O estabelecimento de sistemas de transformação genética permitiu aos cientistas transformar DNA estranho em fungos filamentosos e assim obter as estirpes desejadas para fins industriais. Podemos agora tirar o máximo partido do poder de secretor superior dos fungos e da sua excelente eficiência na produção de metabolitos valiosos.

Transformação por plasma (PMT)

PMT é o método de transformação fúngica mais utilizado, que se baseia num grande número de protoplastos fúngicos competentes. O princípio é usar algumas enzimas comercialmente disponíveis para remover componentes da parede celular de complexos fúngicos para gerar protóplastos. Posteriormente, alguns reagentes químicos (como o PEG) são usados para promover a fusão de ácidos nucleicos exógenos e protoplásticos, como descrito em mais detalhes abaixo. Os componentes da parede celular do fungo são altamente variáveis entre as diferentes estirpes. Mesmo os componentes da camada de esporos são significativamente diferentes dos das hifas de uma mesma estirpe. Portanto, não existe um método de transformação universal que possa ser aplicado a diferentes estirpes fúngicas. A preparação de protoplastos dificilmente pode ser padronizada. Parte das dificuldades provém do nosso conhecimento limitado das hidrolases da parede celular. O desenvolvimento de um método otimizado de PMT para fungos ainda requer um esforço significativo.

PMT é um método de transformação usado rotineiramente. O método tem estado sob constante aperfeiçoamento para alcançar maior eficiência na transformação genética e para visar loci gênicos adequados através da edição de genes. A preparação de protoplastos requer a remoção da parede celular, o que é conseguido principalmente através do tratamento enzimático. Métodos não enzimáticos para preparar protoplastos também têm sido relatados, tais como métodos físicos, incluindo moagem e choque de ondas supersônicas. No entanto, não são amplamente utilizados devido aos inconvenientes práticos e ao baixo rendimento dos protoplásticos. Um resumo dos protocolos de transformação mediados por protoplastos para diferentes espécies fúngicas é fornecido na Tabela 1.

Passos básicos do método PMT

PMT foi aplicado pela primeira vez em Saccharomyces cerevisiae. Os pesquisadores prepararam protoplastos com a caracolase comercial, e utilizaram sorbitol para preservar os protoplastos. Mais tarde, tal método foi aplicado a fungos filamentosos, como Neurospora crassa , e A. nidulans . Embora os métodos de transformação tenham sido melhorados, os passos básicos permanecem essencialmente os mesmos. Os passos básicos do método PMT são fornecidos na Fig. 1.

Passos básicos da transformação protoplástica-mediada

Preparação dos protoplastos

O primeiro passo na preparação dos protoplastos é a remoção da parede celular através da digestão enzimática. A parede celular fúngica é composta por glucano, mananol e quitina. A estrutura da parede celular fúngica é altamente dinâmica, e a parede celular varia durante a divisão celular e crescimento dos fungos, assim como na germinação dos esporos, ramificação hifálica e formação do diafragma. Os componentes da parede celular também são diferentes em diferentes espécies fúngicas, portanto, várias enzimas devem ser usadas em combinação. Tem sido relatado que a seleção de uma mistura enzimática apropriada é um fator chave na preparação de protoplastos .

Em geral, as hifas são sensíveis a uma enzima adequada que hidrolisa sua parede celular durante a fase logarítmica. No procedimento PMT do Neurospora, os protoplastos são preparados através da hidrolização das hifas recém-nascidas (cultura para 4-6 h abaixo de 25-30 °C) . Da mesma forma, os protoplastos também podem ser preparados com conidiosporos. Por exemplo, para Aspergillus e Penicillium, pode-se escolher esporos germinais ou tálio .

Protoplastos são sensíveis à pressão osmótica, deve-se ter cuidado para manter uma pressão osmótica estável para manter os protoplastos intactos durante a enzimólise das paredes celulares. Assim, os estabilizadores osmóticos (como sorbitol, cloreto de sódio e cloreto de potássio) devem ser incluídos em todos os tampões para a preparação de protoplastos, para evitar a ruptura das células. Por exemplo, a solução de sorbitol com uma concentração de 0,8-1,2 M é utilizada na preparação de protoplastos de N. crassa , Aspergillus sp. e Trichoderma sp. para manter a estabilidade osmótica dos protoplastos. Um resumo dos parâmetros de preparação de protoplastos para algumas espécies de fungos comuns é fornecido na Tabela 2.

Retirada de DNA exógeno

A solução usada para suspender os protoplastos geralmente contém íons de cálcio e estabilizadores osmóticos. Pensa-se que o cálcio abre canais na citomembrana, o que facilita a entrada de ADN exógeno na célula, enquanto o estabilizador osmótico é necessário para manter a morfologia dos protoplastos. Normalmente, uma certa quantidade de polietilenoglicol (PEG) é adicionada juntamente com ADN purificado (que pode ser o ADN circular de fio duplo ou o ADN linearizado). O PEG é um promotor de fusão celular comumente utilizado. Ele pode formar a ponte molecular entre as células ou entre a citomembrana e o DNA, e assim promove a adesão. Além disso, ele também pode induzir cargas desordenadas na superfície da citomembrana, alterar a permeabilidade da membrana e facilitar a entrada de ácidos nucleicos exógenos nas células .

PEG é um agente crucial aumentando a eficiência de transformação. Baixa eficiência de transformação na maioria dos casos pode ser melhorada com a adição de mais PEG. Em condições normais, o desempenho do PEG de baixo peso molecular (como o PEG3000) é superior ao do PEG de alto peso molecular (como o PEG8000). No entanto, isto precisa ser otimizado para várias espécies .

A eficiência da transformação também é influenciada pela temperatura. Geralmente, a mistura de DNA e protoplastos deve ser colocada sobre gelo durante 15-30 min, para que o DNA possa aderir à superfície dos protoplastos .

Regeneração de protoplastos

A fim de garantir uma boa recuperação dos protoplastos viáveis, os protoplastos podem ser recuperados na placa sem pressão de seleção por uma certa quantidade antes de serem transferidos para uma placa seletiva. Um estabilizador osmótico deve ser incluído na cultura de regeneração. Uma pressão osmótica estável é o factor chave para que os protoplastos regenerem a parede celular. Apenas os protoplastos que transportam ácidos nucleicos exógenos podem crescer no meio selectivo.

Comentários sobre o método PMT

O método de transformação de protoplast é simples e eficaz, sem necessidade de equipamento dispendioso. Mas o protocolo envolve muitas etapas e reagentes críticos. Cada passo precisa ser otimizado e a qualidade dos reagentes precisa ser testada criticamente. O estado de crescimento dos fungos a serem transformados precisa ser cuidadosamente monitorizado. A experiência é crítica para o sucesso da implementação deste método.

Agrobacterium -mediated transformation (AMT)

Agrobacterium é uma bactéria Gram-negativa comumente encontrada no solo. Agrobacterium tumefaciens pode infectar plantas feridas. O plasmídeo indutor do tumor de > 200 kb, também chamado de Ti plasmídeo, pode ser isolado na fase inicial da infecção. Quando A. tumefaciens infecta uma planta, ela entra na planta através da ferida, e integra parte do plasmídeo de Ti no genoma das células infectadas da planta. O fragmento de DNA integrado do Ti plasmídeo é comumente referido como DNA de transferência ou T-DNA. O T-DNA é inserido no genoma da planta de forma aleatória como monoclone. O T-DNA é flanqueado por duas repetições imperfeitas direcionais (chamadas de borda esquerda e direita) e contém genes que codificam enzimas responsáveis pela formação de hormônios vegetais, que causam o crescimento tumoral. Um vetor binário foi projetado para ter o gene alvo inserido entre as bordas esquerda e direita do T-DNA, e o plasmídeo recombinante foi transformado no Agrobacterium tumefaciens. O clone positivo de Agrobacterium foi usado como veículo para integrar o gene alvo no genoma fúngico. Os passos específicos serão discutidos em detalhes abaixo.

AMT método mostrou-se mais estável e eficiente do que os métodos convencionais de transformação desde o primeiro trabalho relatou que este método poderia ser aplicado à transformação fúngica. O método AMT foi aplicado pela primeira vez à transformação de S. cerevisiae . Um plasmídeo portador de um gene de resistência à higromicina é comumente usado para transformar Aspergillus awamori . O método AMT tem sido aplicado a muitos Ascomycetes, incluindo o Aspergillus , e o Monascus purpureus . Os passos básicos do método AMT são fornecidos na Fig. 2. Um resumo do protocolo de transformação mediado por Agrobacterium para diferentes espécies fúngicas é fornecido na Tabela 3.

As etapas básicas da transformação mediada por Agrobacterium

Factores que influenciam a eficiência da AMT

>

Muitos factores afectam a eficiência da AMT, incluindo o tipo de material fúngico inicial (protoplasto, esporo, hifa e tecido corporal da fruta), concentração da acetosiringona, proporção de fungo para Agrobacterium, e a condição para a co-cultura.

1. O tipo de material fúngico inicial O método AMT pode usar os protoplastos, esporos, hifas e tecido do corpo da fruta dos fungos como receptor. Os materiais de partida apropriados devem ser selecionados para diferentes cepas. Por exemplo, o método AMT só funciona para os protoplastos de Rhizopus. oryzae e Mucor circinelloides, enquanto esporos ou esporos germinativos não produziriam transformantes .

2. A concentração de acetosiringona (AS) AS atua em dois estágios durante o processo AMT. Uma é o processo de indução, e a outra é o processo de transformação. AS é geralmente usado para induzir a expressão do domínio Vir do T-DNA, e o gene no domínio Vir ativa a transferência do T-DNA. Numerosos estudos demonstraram que uma quantidade apropriada de AS foi necessária durante o processo de transformação. Contudo, a adição de AS não é absolutamente necessária durante a fase de pré-cultura do Agrobacterium, o que poderia reduzir a eficiência de transformação para algumas estirpes. A concentração de AS é um fator importante que afeta a eficiência de transformação durante o processo de co-cultura fungo-Agrobacterium no AMT de Aspergillus awamori .

3. A proporção de fungos para Agrobacterium Dentro de certos limites, a eficiência de transformação atingirá o nível máximo com o aumento da quantidade de fungo ou Agrobacterium. Uma relação ideal de AMT para diferentes fungos deve ser determinada empiricamente. A relação entre fungos e células bacterianas deve ser otimizada para diferentes sistemas de transformação de fungos-Agrobacterium.

4. A condição para a co-cultura As condições para a co-cultura são um fator importante no método AMT. Isto inclui tempo de cultura, temperatura, pH e a seleção do filtro. A temperatura e o tempo para a co-cultura são os fatores chave entre os passos da AMT. Na transformação fungo-Agrobacterium, uma condição apropriada para iniciar é uma temperatura de 20-28 °C e um tempo de co-cultura de 16-96 h. Uma temperatura mais baixa (20-25 °C) é geralmente benéfica para o método AMT. O filtro, que é hidrofílico e serve como suporte para a co-cultura de fungos-Agrobacterium, facilita a transferência de colónias únicas para a placa de triagem. Uma membrana de nitrocelulose, membrana de nylon, papel filtro, celofane e membrana de polivinilideno fluoreto (PVDF) pode ser usada como filtro .

Comentários sobre a transformação mediada por Agrobacterium

O método AMT abre um novo caminho para aqueles fungos recalcitrantes à transformação pelos métodos convencionais. O método AMT é especialmente adequado para gerar mutações por knock-in em fungos porque o T-DNA é inserido aleatoriamente no genoma como uma única cópia. Além disso, o método AMT pode alcançar alta eficiência de recombinação homóloga em vários experimentos de direcionamento gênico .

As maiores vantagens do método AMT incluem: primeiro, receptores de transformação diversificados, incluindo protoplastos, hifas e esporos; segundo, a habilidade de integrar genes exógenos no genoma para formar transformantes estáveis; e terceiro, alta eficiência de transformação resultando em um grande número de transformantes .

O método AMT requer vetores binários, que são tediosos para se preparar. Vários fatores precisam ser levados em consideração na otimização do processo de transformação. Esta é uma grande limitação do método AMT .

Transformação por electroporação

A electroporação é um método de transformação simples, rápido e eficiente para fungos filamentosos. Na electroporação, as cargas eléctricas são armazenadas num condensador para construir uma alta tensão, a amostra é atingida pela tensão de impulso, e o ácido nucleico exógeno pode ser transferido instantaneamente para as células. Normalmente, ondas quadradas ou ondas de decaimento exponencial são utilizadas na transformação de fungos. Os impulsos de decaimento exponencial são gerados simplesmente carregando e descarregando um condensador. O campo elétrico decresce exponencialmente a partir do valor de pico. Uma onda quadrada é uma forma de onda periódica não sinusoidal (que pode ser representada como uma soma infinita de ondas sinusoidais), na qual a amplitude se alterna a uma frequência constante entre valores mínimos e máximos fixos. Diferentes formas de onda de electroporação são utilizadas para diferentes espécies. Um resumo das formas de onda utilizadas em eletroporação para diferentes espécies é fornecido na Tabela 4.

Quando uma célula é exposta ao campo elétrico, a estrutura da citomembrana será alterada com uma tensão induzida entre a citomembrana. Microporos podem ser formados na citomembrana após o choque elétrico. A permeabilidade da parede celular induzida é reversível dentro dos limiares da voltagem e da duração, caso contrário, causará lesões irreversíveis às células. Portanto, os microporos na citomembrana parecem ter dois padrões após o choque elétrico, o padrão reversível e o padrão irreversível. As moléculas lipídicas e proteicas da citomembrana podem restaurar a estrutura original quando uma intensidade de campo apropriada é aplicada, enquanto o choque elétrico irreversível dará origem a irreparabilidade ou recuperação extremamente lenta, o que eventualmente levará à morte da célula. O DNA exógeno pode ser transferido para a bactéria, protoplástico vegetal, células animais e fungos filamentosos através da electroporação. Este método tem sido aplicado com sucesso a múltiplos fungos. Ozeki et al. descobriram que os esporos germinativos são mais suscetíveis à transformação por eletroporação. Nos últimos anos, a electroporação tornou-se um método fiável para a transformação genética de algumas estirpes comuns. Um resumo dos protocolos de transformação mediados por eletroporação para diferentes espécies fúngicas é fornecido na Tabela 5.

Fatores que influenciam a transformação por eletroporação

Parâmetros de eletroporação

1. Intensidade do campo elétrico A intensidade do campo elétrico é o fator mais importante que influencia a eficiência da eletroporação. Quando a intensidade do campo elétrico aplicado atingir a magnitude de kV/cm e a largura do pulso da escala μs-ms, a membrana será alterada e muitos microporos serão gerados nas paredes das células. A alta intensidade do campo elétrico está associada a alta taxa de absorção de ácidos nucléicos exógenos e menor taxa de sobrevivência celular. No entanto, vários tipos de células requerem diferentes intensidades de campo elétrico devido a diferenças nos componentes da citomembrana . Poucos microporos são formados quando a intensidade do campo elétrico não excede o limite requerido. Pelo contrário, a intensidade excessiva do campo elétrico resultará em danos irreversíveis à citomembrana, levando à morte da célula .

2. Capacitância Durante o processo de eletroporação, a variação das cargas elétricas e a intensidade do campo elétrico aplicado à suspensão celular dependem da capacitância e da duração do pulso. A intensidade e duração do pulso também são influenciadas pela capacitância, portanto, uma maior capacitância tem melhores efeitos de transformação .

3. Duração e frequência do pulso A duração da perfuração na citomembrana, que está diretamente relacionada à eficiência de transformação da electroporação, é influenciada pela duração e frequência do pulso .

Ambiente de electroporação e factores externos

1. Solução tampão A solução tampão fornece um ambiente importante para a electroporação de células, e o valor do pH da solução tampão de choque eléctrico é de grande importância. Normalmente, é utilizado um tampão de pH 7,0. As células são facilmente perfuradas e mortas a pH superior a 7,0 .

2. Temperatura Uma grande quantidade de calor é produzida durante o processo de electroporação, que será libertada para a solução tampão. Portanto, uma temperatura reduzida (0-4 °C) é recomendada para um melhor efeito . Além disso, o banho de gelo na mistura pré-choque elétrico também pode melhorar a eficiência do choque elétrico.

3. Concentração de ácido nucleico exógeno Em geral, a eficiência da eletroporação aumenta com a concentração de ácido nucleico exógeno. O ADN super-hélice compacto entra mais facilmente nas células através da citomembrana. Em 1995, um estudo relatou que cada 1 μg de DNA plasmídeo poderia gerar 100 transformantes para A. niger .

Comentários sobre o método de electroporação

O método de electroporação tem sido extensivamente aplicado a numerosos tipos de células, incluindo procariotas e eucariotas. Esta tecnologia tem o potencial de ser o método de escolha para a transformação de espécies fúngicas não exploradas. Em comparação com o método PMT, onde estão envolvidas etapas complicadas, a electroporação é simples e mais conveniente. No entanto, o mecanismo da electroporação ainda não está claro. A taxa de perfuração da citomembrana é dependente de muitos parâmetros do campo eléctrico. E também, requer condições tampão adequadas para ser otimamente eficaz.

Transformação biolística

A transformação biolística também é conhecida como bombardeamento de partículas. Seu princípio é que o DNA estranho é adsorvido na superfície de partículas de tungstênio ou ouro. Sob o impulso de alta pressão, as partículas são injetadas nas células hospedeiras. O bombardeamento de partículas pode realizar transformações estáveis e transitórias.

Vários fatores afetam a eficiência do bombardeamento em padrões de interações complexas . Parâmetros biológicos (tipo de célula, condição de crescimento e densidade celular) e configurações instrumentais (tipo e tamanho da partícula, nível de vácuo e pressão, distância do alvo) são variáveis importantes.

O bombardeamento de partículas é o mais poderoso entre todos os métodos de transformação genética. Ele não está sujeito às limitações dos tipos de células hospedeiras ou espécies. Para os fungos, o bombardeamento de partículas é suficientemente eficiente para aqueles organismos que são difíceis de cultivar ou a partir dos quais os protoplásticos são difíceis de preparar. O bombardeamento de partículas é fácil e conveniente de operar. No entanto, os instrumentos e consumíveis para o bombardeamento de partículas são caros. Só será considerado no caso em que outros métodos não funcionem. Atualmente, o bombardeamento de partículas tem sido utilizado para transformar com sucesso A. nidulans e T. reesei , etc.

Transformação mediada por ondas de choque (SWMT)

SWMT utiliza o princípio da transformação e transmissão de energia para gerar perturbações transitórias de pressão e força de torção através das células para formar o efeito de cavitação transitória . Este método tem sido aplicado em tratamentos médicos, tais como ortopedia e esmagamento de pedras nos rins . O SWMT altera a permeabilidade das membranas celulares através da cavitação acústica, resultando na absorção de ácido nucleico exógeno pelas células. O método tem sido utilizado com sucesso na introdução de ácido nucleico exógeno em Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella typhimurium . Em 2013, Denis Magaña-Ortíz et al. relataram pela primeira vez a aplicação do SWMT para fungos, incluindo A. niger, Fusarium oxysporum e Phanerochaete chrysosporium . Neste artigo, foram observadas três vantagens do método SWMT. Primeiramente, em comparação com os métodos convencionais de transformação, este método é capaz de atuar diretamente sobre esporos, mas não sobre protoplásticos. Em segundo lugar, os parâmetros físicos eram facilmente controláveis, apenas o número de esporos, a energia e a velocidade da onda de choque precisavam ser controlados com precisão. Em terceiro lugar, a eficiência da transformação foi excelente. Resultados de Denis Magaña-Ortíz et al. indicaram que, comparado com o método de transformação Agrobacterium, o método SWMT poderia aumentar a eficiência de transformação em 5400 vezes para A. niger .

Mas algumas limitações neste método de transformação também foram notáveis. Como uma grande proporção do DNA é danificada no tratamento da onda de choque, a eficiência de transformação, determinada pela relação entre o DNA e as células, foi bastante baixa. Entretanto, para o número de células envolvidas, a eficiência de transformação foi significativamente maior. Ao avaliar a eficiência, é preciso considerar dois aspectos: a quantidade de DNA e o número de células. Por exemplo, no experimento realizado por Magana-Ortiz et al. , em geral, o DNA plasmídeo utilizado na transformação de protoplastos e eletroporação é cerca de 1-10 μg . É caro e inconveniente produzir tamanha quantidade de plasmídeo no laboratório para o método SWMT. Além disso, as fontes e instrumentos de ondas de choque são caros porque são projetados principalmente para fins médicos. Isto acaba por ser um grande obstáculo à adopção deste método num laboratório de microbiologia com recursos limitados.