Abstract

Background. A detecção precoce de bacteremia Gram-positiva e a terapia antimicrobiana oportuna e adequada são necessárias para diminuir a mortalidade dos pacientes. O objetivo do nosso estudo foi avaliar o desempenho do ensaio de hemocultura Gram-positiva Verigene (BC-GP) em dois ambientes especiais de saúde e determinar o impacto potencial do teste de hemocultura rápida para bacteremia Gram-positiva dentro do sistema de saúde japonês. Além disso, o estudo incluiu hemoculturas simuladas, que incluíram uma biblioteca de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) e enterococos resistentes à vancomicina (VRE) isolados, refletindo diferentes regiões geográficas do Japão. Métodos. Foi realizado um total de 347 ensaios BC-GP em hemoculturas clínicas e simuladas. Os resultados de BC-GP foram comparados com os resultados obtidos por métodos de referência para identificação do gênero/espécie e detecção de genes de resistência usando metodologias moleculares e MALDI-TOF MS. Resultados. Para identificação e detecção de genes de resistência em dois locais clínicos e hemoculturas simuladas, a concordância geral de BC-GP com métodos de referência foi de 327/347 (94%). O tempo para identificação e detecção de resistência antimicrobiana por BC-GP foi significativamente menor em comparação com testes de rotina, especialmente no hospital de cardiologia, que não oferece serviços de microbiologia clínica nos fins de semana e feriados. Conclusão. O BC-GP gerou identificação e detecção precisa de marcadores de resistência em comparação com métodos laboratoriais de rotina para organismos Gram-positivos em ambientes clínicos especializados, fornecendo resultados mais rápidos do que os testes de rotina atuais.

1. Introdução

As bactérias Gram-positivas são os microrganismos mais predominantes associados à sepse em ambientes clínicos e a causa mais prevalente de bacteremia em pacientes com transplante de células-tronco hematopoiéticas . A bacteremia enterocócica está associada ao aumento do risco de mortalidade em pacientes com transplante de células estaminais hematopoiéticas, independentemente da susceptibilidade à vancomicina . Em unidades de cardiologia, endocardite infecciosa, aneurisma infeccioso, infecções da corrente sanguínea relacionadas com cateteres ou infecções do local cirúrgico após cirurgias cardíacas são as principais infecções das quais os microrganismos causadores mais comuns são os cocos Gram-positivos . Em ambas as unidades médicas, a detecção precoce de Gram-positivos e marcadores resistentes é muito crítica no tratamento dos pacientes, na administração de antibióticos e na prevenção da propagação de microrganismos resistentes.

Uma intervenção precoce com terapia antimicrobiana está associada à melhoria do prognóstico com cada hora de atraso associada ao aumento da mortalidade, o diagnóstico rápido é crítico . O ensaio de hemocultura Gram-positiva Verigene (BC-GP) (Nanosphere, Inc., Northbrook, IL) é uma amostra para resultar num sistema de microarranjo para identificação de bactérias Gram-positivas comuns e grandes marcadores de resistência directamente da hemocultura positiva. Embora vários estudos tenham avaliado previamente o desempenho de relatórios de BC-GP variando de 92 a 99% de concordância com a metodologia convencional , uma limitação dos relatórios anteriores foi que muitos dos estudos foram dos Estados Unidos, bem como de países fora do Japão com apenas um relatório publicado de escopo limitado no Japão .

A variação genética entre linhagens bacterianas que circulam em diferentes regiões geográficas do mundo pode afetar a sensibilidade dos ensaios moleculares baseados em sondas de oligonucleotídeos para detectar organismos ou marcadores de resistência. Estudos em Hong Kong e na Bélgica relataram um menor desempenho do BC-GP .

O objetivo deste estudo foi determinar o impacto potencial no gerenciamento de pacientes e resultados de BC-GP em ambientes especializados hospitalizados dentro do ambiente de saúde japonês, que enfrenta uma série de desafios. Uma população cada vez mais envelhecida e o fardo decorrente do aumento dos custos globais da saúde têm desafiado a infra-estrutura da saúde. Apesar do Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) ser responsável por mais de 90% das infecções adquiridas no hospital causadas por bactérias resistentes no Japão, a terceirização de testes microbiológicos clínicos ou a ausência de cobertura nos finais de semana é comum em muitas instalações de saúde como parte da contenção de custos. Este documento representa a primeira avaliação abrangente da BC-GP no Japão para validar o seu desempenho clínico. O estudo de hemocultura simulada inclui uma biblioteca de cepas de MRSA (HA-MRSA) bem caracterizadas, MRSA adquirido na comunidade (CA-MRSA) e enterococos resistentes à vancomicina (VRE) em circulação no Japão.

2. Métodos

BC-GP foi avaliado no Hospital Toranomon (TH) e no Sakakibara Heart Institute (SHI), de acordo com os protocolos de estudo aprovados pelo conselho de revisão institucional do local, durante 26 de junho de 2012 a 6 de março de 2013. O TH é um hospital universitário de 1168 leitos com uma unidade de cuidados hematológicos de 123 leitos para transplante de células estaminais hematopoiéticas, realizando 140 a 160 transplantes de células estaminais hematopoiéticas por ano. O laboratório de microbiologia do hospital funciona diariamente durante as horas do dia. O SHI é um hospital-escola com 320 leitos, especializado em doenças cardiovasculares, com uma carga de mais de 1.500 cirurgias de coração aberto por ano. O laboratório de microbiologia do hospital é operado por um laboratório externo de referência comercial. O laboratório de microbiologia funciona durante o dia nos dias úteis e fecha aos fins-de-semana e feriados.

Culturas de sangue foram realizadas no SHI utilizando frascos BacT/ALERT FA e monitorização com BacT/ALERT 3D (bioMérieux, Marcy l’Etoile, França). TH usou frascos BACTEC Plus e monitorização com BACTEC 9240 e FX (Becton Dickinson, Franklin Lakes, e NJ). Apenas uma garrafa de hemocultura positiva contendo cocos ou bacilos Gram-positivos por paciente foi incluída no estudo. Dois ml de meio de cultura de sangue positivo foram armazenados a -85C para os testes de repetição.

Identificação microbiológica de rotina e testes de susceptibilidade dos isolados foram efectuados utilizando testes de identificação convencionais como a solubilidade da bílis, a susceptibilidade do disco de optochina e o sistema MicroScan WalkAway (Beckman Coulter, Pasadena, CA) em TH e o sistema Vitek 2 (bioMérieux, Marcy l’Etoile, França) em SHI. O rastreio da Cefoxitina para a resistência à meticilina foi realizado de acordo com as directrizes CLSI. Foi também utilizado um teste de aglutinação em látex para a detecção da proteína PBP2a de ligação à penicilina .

BC-GP em hemocultura positiva mostrando organismos Gram-positivos de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, uma amostra bem misturada de 350 μl do meio de hemocultura foi pipetada para o poço da amostra da bandeja de extração do núcleo BC-GP, colocada no Processador Verigene SP para processamento e análise pelo Verigene Reader.

Foi realizada uma avaliação para determinar a diferença de tempo entre o relato dos resultados usando BC-GP e a identificação baseada em cultura e os resultados de susceptibilidade antimicrobiana para 139 caldos positivos de hemocultura. Para resultados baseados em cultura, o tempo necessário até a geração do relatório final foi o tempo entre a leitura da coloração de Gram e a entrada dos resultados finais de identificação e suscetibilidade no sistema de informação laboratorial. Para BC-GP, o tempo até o resultado foi o tempo entre a leitura da coloração de Gram e a entrada dos resultados de BC-GP no sistema de informação laboratorial.

Um conjunto de 208 culturas de sangue simuladas foi construído usando o tipo, cepas de referência e cepas clínicas de diferentes regiões geográficas do Japão para avaliar a BC-GP. As cepas clínicas incluíram organismos que apresentaram desafios para os sistemas de identificação comercial em estudos clínicos anteriores no TH e SHI. Além disso, também foi testada uma biblioteca de cepas bem caracterizadas de HA-MRSA, CA-MRSA, e VRE do Japão. Foram realizados estudos simulados de hemocultura no Laboratório Médico Miroku (Cidade de Saku, Prefeitura de Nagano, Japão). Duzentas e oito cepas foram ajustadas a uma turbidez de aproximadamente 100 UFC/ml em soro fisiológico estéril. Trezentas μl foram inoculadas em frascos BACTEC Plus Aerobic/F contendo 8 a 10 ml de sangue total humano (tipo de sangue O, Tennessee Blood Services, Memphis, TN) para um inóculo final de 30 UFC/garrafa. Um frasco BACTEC Plus Anaeróbio/F também foi inoculado para S. pneumoniae e para o grupo S. anginosus. Cada frasco foi incubado no sistema BACTEC até que um sinal positivo fosse gerado. Se a BC-GP gerasse resultados negativos, a diluição de 11 vezes do meio de hemocultura utilizando água destilada estéril era testada novamente.

Cada um dos isolados positivos de hemocultura nos dois locais hospitalares era armazenado em leite desnatado 10% (Difco) a -85C. A identificação das espécies foi confirmada com o uso do laser de ionização por dessorção de matriz de espectrometria de massa de vôo (MALDI-TOF MS) (Microflex LT com Biotyper ver. 3.0 software; Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemanha) para todas as cepas . Se o organismo não foi identificado ao nível da espécie por MALDI-TOF MS (valor de pontuação < 2.0) ou identificado como Micrococcus, Listeria, Staphylococcus que não S. aureus, Streptococcus que não S. pyogenes, e S. agalactiae, os testes de confirmação por PCR-sequenciamento direto de 16S rDNA ou sodA foram realizados na Universidade de Juntendo ou na Universidade Médica Feminina de Tóquio. Foi realizada a PCR específica para detecção de mecA em todos os estafilococos e vanA, vanB em todos os enterococos . Os métodos utilizados para a tipagem SCCmec de MRSA adquirido na comunidade ou associado aos cuidados de saúde utilizados para caracterizar as cepas foram previamente descritos .

Concordância foi determinada em comparação com os resultados dos métodos de referência. Houve concordância se a detecção do alvo BC-GP concordou com o método de referência, tanto no nível do gênero quanto no nível da espécie. Os intervalos de confiança de noventa e cinco por cento (95% CI) e o teste pareado foram determinados usando GraphPad StatMate (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

3. Resultados

Neste estudo, a concordância geral de identificação entre BC-GP e o método de referência foi 327/347 (94%) para hemoculturas prospectivas em dois locais clínicos e hemoculturas simuladas. A concordância combinada entre PCR e BC-GP para detecção de mecA foi 71/73 (97%) para hemoculturas prospectivas e hemoculturas simuladas.

A precisão de identificação combinada de ambos os locais hospitalares foi 129/139 (93%). Para culturas monomicrobianas, a precisão de identificação foi de 121/124 (98%). A concordância entre PCR e BC-GP para a positividade mecA foi de 51/53 (96%). A Tabela 1 mostra os resultados da TH. No geral, 96/104 (92%) organismos foram corretamente identificados pela BC-GP para a espécie ou gênero, incluindo a detecção de genes de resistência. Como mostrado na Tabela 2, a concordância total da BC-GP com o método de referência no SHI foi de 33/35 (94%) organismos.

BC-GP relata a presença de mecA apenas para S. aureus e S. epidermidis. Neste estudo, das 102 cepas estafilocócicas, 72 eram S. aureus ou S. epidermidis. Resultados discordantes foram devidos a organismos indetectáveis mecA S. epidermidis em culturas polimicrobianas contendo tanto mecA positivo como mecA negativo S. epidermidis. Dos 30 Staphylococcus spp., exceto S. epidermidis e S. aureus, 21 (70%) foram positivos para mecA, incluindo 2 S. lugdunensis, que não puderam ser relatados como mecA positivos por BC-GP.

Tabela 3 mostra a diferença de tempo entre a geração de resultados de BC-GP e a identificação final baseada em cultura e resultados de suscetibilidade antimicrobiana em ambos os hospitais. Os resultados de BC-GP estavam disponíveis em uma média de 28,2 a 51,0 horas antes da identificação final baseada em cultura e resultados de suscetibilidade a TH. No SHI, a BC-GP gerou resultados com uma média de 34,5 a 196,6 horas de antecedência. Ao comparar o tempo com os resultados finais de identificação e suscetibilidade baseados em cultura na TH e SHI, com exceção de S. aureus, os resultados para S. epidermidis e estafilococos coagulase negativos que não S. epidermidis, enterococos e estreptococos necessitaram de tempo significativamente () mais longo na SHI (83,3, 123,6, 159,1 e 199,1 horas, resp.) em comparação com TH (40,8, 53,9, 36,1 e 53,5 horas, resp.).

Usando hemoculturas Gram-positivas simuladas, BC-GP correctamente identificadas 198/208 (95%) dos organismos (Tabela 4). Seis estreptococos (3%) foram identificados incorretamente ou identificados ao nível do gênero apenas por BC-GP. Com respeito aos 4 frascos de cultura de sangue BC-GP falso negativo, 1 S. pyogenes foi correctamente identificado e 1 S. mitis gerou um sinal positivo de Streptococcus genus/S. pneumoniae após uma diluição de 11 vezes do meio de cultura de sangue. O gene mecA foi detectado em 20/20 (100%) organismos MRSA representando estirpes adquiridas na comunidade (SCCmec tipo IIa, IV, e V) e associadas aos cuidados de saúde (SCCmec tipo I, IIb, III, e não tipáveis) por BC-GP. BC-GP detectou 14/14 (100%) genes vanA e 20/20 (100%) vanB em cepas VRE bem caracterizadas de estudos anteriores no Japão.

4. Discussão

O desempenho da BC-GP observado no nosso estudo foi semelhante aos relatórios anteriores . Como os serviços de microbiologia clínica são terceirizados ou não funcionam durante os dias de folga e fecham nos fins de semana e feriados em muitos hospitais no Japão, os testes de diagnóstico rápido têm um potencial significativo de impacto no cuidado ao paciente, diminuindo drasticamente o tempo de identificação do organismo e os resultados de suscetibilidade antimicrobiana.

BC-GP detecta mecA em todos os estafilococos com base na medição da intensidade do sinal; contudo, o relato é restrito a S. aureus e S. epidermidis com base num algoritmo no qual o mecA só é relatado quando S. aureus ou S. epidermidis é detectado por BC-GP. Versões futuras do BC-GP devem considerar a modificação do algoritmo para permitir o relato da detecção de mecA para estafilococos que não S. aureus ou S. epidermidis, pois 70% das 30 cepas não-S. aureus e S. epidermidis em nosso estudo eram resistentes à meticilina. Embora S. epidermidis seja o principal patógeno estafilocócico coagulósico negativo, outros estafilococos como S. lugdunensis e S. haemolyticus são patógenos importantes no ambiente de saúde .

Culturas de sangue positivas polimicrobianas geraram a maior parte da discórdia. Em contraste, o desempenho da BC-GP foi 121/124 (98%) em hemoculturas clínicas monomicrobianas e 198/208 (95%) em hemoculturas simuladas. Neste estudo, as hemoculturas polimicrobianas foram responsáveis por 14/106 (13%) e 3/33 (9%), respectivamente, das hemoculturas positivas em TH e SH. Combinadas, as hemoculturas polimicrobianas representaram 17/139 (12%) das hemoculturas clínicas prospectivas, o que é consistente com estudos anteriores que relataram 6 a 20% de todas as infecções da corrente sanguínea como sendo polimicrobianas. BC-GP identificou correctamente todos os organismos em 12/17 (70%) das culturas polimicrobianas. Em estudos BC-GP anteriores, as taxas de identificação correta em culturas polimicrobianas variavam de 57 a 86% . Como informações enganosas podem afetar o diagnóstico clínico, resultando na seleção inadequada de agentes antimicrobianos, há necessidade de entender as limitações da BC-GP.

Uma preocupação adicional com culturas polimicrobianas é a interpretação clínica da detecção mecA e da detecção estafilocócica. Em nossas 17 culturas polimicrobianas, 5 amostras produziram 2 ou 3 cepas estafilocócicas com ou sem mecA. Isto pode levar ao uso desnecessário de vancomicina ou subestimar a infecção causada por estafilococos resistentes à meticilina. A repetição de BC-GP em outro conjunto de culturas de sangue pode diminuir o risco deste problema. Para culturas monomicrobianas ou culturas simuladas, todas as discrepâncias foram observadas com estreptococos, exceto para a cepa de 1 S. caprae. BC-GP misidentificação para estreptococos incluiu 2 S. mitis identificados como S. pneumoniae, nenhuma detecção de 2 S. pneumoniae, 2 S. anginosus group, e 2 S. pyogenes. Relatórios anteriores também relataram resultados similares para S. mitis, S. oralis e S. pneumoniae . Como a relação genética entre S. mitis, S. oralis e S. pneumoniae é bem conhecida com base na homologia >99% das sequências do gene 16S rRNA , os resultados do BC-GP para S. pneumoniae ou Streptococcus com alfa-hemólise sem nenhum sinal positivo específico da espécie devem ser cuidadosamente interpretados e confirmados por métodos convencionais como a sensibilidade à optoquina ou o teste de solubilidade biliar. Curiosamente, uma diluição de 11 vezes do meio de cultura de sangue original pode levar à detecção do sinal do Streptococcus e do sinal da espécie (Tabela 4). Foi relatado um intervalo de detecção dependente do organismo pela BC-GP .

O principal benefício da utilização da BC-GP é o tempo mais cedo para relatar a identificação e os determinantes de resistência de hemoculturas positivas permitindo uma selecção mais cedo da terapia antimicrobiana apropriada e a implementação de medidas de controlo de infecções, tais como isolamento e precaução de contacto . Isto tem o potencial de ter um impacto significativo no sistema japonês de prestação de cuidados de saúde. A diferença de tempo entre os resultados da BC-GP e os resultados finais de identificação e suscetibilidade baseados na cultura apresentados na Tabela 3 da TH é consistente com os relatórios anteriores . Por outro lado, resultados anteriores de 80,7 a 196,6 horas para organismos que não S. aureus usando BC-GP na SHI refletem a indisponibilidade de serviços de microbiologia clínica durante os fins de semana e feriados. Como os serviços de microbiologia clínica são terceirizados em muitos hospitais no Japão ou limitados a um turno durante os dias de semana ou não oferecidos durante os fins de semana, os custos potenciais de retenção dos serviços de hemocultura nos hospitais são significativos. Além disso, o treinamento do pessoal de laboratório no laboratório geral para reconhecer cocos Gram-positivos e bacilos permitirá o teste BC-GP durante o fim de semana, bem como à noite/noite. O BC-GP oferece a oportunidade para os hospitais manterem internamente um serviço laboratorial muito crítico.

Em conclusão, o BC-GP forneceu identificação precisa e detecção de marcadores de resistência em comparação com métodos laboratoriais de rotina baseados em cultura para organismos Gram-positivos, incluindo CA-MRSA, HA-MRSA e cepas VRE que circulam no Japão. A minimização do tempo para otimizar a terapia antimicrobiana usando BC-GP pode contribuir para reduzir os custos e melhorar os cuidados com o paciente. Em 2016, a BC-GP recebeu aprovação regulamentar no Japão tornando-se o primeiro teste molecular multitarget para hemoculturas positivas aprovado como dispositivo de diagnóstico in vitro para auxiliar no diagnóstico de infecções bacterianas da corrente sanguínea. Serão necessários estudos adicionais para validar a relação custo-eficácia da BC-GP no contexto do sistema japonês de prestação de cuidados de saúde.

Aprovação ética

Este estudo foi aprovado pelos conselhos internos de revisão TH e SHI.

Interesses concorrentes

Todos os autores declaram não haver interesses concorrentes.

Contribuições dos autores

Ken Kikuchi desenhou e realizou o estudo e redigiu o manuscrito. Mari Matsuda, Shigekazu Iguchi, Tomonori Mizutani, Kaori Sansaka, Kenta Negishi, Kimie Shimada, Shigeyuki Notake, Hideji Yanagisawa, e Reiko Yabusaki realizaram os trabalhos de laboratório. Keiichi Hiramatsu, Michiru Tega-Ishii, Jun Umemura, Hiroshi Takahashi, Hideki Araoka, e Akiko Yoneyama supervisionaram a coleta de dados e coordenaram e participaram da concepção do estudo.

Conhecimento

Este estudo foi apoiado, em parte, por um Grant-in-Aid (S0991013) do Ministério da Educação, Cultura, Esporte, Ciência e Tecnologia, Japão (MEXT), para a Fundação de Projetos de Pesquisa Estratégica em Universidades Privadas.