Modelo discreto
O crescimento de uma colônia microbiana que está consumindo um nutriente difusor é representado usando o modelo baseado em malha introduzido pelo Matsuura23, cujos detalhes são dados na seção 3. Em resumo, consideramos uma malha retangular com L x e L y nas direções x e y, respectivamente. O número de células ocupadas é indicado por ν com a correspondente densidade de células ρ = ν/(L x L y ). Cada elemento da malha retangular pode abrigar no máximo uma célula, mas pode conter qualquer número inteiro não-negativo de partículas nutritivas, independentemente de também haver uma célula nesse local. Em cada etapa, as células de levedura podem absorver uma partícula de nutrientes localizada no mesmo local e produzir uma única célula filha em um local adjacente em uma direção cardinal, enquanto as partículas de nutrientes podem tomar s etapas, novamente nas direções cardinais. Como condição inicial, as células são semeadas dentro da malha em um padrão prescrito, enquanto um número de partículas de nutrientes são colocados uniformemente ao acaso dentro do domínio para dar uma concentração inicial média especificada c0. Os limites do domínio são tratados como paredes sólidas, replicando o comportamento experimental dentro de uma placa de Petri. Importante, os padrões produzidos por este modelo são o resultado da interação entre as células e o nutriente sozinho, de modo que qualquer morfologia não uniforme produzida pelo modelo pode ser atribuída inteiramente a DLG.
Morfologias características da DLG
Matsushita & Fujikawa12 utilizou uma colónia de B. subtilis para ilustrar três fenómenos chave que surgem devido à DLG: (I) o ‘screening’ de ramos mais curtos por ramos mais longos; (II) repulsão entre colónias vizinhas; e (III) crescimento direccionado para uma fonte de nutrientes (Fig. 2). Estas características já foram demonstradas anteriormente devido apenas à DLG, utilizando um modelo de crescimento da colónia baseado em grelha, semelhante ao aqui utilizado30. Primeiro confirmamos que o modelo discreto descrito acima pode reproduzir este comportamento antes de usar este modelo para quantificar os padrões produzidos.
Resultados experimentais por Matsushita & Fujikawa12 (linha superior) com simulações de modelo correspondentes (linha inferior). São mostrados (a) ramos maiores, rastreando ramos menores de nutrientes (fenômeno I), (b) duas colônias semeadas próximas uma da outra parecendo se repelir (fenômeno II), e (c) uma única colônia crescendo em direção à fonte de nutrientes no lado direito da placa de petri (fenômeno III). Simulações de (d) ramos de rastreio, (e) duas colónias próximas e (f) crescimento com nutrientes no lado direito são computados usando o modelo baseado na malha. As células da semente são marcadas por um ponto vermelho. As simulações foram computadas em retículas com dimensões L x = L y = 200 com parâmetros s = 3 e c0 = 1, o que resulta num valor de Δ da mesma ordem de grandeza que nas experiências. As figuras 2(a), 2(b) e 2(c) são reimpressas de Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 168, Mitsugu Matsushita e Hiroshi Fujikawa, Diffusion-limited growth in bacterial colony formation, 498-506, 1990, com permissão da Elsevier.
A interacção entre as células e o nutriente pode ser quantificada amplamente comparando a taxa relativa de propagação destas duas quantidades. O crescimento da colónia é medido pelo cálculo da taxa média de variação na área da colónia Δ m quando visto de cima, que tem as mesmas unidades que uma difusividade. Esta quantidade é calculada facilmente a partir de uma imagem experimental ou de dados simulados, tais como os produzidos pelo modelo discreto. A difusão do nutriente Δ n é considerada como a difusividade da glicose, uma vez que esta é comumente usada como fonte de nutrientes e há pouca diferença entre a difusividade de diferentes nutrientes. A difusividade da glicose na água é conhecida por ser aproximadamente \({D}_{0}=4.03\ vezes {10}^{-2})mm2 min-1, baseado em observações experimentais36. Para glicose em um gel de ágar de baixa densidade, a difusividade é dada por
onde w é a porcentagem por peso de ágar37. Assumindo w = 0,3%, a difusividade é de 4,01×10-2 mm2 min-2, que é o valor utilizado para o restante deste estudo. A difusividade muda pouco com a quantidade de ágar, e portanto w tem um impacto insignificante nos resultados. A partir destas quantidades calculamos a razão
o que proporciona uma medida sem dimensão das taxas relativas de diferencial. Em pequenos valores de Δ, os nutrientes difundem-se numa escala temporal mais rápida do que o crescimento celular, o que significa que quaisquer variações locais na concentração de nutrientes se dissiparão sem influenciar a morfologia da colónia. Um valor de Δ igual ou superior a 1 indica que o crescimento celular está a ocorrer a uma taxa pelo menos tão grande quanto a difusão do nutriente, e variações locais na concentração de nutrientes podem ter um impacto na morfologia da colónia. Das três imagens experimentais, apenas a imagem de crescimento dirigido tem informação suficiente, tanto na escala como no tempo necessário para calcular Δ. A partir desta imagem encontramos que Δ ≈ 0.23. A configuração s = 3 e c0 = 1 no modelo produz soluções com valores de Δ entre 0,3 e 0,5, que é da mesma ordem de grandeza dos resultados experimentais e, portanto, fornece uma comparação adequada. Estes valores de parâmetros são utilizados para o restante desta subsecção. O comportamento em cada um dos três casos é ainda quantificado utilizando índices espaciais, descritos abaixo, semelhantes à abordagem de Binder et al.38. Cada simulação usa uma malha com dimensões L x = L y = 200, que é suficientemente grande para produzir características com resolução suficiente e ainda sendo computacionalmente eficiente.
Para examinar o rastreamento de ramos (fenômeno I), o nutriente é semeado uniformemente ao acaso através do domínio e uma única célula é colocada no centro da malha. A simulação é executada até que a densidade celular total atinja 0,2, ilustrada pela colônia representativa mostrada na Fig. 2. Esta colónia apresenta grandes ramos que emanam do local da célula central inicial, com ramos mais curtos no meio que foram rastreados a partir do nutriente pelos ramos maiores, e apresenta um crescimento significativo não-uniforme. Isto corresponde ao comportamento observado por Matsushita & Fujikawa12. A morfologia pode ser quantificada pela primeira contagem dos ângulos para cada célula medida no sentido anti-horário a partir de algum ângulo de referência com a origem colocada no centro da massa. As contagens são escalonadas pelos valores esperados para células distribuídas uniformemente ao acaso, e o índice angular de crescimento não-uniforme I θ é definido como sendo o desvio padrão das contagens escalonadas, de modo que valores maiores de I θ indicam maiores níveis de crescimento não-uniforme. A imagem experimental tem índice 0,18, enquanto a simulação tem índice 0,2, indicando que os dois estão em estreita concordância.
Para o caso de colônias repelentes (fenômeno II), o nutriente é novamente colocado uniformemente ao acaso em todo o domínio. Duas células-semente são colocadas verticalmente centradas dentro do domínio, cada uma a um oitavo da largura do domínio, longe do centro horizontalmente, de modo que as células sejam separadas por um quarto da largura total do domínio. A simulação é calculada até que a densidade total de células atinja 0,2. Uma simulação típica é mostrada na Fig. 2, que mostra a distância entre as duas colônias observadas por Matsushita & Fujikawa12. As colônias repelentes podem ser quantificadas contando o número total de células ν e o número de células ν c entre as duas células-semente no final da simulação. O índice de repulsão é então definido como I c = 1 – ν c /ν, que é próximo de 0,5 quando as duas colônias crescem uniformemente, menor que 0,5 quando uma fenda se forma, e maior que 0,5 quando as colônias mostram uma preferência de crescimento uma em relação à outra. A localização das células-semente para cada colónia na imagem experimental é aproximada desenhando linhas ao longo dos ramos e identificando onde estes se cruzam. A imagem experimental e a simulação têm índices 0,19 e 0,27, respectivamente, o que sugere que ambas estão a produzir padrões de crescimento semelhantes com um intervalo significativo entre as duas colónias.
Crescimento direccionado (fenómeno III) é simulado colocando inicialmente todo o nutriente na coluna mais à direita do domínio, com uma única célula colocada no centro do domínio. A simulação é então calculada até que a densidade celular atinja 0,1. Uma colônia típica é mostrada na Fig. 2, que se assemelha muito ao resultado experimental de Matsushita & Fujikawa12. Para medir o viés para um lado do domínio calculamos a proporção I b de células do lado direito do domínio em relação ao número total de células, de modo que I b ∈ . Valores do índice I b próximos a 0,5 indicam pouco viés, enquanto I b < 0,5 indica viés para o lado direito e I b < 0,5 indica viés para o lado esquerdo. A imagem experimental tem índice 0,92, que coincide de perto com o índice de simulação de 0,93. Em ambos os casos os índices indicam um grande viés de crescimento em direção à localização inicial dos nutrientes.
Como encontrado por Ginovart et al.30, as boas correspondências qualitativas entre as imagens experimentais e as simulações mostram que o DLG sozinho pode produzir a triagem, repulsão e crescimento dirigido das colônias de B. subtilis. Reforçamos ainda mais esta comparação através do uso de uma comparação quantitativa entre os experimentos e um modelo matemático. Assim, esperamos que esses fenômenos estejam presentes quando a DLG está influenciando a morfologia, enquanto a ausência dessas características sugere que outros mecanismos são responsáveis pelo padrão de crescimento. A concordância entre o modelo discreto e o modelo proposto por Ginovart et al. demonstra que o modelo discreto aqui empregado fornece uma representação satisfatória da DLG e, portanto, pode ser utilizado para quantificar este comportamento.
Induzindo DLG
Apesar de mostrar que o modelo discreto é capaz de replicar o comportamento DLG, quantificamos aqui a dependência destes fenômenos dos parâmetros do modelo de modo a prever quando os efeitos da DLG irão surgir. As colónias são novamente simuladas numa grelha com dimensões L x = L y = 200 usando as mesmas três condições iniciais e critérios de paragem que na subsecção anterior. As simulações são repetidas 50 vezes para cada par de passos de nutrientes s = 1, 5, …, 37 e concentrações iniciais c0 = 1, 2, …, 7. Para cada par de parâmetros calculamos o índice médio relevante sobre as 50 realizações.
Para examinar o rastreio de ramos (fenómeno I), consideramos colónias cultivadas a partir de uma única célula num campo uniforme de nutrientes, com os valores correspondentes aos valores médios do índice {\bar{I}_{\theta }) sobre as 50 realizações mostradas na Fig. 3. Os maiores valores de s e c0 surgem quando ambos são pequenos, o que se deve a dois factores. Primeiro, porque a difusividade de nutrientes, efetivamente s, é pequena em relação à taxa de crescimento celular, as flutuações nos níveis de nutrientes se desenvolvem em todo o domínio. Em segundo lugar, a baixa concentração inicial de nutrientes c0 significa que estas flutuações criam regiões em que o nível de nutrientes é demasiado baixo para suportar o crescimento celular. Quando s ou c0 é maior, pelo menos uma destas condições não pode ocorrer e o valor de {\bar{I}_theta }) torna-se menor, indicando que o DLG já não tem uma influência significativa sobre a colónia. Assim, estes resultados indicam que padrões não uniformes só podem ocorrer quando tanto a difusividade de nutrientes, em relação à taxa de crescimento celular, como a concentração de nutrientes são pequenas.
Medidas dos efeitos da DLG em colónias microbianas simuladas. Todas as simulações são computadas usando o modelo baseado em malha usando uma gama de passos de nutrientes s e concentrações iniciais de nutrientes c0. Mostrados são (a) o índice médio para o rastreio de ramos (fenómeno I), (b) o índice médio para o repelir colónias (fenómeno II), e (c) o índice médio para o crescimento dirigido (fenómeno III).
Observa-se um comportamento semelhante para o caso repelente (fenômeno II), como visto a partir do índice médio traçado na Fig. 3. Os maiores valores do índice são encontrados em pequenos valores de s e c0, o que ocorre pelas mesmas razões que para {\bar{I}_{teta }).
O comportamento para o crescimento dirigido (fenômeno III) é diferente, como visto a partir do índice médio {\bar{I}_{b}) mostrado na Fig. 3. Em valores pequenos de s, o índice {\i}_{b}_{b}} é grande e varia pouco com c0. À medida que aumenta, o s diminui e mostra maior dependência do c0, com valores maiores de c0. O intervalo de valores dos parâmetros sobre os quais pode ser observado o crescimento dirigido é muito maior do que para os outros dois fenômenos DLG. Portanto, se o crescimento direcionado não ocorrer, as outras duas características também não ocorrerão, e assim o crescimento direcionado fornece uma primeira verificação útil para DLG que é simples de medir. Esta característica será usada para testar para DLG durante o restante deste trabalho.
Modelo de vácuo
O surgimento dos fenômenos DLG depende tanto da concentração de nutrientes quanto das difusividades das duas espécies. Enquanto os índices medem a dependência destes fenômenos do número de etapas discretas de nutrientes e concentração inicial de nutrientes c0, o valor de Δ só poderia ser calculado a partir dos dados simulados, em vez de ser especificado como entrada para o modelo. Ao considerar os dados experimentais, no entanto, é natural caracterizar a dispersão relativa das células e nutrientes usando Δ, uma vez que isto pode ser medido prontamente a partir de imagens experimentais. Introduzimos aqui um sistema determinístico de equações de reação-difusão que modelam a densidade celular e a concentração de nutrientes e permitem a especificação das difusividades relativas de cada quantidade, o que equivale a definir Δ. Embora este modelo não seja adequado para capturar as características finas observadas na Fig. 2, é capaz de replicar o crescimento dirigido para uma fonte de nutrientes (fenômeno III), que se constatou surgir sobre a maior gama de parâmetros. Focamos, portanto, neste aspecto da DLG, que atua como um sinal facilmente mensurável de que a DLG está ocorrendo.
Consideramos um domínio unidimensional, que é suficiente para ilustrar o comportamento geral do modelo29,32,39. Usando a posição sem dimensão x, tempo t, densidade celular n(x,t) e concentração de nutrientes g(x, t), descrita na seção 3, as equações governantes reduzem para
O parâmetro D = D m /D n é a razão entre a difusividade celular D m e a do nutriente D n . Isto é semelhante à definição de Δ (2), usando a difusividade celular no lugar da taxa de variação medida na área da colónia. O primeiro termo do lado direito de ambas as equações representa a contribuição da difusão, enquanto o segundo representa o consumo de nutrientes e o crescimento de novas células, respectivamente, com c a quantidade sem dimensão de nutrientes consumidos por nova célula.
Como condições iniciais, as células são colocadas no centro do domínio com o nutriente enviesado para a direita de acordo com
onde N pode ser interpretado como uma concentração de nutrientes sem dimensão. Para ilustrar o comportamento geral, as condições iniciais para N = 1 são mostradas na Fig. 4.
Resultados do modelo unidimensional de reacção-difusão. (a) A condição inicial para N = 1 mostra as células concentradas no centro do domínio com o nutriente para a direita. (b) Os valores máximos de I b até o tempo t = 1, plotados contra o logaritmo base 10 de D e N, sugerem que o DLG só ocorre em valores de parâmetros particulares. Dois exemplos representativos são mostrados marcados. (c) No maior valor de I b quando D = 10-6 e N = 1, as células ainda são quase simétricas em torno de x = 0, enquanto a concentração de nutrientes se tornou efetivamente uniforme. (d) Usando D = 10-0,5 e N = 105 resulta em um viés significativo para o lado direito, onde o nutriente foi inicialmente concentrado.
Tomando os valores típicos dos parâmetros dados na seção 3 como fixos, o valor de N só varia devido à concentração física de nutrientes. Considerando um meio contendo apenas nutrientes, representando uma concentração máxima, verificamos que o valor de N não pode ser maior do que aproximadamente 105. As soluções são assim computadas para 1 ≤ N ≤ 105. Enquanto observações experimentais típicas sugerem que 10-3 ≤ D ≤10-1, consideramos valores para 10-6 ≤ D ≤103 de forma a fornecer um exame teórico de como o comportamento muda com D. Para diferentes valores destes parâmetros, calculamos o valor máximo de I b observado até ao tempo t = 1. Isto corresponde a aproximadamente 119 dias de crescimento, o que, embora maior que o tempo experimental típico, garante que o valor máximo de I b é observado durante a simulação. Os índices computados I b são plotados na Fig. 4 usando uma escala logarítmica na base 10 para ambos os eixos. Para log(N) < 1, há pouco ou nenhum viés no crescimento das células, como medido por I b . Em valores maiores de N, a quantidade de viés observada depende do valor de D, com o máximo ocorrendo próximo a (D,N) = (1, 105). Este valor de D corresponde a difusividades celulares e nutricionais de igual magnitude e em torno deste valor é possível observar viés no crescimento para valores de N tão pequenos quanto 101,5. Sob condições experimentais típicas, N tem ordem de magnitude 2, o que indica que os efeitos DLG são mais prováveis de serem observados quando D está próximo da unidade.
A gama de comportamento é ainda ilustrada considerando as distribuições de dois exemplos contrastantes. Em cada caso, a solução é mostrada no momento correspondente ao viés máximo de células. Para D = 10-6 e N = 1, mostrado na Fig. 4, a concentração de nutrientes se tornou efetivamente uniforme antes que a densidade celular possa desenvolver qualquer viés óbvio para o lado direito, onde o nutriente foi inicialmente concentrado. Em contraste, tomando D = 10-0,5 e N = 105, também plotado na Fig. 4, as células mostram uma preferência óbvia para o lado direito do domínio.
A análise do modelo contínuo sugere que, se \(D\ll 1\), então o crescimento direcionado, e portanto qualquer efeito DLG, só ocorrerá em valores de N pelo menos tão grande quanto 103. Como as estimativas indicam que N tem ordem de magnitude 2, isto sugere que a DLG só será observada quando D estiver próximo da unidade, como evidenciado na Fig. 4. Isto também pode ser ilustrado usando parâmetros físicos. Usando os valores dos parâmetros dados na seção 3, micróbios com difusividade \({D}_{m}=3\ vezes {10}^{-2}\)mm2 min-1 colocados em um ambiente com concentração máxima inicial de nutrientes \({N}_{0}\mathrm{=3,8}\ vezes {10}^{-3}\ g mm-2 corresponderiam aproximadamente aos valores sem dimensão D = 0,75 e N = 104. A partir da Fig. 4, seria de esperar que esta espécie crescesse para uma fonte de nutrientes e, portanto, exibisse comportamento DLG. Se os mesmos micróbios fossem colocados em um ambiente com concentração máxima de nutrientes \(N}_{0}{0}\mathrm{=3,8}{10}^{-6})g mm-2, o valor de N cairia para 10 e o crescimento tendencioso não seria mais observado. Os resultados desta secção fornecem assim uma estrutura para identificar quando se espera que a DLG ocorra com base apenas em estimativas de D e N.
Comparações experimentais
A partir do exame das previsões do modelo, utilizamos agora estas para identificar o mecanismo de crescimento dominante nas colónias microbianas. Consideramos os três exemplos experimentais representativos mostrados na Fig. 1: duas colónias da bactéria B. subtilis e uma colónia de S. cerevisiae. Como não sabemos o valor apropriado da razão de difusão D, que é requerida pelo modelo de reação-difusão, o crescimento é, ao invés disso, caracterizado pela difusão relativa Δ (2). Este parâmetro representa a razão entre a taxa média de variação da área da colónia, quando vista de cima, e a difusividade da glicose e pode ser medida a partir das imagens. Como o nutriente está uniformemente distribuído e apenas uma única colónia é cultivada, qualquer DLG nestes exemplos deve manifestar-se como crescimento irregular com rastreio de ramos (fenómeno I).
Os valores calculados das taxas de crescimento Δ m são dados na Tabela 1, juntamente com as taxas relativas correspondentes Δ. Estes valores indicam que as colónias de B. subtilis crescem duas ordens de magnitude mais rapidamente do que a colónia de levedura e uma ordem de magnitude mais lentamente do que a difusividade da glucose. O uso de valores típicos para a concentração inicial de nutrientes sugere que as experiências correspondem a um valor de N que tem ordem de magnitude 2. Correspondendo esta estimativa e os valores de Δ aos resultados do modelo da Fig. 4 indica que B. subtilis corresponde a um regime em que ocorrerá um crescimento direccionado devido à DLG. Como esta estimativa foi feita medindo a taxa de proliferação celular p dentro de uma colônia de S. cerevisiae, que provavelmente será menor do que o valor correspondente para bactérias, espera-se que seja uma subestimação para N e um valor maior de N aumenta a probabilidade de observação de DLG. Em contraste, a colónia de S. cerevisiae tem um Δ com ordem de magnitude -3, o que indica que o nutriente se difunde numa escala temporal muito mais rápida do que a do crescimento celular. Como consequência, qualquer variação local na concentração de nutrientes é esperada que se dissipe antes de ter influência na morfologia da colónia. Isto indica que a morfologia não é influenciada pela DLG. Assim, apesar da forte semelhança entre as formas das colónias de bactérias e leveduras em ambientes de baixo teor de nutrientes, estas duas morfologias são devidas a fenómenos diferentes. As colónias bacterianas crescem numa escala temporal suficientemente rápida para que a difusão de nutrientes possa limitar o crescimento, resultando num padrão irregular. O crescimento muito mais lento das colónias de leveduras significa que a DLG não pode ocorrer e, em vez disso, as morfologias não uniformes das colónias que surgem em ambientes com baixo teor de nutrientes devem ser devidas apenas ao crescimento pseudo-hifálico.
Procurámos mais confirmação destes resultados através de testes de crescimento dirigido (fenómeno III) em colónias de S. cerevisiae, imitando a configuração utilizada por Matsushita & Fujikawa12 e nas simulações40. Uma placa de petri foi preenchida com dextrose sintética de baixoamônio (SLAD) com nutriente colocado no centro da placa de petri. As células de levedura foram semeadas a diferentes distâncias do centro e fotografadas após 16 dias de crescimento. Mais detalhes experimentais são apresentados na secção 3. Tanto a glicose quanto o sulfato de amônio foram usados como nutriente limitado, com imagens representativas para cada um deles mostradas na Fig. 5. As imagens são orientadas para que o centro da placa de petri, onde o nutriente foi colocado, esteja do lado direito. A difusividade do amônio na água é de aproximadamente 9,84×10-2 mm2 min-1 41. Como isto é da mesma ordem de magnitude que a difusividade da glucose, espera-se que cada fonte de nutriente resulte num valor semelhante a Δ. Nenhuma das colónias apresenta um enviesamento notável no crescimento em qualquer direcção, e ambas produzem índices de enviesamento I b quase exactamente iguais a 0,5. As difusividades efectivas Δ m e as difusividades sem dimensão Δ para cada ensaio são dadas na Tabela 2. Em ambos os casos Δ tem ordem de magnitude -3, o que indica que o crescimento dirigido não deve ser observado e concorda com os resultados dos experimentos anteriores.
Imagens dos experimentos de crescimento dirigido usando S. cerevisiae. As imagens são orientadas para que o nutriente correspondente esteja no lado direito da colónia, como indicado pelo texto vertical. As colónias foram cultivadas em (a) SLAD-G com glucose adicionada à direita e (b) SLAD-N com sulfato de amónio adicionado à direita. As barras de escala representam 5 mm.
Outras evidências do modo de crescimento são fornecidas pelo comportamento próximo à borda das colônias. Há sinais claros de crescimento não uniforme em torno do limite da colónia cultivada em SLAD-N mas não na colónia cultivada em SLAD-G. Se este padrão fosse devido à DLG, esperaríamos um comportamento semelhante em ambos os meios. Sabe-se, entretanto, que leveduras diplóides, como a cepa AWRI796 usada neste experimento, mudam para crescimento pseudo-hifálico quando privadas de nitrogênio2, como o SLAD-N. Isto sugere que o crescimento não-uniforme observado nas colônias de leveduras, como mostrado na Fig. 1, é devido ao crescimento pseudo-hifálico e não DLG.