Staphylococcus spp (42%) foi identificado na faixa etária de 21-30 anos. Nenhuma outra tendência foi observada na distribuição da infecção por IU gram-positiva.

Figure 1. Distribuição de bactérias gram-positivas e gram-negativas entre homens e mulheres. As fêmeas tiveram um número significativamente maior de IU do que os machos que foram causadas por bactérias gram-negativas. No caso de infecção do trato urinário gram-positivo, homens e mulheres apresentaram igual vulnerabilidade

Tábua 1. Idade-distribuição dos pacientes do estudo do ITU

Isolamento e identificação de grama…patógenos positivos de ITU

Examinamos 147 amostras de urina de pacientes clinicamente sintomáticos. O meio de cultura CLED produziu diferentes colónias de cor para diferentes patogénios UTI. O Staphylococcus aureus gram-positivo produz colónias amarelas e o Staphylococcus saprophyticus gera colónias brancas a amareladas, e o Enterococcus spp produz colónias incolores a amarelas. As bactérias Gram-negativas produzem outras cores diferentes. Portanto, a identificação das bactérias UTI através da observação das cores das colónias no CLED pode ser presunçosa, mas difícil de concluir. Sub-cultivamos as prováveis colónias Gram-positivas do meio de cultura CLED para o Ágar de Sal de Manitol (MSA) e incubamos durante a noite a 37°C. As colónias de crescimento em MSA mostraram branco a amarelado e rosa. Bactérias de MSA foram submetidas a coloração de Gram-positivo e encontraram natureza Gram-positiva. Bactérias gram-positivas UTI preliminares foram identificadas por este estudo são espécies de Staphylococcus. A análise do índice de perfil analítico (API) e/ou sequenciação do DNA 16sRNA pode ser feita para identificar a etiologia em nível de espécie. Detectamos 12 gram-positivos do ITU, que foi 8,2% da população total de patógenos.

Padrão de resistência antimicrobiana dos isolados gram-positivos do ITU

A experiência de difusão em disco produziu zonas claras de relvado bacteriano em ágar Muller-Hinton (MH), indicando a susceptibilidade dos respectivos antibióticos impregnados ali. Em contraste, isolados resistentes não permitiram a zona clara mesmo na presença do disco antibiótico. Uma tendência mista da suscetibilidade contra os antibióticos testados foi observada em nossa avaliação. A maior resistência foi encontrada contra a nitrofurantoína (91,7%), seguida pela amoxicilina (83%), ofloxacilina (50%). Tanto a gentamicina quanto amikacina foram encontradas drogas muito eficazes, onde apenas 8,3% foram encontradas resistentes (Figura 2).

Figure 2. Prevalência de resistência a antibióticos entre bactérias gram-positivas UTI.
AMC: Amoxicilina; LOM: Lomefloxacina; OFX: Ofloxacina; CN: Gentamicina; AK: Amikacin; F: Nitrofurantoína. Amikacina e Gentamicina apareceram antibióticos mais eficazes contra bactérias Gram-positivas UTI. Nitrofurantoína foi a menos efetiva entre os antibióticos testados.

Genes resistentes a antibióticos em uropatógenos gram-positivos

Preparamos amostras de DNA de todos os 12 isolados gram-positivos pelo método de ebulição por calor. As paredes celulares das bactérias gram-positivas são geralmente muito mais rígidas que as bactérias gram-negativas, o que pode afectar a libertação de ADN nos métodos de ebulição a quente. Na análise atual, examinamos o anel de beta-lactam contendo o gene bla-TEM resistente a antibióticos e encontramos dois isolados (2/6, 33%) isolados positivos. Da mesma forma, verificamos a presença do gene qnr-S resistente a antibióticos do grupo das fluoroquinolonas e encontramos três isolados positivos (3/6, 50%).

Discussão

Infecções do trato urinário representam uma das doenças mais comuns encontradas na prática médica, causando morbidade associada significativa e ocorrendo de neonatos a idosos . A prevalência de infecções pode variar com a idade, sexo e certos fatores predisponentes. A maior parte da infecção notificada por IU foi causada por bactérias gram-negativas, principalmente Enterobacteriaceae. Houve também fortes evidências contra a infecção por IU gram-positiva. Procuramos examinar a prevalência de patógenos gram-positivos de IU na população do Bangladeche. Os tratamentos empíricos para a infecção urinária baseados em critérios de gravidade e sintomas clínicos representam um grande desafio. Como a terapia antibiótica das bactérias gram-positivas é completamente diferente da dos patógenos gram-negativos de IU, há uma grande possibilidade de obter o tratamento errado através de uma abordagem empírica. Portanto, o diagnóstico correto com testes específicos de suscetibilidade a antibióticos é imperativo para estabelecer a administração de qualquer tratamento. Como as IU são uma doença comum adquirida na comunidade em Bangladesh, portanto, uma porcentagem significativa da população está sendo infectada com esta doença a cada ano. O estudo foi concebido para verificar as susceptibilidades antimicrobianas de patógenos gram-positivos de IU também. Detectamos cerca de 8,2% de gram-posição de etiologias de IU, nomeadamente, Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, e Enterococcus spp. que anexaram relatórios publicados anteriormente .

Comumente, a infecção por IU foi registada muito mais elevada nas fêmeas do que nos machos . Improvável que tenhamos encontrado metade da infecção gram-positiva nos homens. Os resultados preliminares mostraram que os machos são mais vulneráveis por gram-positivos em comparação com a situação geral. A distribuição etária dos casos do nosso estudo é de abaixo de um ano a acima de 70 anos. No entanto, a infecção por IU gram-positiva mais frequente foi na faixa etária entre 21-30 anos, como suportada em outros locais .

A resistência a antibióticos entre os uropatógenos tornou-se uma preocupação de saúde pública em Bangladesh. Neste estudo, os perfis de susceptibilidade aos antibióticos dos patógenos gram-positivos de IU foram determinados com seis discos de antibióticos diferentes por teste de difusão em disco. A maior percentagem de resistência foi observada contra a nitrofurantoína, enquanto a menor percentagem de resistência foi encontrada contra o amikacin e a gentamicina. Menos de 10% dos gram-positivos uropatogênicos pareceram resistentes contra esses dois antibióticos do grupo aminoglicosídeo. Os resultados apoiam o aminoglicosídeo como droga de escolha para patógenos gram-positivos UTI. Entre os antibióticos do grupo das quinolonas, a maior percentagem de resistência tinha sido encontrada pela lomefloxacina de segunda geração (75%). Nossos achados do antibiograma mostraram que a nitrofurantoína não era um medicamento muito eficaz para bactérias gram-positivas de IU. O antigo antibiótico beta-lactam, amoxicilina, era pouco funcional contra os patógenos gram-positivos do ITU. Os antibióticos fluoroquinolona, ofloxacilina e lomefloxacina foram encontrados moderadamente eficazes.

Os isolados foram testados para genes AMR selecionados por reação em cadeia da polimerase (PCR), usando primers específicos para a detecção de bla-TEM e qnrS. Cerca de 33% dos isolados foram positivos para o bla-TEM e 50% foram positivos para o qnrS. Os genes resistentes a antibióticos foram detectados e mostraram harmonia com o padrão de suscetibilidade fenotípica. Embora com a máxima sinceridade e dedicação foram investigados para realizar o estudo, não foi possível ir além das limitações, pois o tamanho da amostra não era suficientemente grande. Apesar desta limitação, espera-se que esta descoberta do estudo ajude os clínicos a decidir prescrever antibióticos a partir do estudo baseado em evidências. O clínico deve cuidar do diagnóstico específico antes de prescrever a antibioticoterapia empírica, em particular para a UTI masculina.

Declaração ética

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Jahangirnagar, Faculdade de Ciências Biológicas e o consentimento verbal foi obtido de pacientes e médicos da UTI.

Acreditos

Os autores gostariam de agradecer aos respectivos pacientes e médicos pela sua colaboração. Os autores reconhecem a contribuição do pessoal do laboratório geral, Departamento de Microbiologia, Universidade Jahangirnagar.

Divulgação

Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo Grant for Advance Research (GARE), Ministério da Educação e The Ministry of Science and Technology Research Grant, Bangladesh, ao Dr. Md. Salequl Islam.

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