1 Introdução
O campo da neurociência comportamental progrediu imensamente no século passado e inclui o desenvolvimento de metodologia e ferramentas científicas para sondar vários aspectos da cognição. O ‘teste de reconhecimento de objeto de um julgamento’ realizado pela primeira vez por Ennaceur e Delacour em 1988 cresceu e tornou-se um modelo amplamente aceito para investigar não apenas a memória de reconhecimento de objeto, mas também a memória de trabalho, atenção, ansiedade, neofobia e neofilia (Antunes e Biala, 2011; Goulart et al., 2010; Silvers et al., 2007) e para avaliar mudanças causadas por intervenções farmacológicas e lesões cerebrais. Primeiro desenvolvido para roedores, o teste de reconhecimento de objetos novos (NOR) também foi usado para examinar a memória em humanos, primatas, pombos, hamsters, coelhos e peixes. Este capítulo irá descrever como o teste NOR e as variantes deste teste foram adaptados para uso com peixes de água doce e peixes marinhos, e como estes peixes foram realizados tanto no teste NOR como no teste de memória episódica (ELM).
De acordo com estimativas recentes, existem mais de 32.500 espécies de peixes nos ecossistemas oceânicos e de água doce, e são responsáveis por aproximadamente metade dos vertebrados vivos do planeta (Nelson, 2006). Os peixes podem viver em ambientes muito diferentes e suportar vários desafios fisiológicos que acabam por afectar os seus repertórios comportamentais. Por exemplo, alguns peixes vivem em água doce quase sem sal (0.1 mOsmol/kg), enquanto outros prosperam no mar (∼1000 mOsmol/kg) e até ambientes hipersalinos (2400 mOsmol/kg) (McCormick et al., 2013), e como resultado, requerem processos ionoregulatórios completamente opostos para equilibrar o seu meio interno (∼300 mOsmol/kg). Os peixes euryhaline podem mesmo fazer a transição de água salgada para água do mar (McCormick et al., 2013). Outros peixes como a carpa cruciana (Carassius carassius) podem viver em águas a 4°C sem qualquer oxigénio (anoxia completa) durante vários meses (Nilsson, 2001). Estes são feitos fisiológicos que não têm comparação nos sistemas de mamíferos. Pode ser que, como animais terrestres, não nos relacionemos bem com a vida debaixo de água e não passemos tempo significativo a observar os peixes no seu habitat natural. Isto leva os investigadores e o público em geral a ter uma tendência geral para subestimar as capacidades fisiológicas e mentais dos peixes (Brown et al., 2008; Brown, 2014). No entanto, existem muitas descobertas interessantes ao longo dos anos que fornecem alguma visão das suas capacidades cognitivas com base no seu comportamento na natureza. Por exemplo, o uso de ferramentas pelos peixes foi descrito já em 1958, 3 anos antes da descoberta por Jane Goodall do uso de ferramentas nos chimpanzés (ver Bshary et al., 2002; Patton and Braithwaite, 2015). O peixe-gato hoplo castanho (Hoplosternum thoracatum) põe ovos e depois segrega uma substância viscosa que usa para colar os ovos à ninhada foliar (ou seja, uma ‘pastilha’). Se surgir uma ameaça, estes peixes pegam neste ‘comprimido’ e movem os ovos para um local seguro (Armburst, 1958). Foram observados ciclídeos africanos (Aequidens paraguayensis) transportando os ovos com comprimidos de folhas (Keenleyside e Prince, 1976; Timms e Keenleyside, 1975), e foi observado o peixe-pongue preto (Choerodon schoenleinii) agarrando uma casca na sua boca e esmagando-a contra uma rocha, usando assim uma bigorna parecida com uma rocha (Jones et al., 2011). Adicionalmente, o uso de ferramentas foi recentemente observado num estudo de laboratório com bacalhau do Atlântico (Gadus morhua) (Millot et al., 2013). Existem muitas outras descrições do uso de ferramentas, capacidades espaciais e de navegação e dinâmica social em peixes que estão para além do âmbito deste capítulo (para revisão ver, Brown, 2014; Bshary et al., 2002; Patton and Braithwaite, 2015).
Em relação à aprendizagem e memória, entre diferentes espécies de peixes, os gobies parecem ter capacidades excepcionais de memória espacial. Eles têm sido estudados durante o último meio século. Observados pela primeira vez na natureza, estes peixes vivem na zona das marés onde a coluna de água sobe durante a maré cheia e podem explorar toda a zona intertidal. Durante a maré baixa, a coluna de água diminui, deixando apenas pequenas piscinas de água para os gobies viverem. Se estimulados por um predador durante a maré baixa, os gobies tornam-se aéreos, saltando de uma piscina para a outra. Muitas vezes as margens superiores das piscinas não permitem que os gobies vejam o seu alvo, necessitando de uma memória precisa da piscina alvo (Aronson, 1951, 1971). Esta memória espacial foi estudada em laboratório, e verificou-se que pode ser retida por até 40 dias (Aronson, 1971), muito maior do que os “3 segundos de memória” do mito dos peixes. Outros estudos demonstraram que a memória foi mantida por pelo menos 10 dias numa tarefa de alternância espacial em zebrafish (Williams et al., 2002), por pelo menos 12 dias num teste de discriminação alimentar reforçado no ciclídeo amarelo eléctrico (Labidochromis caeruleus) (Ingraham et al., 2016) e por até 1 mês num teste de memória implícita no paradisefish (Macropodus opercularis) (Csányi et al., 1989). Em um paradigma de condicionamento de traços appetitivo, o bacalhau do Atlântico (G. morhua) demonstrou retenção de memória após pelo menos 3 meses (Nilsson et al., 2008) e em uma tarefa de resposta de fuga, o peixe-arco-íris malhado (Melanotaenia duboulayi) demonstrou retenção de memória 11 meses após sua exposição inicial ao teste (Brown, 2001). Nos dois últimos estudos, os peixes foram treinados e testados em grupos.
A maioria dos estudos de aprendizagem e memória no último século foram feitos em laboratório com peixes dourados ou peixes selvagens; no entanto, na última década, houve um aumento na investigação com o zebrafish (Danio rerio). Este peixe tornou-se um organismo modelo útil em estudos de neurociência comportamental e farmacologia (Bailey et al., 2015; Kalueff et al., 2013; Levin et al., 2007; Norton e Bally-Cuif, 2010; Tierney, 2011; Mathur e Guo, 2010; Orger e de Polavieja, 2017). Tem sido usado para investigar muitos aspectos do comportamento, incluindo recompensa, aprendizagem e memória, resposta às drogas, agressão, ansiedade e sono (Collier e Echevarria, 2013; Hamilton et al., 2017b; Holcombe et al., 2013; Perathoner et al., 2016; Norton e Bally-Cuif, 2010). O sistema nervoso central do zebrafish é muito menos complexo do que o dos humanos; no entanto, as principais divisões do cérebro (forebrain, midbrain e hindbrain) e os sistemas neurotransmissores são conservados (Panula et al., 2010). Com a conclusão do seu sequenciamento genético (Kettleborough et al., 2013), o zebrafish é um modelo de escolha para geneticistas devido à simplicidade na manipulação via avançada (Patton e Zon, 2001) e técnicas genéticas inversas (Rinkwitz et al., 2011). Portanto, espera-se que o uso do zebrafish ajude a determinar os mecanismos neurais e genéticos que controlam comportamentos básicos e complexos (Holtzman et al., 2016; Blaser e Vira, 2014; Gerlai, 2012; Feierstein et al., 2015; Naumann et al., 2016; Friedrich et al., 2010; Leighton et al., 2018).
Estudos de aprendizagem e memória demonstraram que o zebrafish é capaz de realizar uma ampla gama de tarefas de aprendizagem e memória. Por exemplo, o zebrafish que foi criado apenas com comida vermelha, azul, verde ou branca mordeu mais frequentemente as tiras de plástico que eram da mesma cor que a comida com que foram criados em comparação com as tiras de outras cores (Spence e Smith, 2008). Em um teste de T-maze com dois braços de cor distintiva, a entrada no braço da cor “correta” foi consistentemente recompensada com comida. O Zebrafish foi capaz de realizar uma tarefa de discriminação visual; eles mostraram preferência pelo braço de cor que foi emparelhado com a recompensa alimentar (Colwill et al., 2005). Em alguns testes comportamentais, um “reforço negativo” também foi usado para examinar a memória associativa. A feromona do alarme é um composto libertado com lesões nas células epidérmicas do zebrafish e provoca uma resposta de alarme inata. Hall e Suboski (1995) descobriram que depois de emparelhar a feromona de alarme com uma luz vermelha ou uma molécula odorífera como a morfolina (estímulos inicialmente neutros), o zebrafish mostrou uma reação de alarme a qualquer um dos estímulos na ausência da feromona de alarme (Hall e Suboski, 1995). A resposta de prevenção é outro tipo de aprendizagem condicionada que envolve a administração de estímulos estressantes ou tóxicos que fazem com que o organismo evite o estímulo. Por exemplo, o zebrafish pode ser condicionado a nadar sobre um obstáculo à visão de um sinal luminoso se este sinal for constantemente seguido por leves choques elétricos (Pradel et al., 1999, 2000). O zebrafish também tem sido testado em paradigmas de aprendizagem espacial. Eles podem aprender a nadar para os lados alternados de um aquário de peixes a fim de recolher uma recompensa alimentar (Smith et al., 2010; Williams et al., 2002) ou para evitar um estímulo aversivo (Levin e Chen, 2004). Assim, uma vasta gama de testes de aprendizagem e memória que têm sido usados em roedores são agora adaptados e realizados por zebrafish.