Resultados e Discussão

O nosso novo método AMHS é facilitado pela estrutura anatômica/funcional do sistema circulatório das abelhas. A circulação é forçada pela contração pulsatória dos diafragmas dorsal e ventral, que bombeia a hemolinfa para o coração. Em seguida, a aorta transporta a hemolinfa para a cabeça (Fig. 1F) , fornecendo hemolinfa ao cérebro e às antenas da abelha.

Em comparação com a TCHS, AMHS permitiu a coleta de 80-100 μL de hemolinfa estéril em um tempo menor e de um número menor de indivíduos, o que minimiza o risco de melanização. Acreditamos que durante a coleta da hemolinfa, é importante minimizar o tempo do seu contato com o ar. O risco de melanização é reduzido com um menor tempo de coleta e uma progressão mais rápida para a etapa de resfriamento. Além do menor tempo de coleta, a redução do uso de insetos é outra vantagem substancial da AMHS sobre a TCHS. A pesquisa Apidae deve ser sempre concebida para minimizar o número de abelhas que devem ser prejudicadas. O uso de AMHS para reduzir o número de abelhas necessárias para coletar um volume de hemolinfa necessário é consistente com os princípios orientadores para um uso mais ético dos animais na pesquisa .

Nossos resultados atuais também mostraram que um maior tamanho de inseto foi associado a uma coleta de hemolinfa mais fácil e rápida, e com maiores volumes de hemolinfa coletada (Tabela 1). A coleta de hemolinfa em trabalhadores de Apis mellifera carnica e Apis cerana demorou mais tempo e exigiu mais insetos do que a coleta de hemolinfa em abelhas, pois as primeiras espécies são consideravelmente menores e têm menos hemolinfa.

A hemolinfa é mais freqüentemente adquirida com capilares usando métodos variados, por exemplo, puncionando o coração, o seio torácico dorsal ou ventral, ou a aorta dorsal. Cada um destes procedimentos acarreta o risco de punção do ventrículo, levando à contaminação da amostra com o conteúdo intestinal. Tal contaminação não só torna a amostra inutilizável, como também exige que o capilar seja substituído por um novo ou limpo e desinfetado antes da próxima utilização – aumentando o tempo total de coleta da hemolinfa. A esterilidade da hemolinfa também pode ser comprometida pela punção dos segmentos do abdómen que ligam a membrana. O uso do AMHS elimina estes problemas relacionados com a capilaridade. Além disso, a coleta de hemolinfa por decapitação pode contaminar a hemolinfa com vazamento de néctar do estômago da abelha. Nosso novo AMHS resultou em amostras de hemolinfa de alta qualidade biológica. Os hemócitos eram claramente visíveis em cada amostra de hemolinfa adquirida pela AMHS (Fig. 1C). A análise de cada lâmina de microscópio revelou que as amostras de hemolinfa obtidas por AMHS eram puras e transparentes, sem contaminação (por exemplo, grãos de pólen).

Esperávamos que, no desempenho da AMHS, a desinfecção com etanol e o contato limitado entre a gota de hemolinfa e o corpo da abelha garantiriam a esterilidade da amostra. Esta expectativa foi confirmada por ensaios microbiológicos. A incubação da hemolinfa adquirida pela AMHS em ambos os meios de ágar MRS e Sabouraud confirmou a esterilidade da hemolinfa. Não foi observado crescimento de microorganismos em qualquer uma das 100 gotas de hemolinfa cromadas. Portanto, nenhum resultado quantitativo é apresentado aqui. Após terminar o período de incubação, observamos apenas olheiras marrons escuras de hemolinfa melanizada ao redor de cada gota. Esta melanização ocorreu durante o período de incubação, não durante a amostragem (Fig. 1D e 1E). Notavelmente, quando a hemolinfa recolhida não deve ser utilizada para testes microbiológicos, a etapa de desinfecção pode ser omitida. É possível que o etanol aplicado na área da antena possa afetar as atividades enzimáticas ou hormonais.

Fatores além da metodologia podem influenciar a eficiência da coleta da hemolinfa. Em nossos estudos anteriores, observamos que a quantidade de hemolinfa coletada de uma abelha depende não só da casta da abelha e da idade, mas também do seu grau de hidratação medido com base no volume de néctar ou xarope de açúcar consumido antes da coleta da hemolinfa. Ptaszyńska et al. reportam que a amostragem dos volumes adequados de hemolinfa é menos eficaz a partir de abelhas mais velhas. Além disso, a eficiência da amostragem pode depender das habilidades laboratoriais do pesquisador. Estes fatores tornam difícil comparar as características quantitativas de diferentes protocolos de amostragem de hemolinfa entre estudos realizados em diferentes laboratórios e usando diferentes organismos. Em particular, em nossas investigações anteriores, temos amostrado hemolinfa de milhares de abelhas usando AMHS, assim como outros métodos, incluindo TCHS . Nosso pessoal de laboratório tem experiência substancial na coleta de hemolinfa de abelhas de diferentes idades e castas. Esta experiência ajudou-nos a comparar os diferentes métodos de amostragem, uma vez que os nossos resultados não foram afectados por erros devido às habilidades variáveis do pessoal do laboratório. Nossos resultados atuais indicaram que o AMHS foi um método eficiente, limpo e altamente preciso (Tabela 1) que consumiu menos tempo que o TCHS .

Amostras de hemolinfa usando outros métodos que não o AMHS normalmente requerem equipamentos adicionais, como tubos micro-capilares. Além disso, a remoção da hemolinfa dos tubos micro-capilares requer ou o uso de uma bomba especial, ou o esmagamento dos tubos e a centrifugação dos mesmos com contas. Outra vantagem da AMHS é a possibilidade de utilizar uma pipeta para medir o volume da hemolinfa recolhida de qualquer abelha. Isto é particularmente útil ao realizar análises bioquímicas de microamostras, por exemplo, para determinar as actividades enzimáticas . Vale ressaltar que, ao aplicar outros métodos que não AMHS , o volume da hemolinfa pura pode ser calculado indiretamente, com base no volume da hemolinfa mais fina em um tubo antes da amostragem e no volume medido da hemolinfa mais fina após a amostragem. Entretanto, tal método pode levar a erro adicional; portanto, alguns pesquisadores usam seringas de Hamilton . O AMHS evita as despesas e o trabalho adicional (por exemplo, desobstrução da seringa, desinfecção, etc.) do uso de seringas de Hamilton.

Mayack e Naug (a hemolinfa é adquirida pelas abelhas giratórias com antenas recortadas) é semelhante ao AMHS. No entanto, o seu método requer tanto uma centrífuga de laboratório, como as partes da boca apiana tiveram de ser coladas para evitar qualquer possível contaminação. Além disso, no seu estudo, dissecaram as entranhas do apiano para avaliar a infecção nosema ceranae antes de girar as abelhas. Sem esta etapa, as tripas seriam uma fonte provável de contaminação. O seu método consiste em colocar as abelhas em tubos de centrifugação e girá-las a 16.000 RCF durante 30 s para obter a hemolinfa. Este processo poderia estratificar os componentes da hemolinfa (por exemplo, proteínas e hemócitos) e acarretar riscos acrescidos de contaminação microbiológica e de melanização da hemolinfa (ver discussão acima). Embora possa ser ideal para analisar os níveis de açúcar hemolinférico entre as abelhas forrageiras com tripas previamente removidas (como em seu estudo), não é totalmente apropriado para estudos microbiológicos e genéticos ou investigações de atividades enzimáticas. Neste contexto, nosso novo método AMHS é mais adequado para uso geral, sendo fácil e simples, e provavelmente aplicável em uma ampla gama de diferentes tipos de estudos.