A iluminação na superfície terrestre varia em >10 ordens de magnitude durante o ciclo dia-noite normal, e o sistema visual de vertebrados cobre toda essa gama de intensidades de luz com dois subsistemas neuronais que dependem da atividade de dois tipos de células fotorreceptoras, hastes e cones. A visão com haste humana opera em aproximadamente sete ordens decimais de iluminação. O sistema de visão em cone opera num alcance ainda mais amplo (Rodieck 1998). A adaptação da luz ocorre em todos os níveis do sistema visual, desde os fotorreceptores aos neurônios centrais. No entanto, a função de todo o sistema visual depende da capacidade dos próprios fotorreceptores de ajustar a sua sensibilidade à situação de iluminação ambiente. Assim, os fotorreceptores devem gerar sinais confiáveis à noite, quando um único fóton é capturado entre longos intervalos de escuridão, e também devem continuar a sinalizar com as intensidades de luz muito altas encontradas em um dia ensolarado. É provável que a adaptação da luz do fotorreceptor seja mediada por mecanismos moleculares múltiplos e talvez redundantes (Detwiler e Gray-Keller 1992; Lagnado e Baylor 1992; Bownds e Arshavsky 1995; Pugh et al. 1999). Recentemente, Pugh et al. 1999 resumiram nove mecanismos moleculares individuais que se pensava estarem envolvidos na adaptação e discutiram suas contribuições relativas a todo o processo de adaptação. Um estudo dos mesmos autores, publicado na página 795 (Nikonov et al. 2000, esta edição), fornece o suporte experimental para seus insights e desenvolve um quadro teórico que terá impacto em futuros estudos de adaptação à luz fotoreceptor.
Os mecanismos moleculares subjacentes à adaptação à luz podem ser discutidos no contexto das reações que regem o cGMPc no citoplasma fotoreceptor (Hodgkin e Nunn 1988):
A concentração intracelular do cGMPc é determinada pela taxa de sua síntese pela guanilina ciclase e a taxa de sua hidrólise pela fosfodiesterase do cGMPc (PDE). Esta concentração é constantemente monitorada pelos canais de cGMP-gated localizados na membrana plasmática fotoreceptora. No fotorreceptor ajustado ao escuro, é mantida uma concentração constante de cGMP de alguns micromolares. Isto mantém uma fração dos canais catiônicos de cGMP-gated da membrana plasmática externa aberta e a célula despolarizada. A luz causa a queda do cGMP ativando a PDE através da cascata enzimática incluindo a rodopsina foto-ativada, a proteína G chamada transducina, e a enzima efetora PDE. A redução na concentração de cGMP resulta no fechamento do canal e na hiperpolarização fotoreceptor. A recuperação da resposta da luz ocorre quando a cascata excitatória é inativada, o nível de cGMP é restaurado pela guanylyl ciclase, e os canais são reabertos. Durante a fotorresposta, a concentração intracelular de Ca2+ também diminui, uma vez que sua entrada através dos canais de cGMP é bloqueada enquanto continua a ser extrudida por uma molécula de troca de Na2+/Ca2+-K+, localizada na membrana plasmática. É este declínio de Ca2+ que tem sido implicado como o principal fator subjacente à adaptação à luz, pois leva à regulação de realimentação de vários componentes da cascata de fototransdução.
Para ilustrar a importância da adaptação à luz à função fotorreceptora normal, considere o seguinte. Para que os fotorreceptores de haste registrem estímulos de luz mínimos, um alto grau de amplificação de sinal tem que ser alcançado na cascata rhodopsin-transducina-PDE. Por exemplo, no pico da resposta da haste do sapo a um único fóton, que ocorre ∼1 s após a absorção do fóton, ∼1% dos canais abertos e sensíveis à luz tornam-se fechados. Isto implica que uma iluminação constante, fornecendo apenas ∼100 fótons por segundo, fecharia todos os canais, tornando a célula não responsiva a qualquer estimulação de luz adicional. Mas como as hastes se adaptam à luz, esta saturação é evitada até que a iluminação ambiente produza uma taxa de captura de fotões de ∼10.000 fotões por segundo. O efeito da adaptação é ainda mais profundo nos cones: praticamente nunca saturam.
A transição entre o estado escuro e o estado ajustado à luz do fotorreceptor é acompanhada por duas mudanças significativas nas propriedades fisiológicas dos fotorreceptores. Em primeiro lugar, os fotorreceptores adaptados à luz são menos sensíveis à luz, evitando que fiquem cegos a níveis elevados de intensidade luminosa. Segundo, os fotorreceptores adaptados à luz produzem fotorreponses mais rápidas, melhorando a resolução temporal no sistema visual. É a estas duas características que o termo “adaptação à luz” tem sido mais frequentemente aplicado, e a visão predominante na literatura sugere que os sistemas de retroalimentação Ca2+ estão subjacentes a ambos. Uma contribuição imensamente importante de Nikonov et al. 2000 é a de desafiar esta visão. Os autores examinaram o processo de adaptação à luz em fotorreceptores de salamandra e forneceram evidências experimentais de que tanto a dessensibilização do fotorreceptor quanto a aceleração da resposta são largamente independentes da retroalimentação de Ca2+. Em vez disso, eles resultam da atividade elevada da EDP causada pela iluminação de fundo constante.
Um efeito da ativação constante da EDP sobre a sensibilidade absoluta da resposta é bastante direto. Como a sensibilidade absoluta da resposta é proporcional ao número absoluto de canais abertos antes do flash, a redução do número de canais abertos causada pela iluminação constante leva automaticamente a uma compressão da amplitude da resposta. Entretanto, a compressão da resposta é uma parte relativamente pequena do efeito total da ativação constante do PDE. A principal fonte de redução da sensibilidade do flash é devido à aceleração da recuperação do sinal causada pela ativação da PDE. Formalmente, esta aceleração ocorre porque a constante de tempo da reação que rege a mudança de cGMP induzida pelo flash é inversamente proporcional à atividade específica da PDE por volume citoplasmático. Esta constante de tempo é exatamente a mesma constante de tempo que rege a rotação de toda a piscina cGMP citoplasmática sob as mesmas condições de iluminação.
Este último conceito não é intuitivo, e Nikonov et al. 2000 fornecem uma analogia hidrodinâmica “banheira” para ilustrar este efeito na discussão do seu trabalho. Nós fornecemos outra analogia que pode atrair o leitor familiarizado com as propriedades dos circuitos elétricos. Considere um circuito eléctrico constituído por uma resistência variável, um condensador, e uma fonte de corrente constante. A tensão (V) através do condensador representa a concentração de cGMP. A corrente (i) que carrega o condensador (C) representa a taxa de síntese de cGMP pelo guanylyl cyclase (α, de acordo com Nikonov et al. 2000), enquanto o condensador representa o volume da célula. A atividade do PDE é representada pelo resistor variável (R(I)), que é regulado pela luz (I). A condutividade do resistor, 1/R, representa a soma da atividade da PDE basal escura e da atividade da PDE estimulada pela luz. A tensão através do condensador é definida pelo equilíbrio entre a entrada de corrente no circuito e a fuga através do resistor. As equações que descrevem as mudanças de tensão no circuito são idênticas às que descrevem a dinâmica da concentração de cGMP na haste.
Nesta analogia, uma resposta flash é representada pela introdução de uma breve diminuição transitória em R(I). Isto faz com que a tensão caia para um certo nível, e depois volta exponencialmente para o nível estável com uma constante de tempo τ = RC. Como 1/RC é equivalente à relação entre a atividade em estado estacionário do PDE e o volume citoplasmático (β, segundo Nikonov et al. 2000), RC representa a constante de tempo da troca do pool citoplasmático cGMP. Então é claro que uma maior atividade de PDE estável reduz esta constante de tempo e leva a uma recuperação mais rápida do GMPc para o seu nível de base. Nikonov et al. 2000 demonstram que este segundo efeito cinético da atividade de PDE pré-flash constante é o principal fator responsável pela aceleração da fotorresposta durante a adaptação à luz. É importante notar que como o circuito é linear, o curso do tempo da recuperação da resposta “flash” é independente do valor constante da corrente i. Alterações em i simplesmente escalam a amplitude da resposta de tensão (cGMP) sem alterar o seu tempo de recuperação característico. Assim, o nível da atividade cíclica em estado estacionário, i nesta analogia, não tem influência na taxa de recuperação da fotoresposta.
A recuperação acelerada significa que a resposta de flash se desenvolve em um período de tempo mais curto, e isto reduz a sensibilidade a um flash sobreposto a um fundo estável. Assim, a ativação do PDE em estado estacionário reduz a sensibilidade do fotorreceptor pelos efeitos combinados da redução da fração de canais abertos e pelo corte da fotoresponse curto. Experiências elegantes permitiram a Nikonov et al. 2000 quantificar o grau de ativação da PDE por luzes de fundo estáveis. Eles mostram que, da redução da sensibilidade ao flash observada com suas intensidades de fundo mais brilhantes (ver Fig. 6 em Nikonov et al. 2000), ∼5-fold é devido à compressão da resposta e ∼15-fold é devido ao efeito cinético da ativação da PDE, sendo o residual provável devido ao efeito da recuperação atuando sobre a vida útil da rodopsina ativada.
A economia atribui a maior parte da redução da sensibilidade fotorreceptora e a aceleração da fotoresponsa à elevada atividade de PDE antes do flash, surge a pergunta: qual o papel do feedback Ca2+ na adaptação à luz? A resposta é clara quando temos em mente que a atividade constante da PDE produzida pela luz de fundo causa um aumento substancial na atividade hidrolítica do GMPc. Se não houvesse mecanismos de compensação, a concentração de cGMP seria drasticamente reduzida, mesmo sob iluminação de fundo moderada, eventualmente não deixando nenhum canal aberto para registrar mais mudanças de luz. Assim, o papel mais fundamental do Ca2+ na adaptação à luz é o de se opor a essa saturação, engajando uma série de mecanismos moleculares que levam à reabertura dos canais e, portanto, à extensão da gama de intensidades de luz sobre a qual o fotorreceptor opera (ver Pugh et al. 1999 para referências e discussão detalhada).
O principal efeito de extensão da gama de Ca2+ é mediado por um feedback sobre a guanilil ciclase através das proteínas de ligação de Ca2+ chamadas proteínas ativadoras da guanilil ciclase. O declínio de Ca2+ dependente de luz causa um aumento na taxa de síntese de cGMP que contraria a elevada atividade estável de PDE durante a iluminação de fundo. Este efeito da luz de fundo constante não deve ser confundido com o feedback dinâmico de Ca2+ na guanilil ciclase durante a resposta do flash que acelera a recuperação da resposta do flash. Nikonov et al. 2000 argumentam que o efeito da ativação dinâmica da ciclase varia pouco com as condições de luz de fundo e, portanto, não deve ser considerado como um fator importante na adaptação da luz.
O segundo efeito de extensão de alcance de Ca2+ visa diretamente os canais agregados ao cGMP. O declínio de Ca2+ faz com que os canais se tornem mais sensíveis ao cGMP, de modo que eles operem com menor concentração de cGMP. Este efeito é provavelmente mediado por calmodulin ou calmodulin-like proteins, e parece ser mais significativo em cones do que em hastes (Rebrik et al. 2000). Ambos os efeitos levam à reabertura dos canais de cGMP durante a iluminação constante sem causar nenhum efeito dessensibilizante; em vez disso, eles resensibilizam o fotorreceptor.
O terceiro retorno de Ca2+ difere dos outros porque causa tanto uma extensão de faixa quanto contribui para a dessensibilização da célula. A queda de Ca2+ melhora a fosforilação da rodopsina através da recuperação da proteína de ligação Ca2+, levando a uma diminuição na vida útil da rodopsina ativada. Isto resulta em dessensibilização porque reduz o número de moléculas de PDE ativadas por cada rodopsina. A faixa de operação também é estendida porque o número reduzido de PDEs ativos se traduz em uma taxa hidrolítica de cGMP estável reduzida. Tanto Nikonov et al. como outra literatura recente discutida pelos autores demonstram que, nas hastes, este mecanismo parece ser muito menos potente que o feedback na ciclase guaniliana.
Um outro resultado importante relatado no artigo é que não há indicação de um quarto mecanismo proposto de feedback Ca2+, a regulação adaptativa do ganho na cascata entre a ativação da rodopsina e o fechamento do canal. Lamb e Pugh 1992 desenvolveram um método para estimar o ganho na cascata de fototransdução a partir da análise da fase inicial de subida das respostas do flash. Mais tarde, outras investigações discutidas por Nikonov et al. 2000 mostraram que essa inclinação foi reduzida para flashes apresentados durante a iluminação de fundo ou enquanto o Ca2+ intracelular foi artificialmente reduzido na escuridão, concluindo que isso refletia um sistema de feedback de Ca2+ que reduzia o ganho em cascata durante a adaptação à luz. No presente trabalho, Nikonov et al. 2000 mostram que para intensidades de luz de fundo que se aproximam de 80% dos canais sensíveis à luz e resultam em uma redução aproximada de cinco vezes no Ca2+ intracelular, a fase inicial de aumento das respostas ao flash, na verdade, não é alterada. Eles concluem que a aparente redução na amplificação induzida pela luz de fundo ou pela redução da Ca2+ intracelular descrita na literatura é provavelmente devido ao aumento do nível estável de atividade de PDE e ao aumento da taxa de resfriamento da rodopsina fotoexcitada que faz com que a fotorresposta se desprenda de uma trajetória inicial invariante em tempos muito precoces.
Nikonov e seus colegas agora apresentam a visão de que o feedback Ca2+ em adaptação à luz serve quase exclusivamente para aumentar a sensibilidade fotorreceptora e não como um mecanismo de dessensibilização fotorreceptora. Embora isso possa parecer paradoxal, o efeito sensibilizante da extensão da faixa mediada pelo Ca2+ foi evidente desde as primeiras publicações que demonstraram a importância do declínio do Ca2+ induzido pela luz para a adaptação à luz (Matthews et al. 1988; Nakatani e Yau 1988). Nestes estudos, a inibição do retorno do Ca2+ durante a iluminação de fundo constante causou uma redução catastrófica da sensibilidade ao flash. A realimentação de Ca2+ evitou em grande parte a perda de sensibilidade e ampliou a faixa de operação do fotorreceptor por meio de ∼100-fold (ver Figura 2 em Matthews et al. 1988). A elegância do artigo de Nikonov et al. 2000 é que eles encontraram uma maneira clara de separar os papéis tanto para os mecanismos dessensibilizadores quanto para os sensibilizadores no processo geral de adaptação.
Isso nos leva de volta à definição de adaptação à luz em fotorreceptores. Como mencionamos acima, a adaptação é normalmente definida como uma combinação de dessensibilização celular e aceleração da resposta. A lógica de Nikonov et al. 2000 sugere que é necessário redefinir a adaptação para abranger três fenômenos inter-relacionados: dessensibilização celular, aceleração da resposta e extensão do alcance operacional. Os mecanismos moleculares individuais podem contribuir para uma ou mais destas três características. Como descrito por Pugh e colegas em 1999, a dessensibilização nas hastes envolve um aumento na hidrólise estável do cGMP, compressão do sinal e uma diminuição na vida útil da rodopsina por Ca2+/recoverina. A aceleração da resposta envolve um aumento na hidrólise de cGMP estável e uma diminuição na vida útil da rodopsina. A extensão de alcance envolve três processos dependentes de Ca2+: um aumento na síntese de cGMP; um aumento na sensibilidade dos canais ao cGMP; e uma redução da vida útil da rodopsina foto-ativada.
Nikonov et al. 2000 fornecem um modelo matemático detalhado de fototrandução de haste de vertebrados e adaptação à luz baseado em praticamente todos os mecanismos bioquímicos bem estabelecidos. A modelagem deste tipo inclui naturalmente muitos parâmetros que deixam muito espaço para ambiguidade quando se encaixam as respostas. No entanto, no presente e num artigo anterior, Nikonov e colegas (Nikonov et al. 1998, Nikonov et al. 2000) estimaram experimentalmente muitos dos principais parâmetros fisiológicos e bioquímicos de forma independente. Isto elimina quase completamente a manipulação arbitrária dos parâmetros e aumenta a robustez das conclusões retiradas do modelo.
Com a descrição quantitativa da fototransdução e adaptação da luz que Nikonov et al. fornecem, o que resta desconhecido? Nós fornecemos aqui os três exemplos seguintes. Primeiro, embora Nikonov et al. não tenham encontrado evidências de regulação do ganho de fototransdução sob suas condições experimentais, resta saber se o ganho de regulação ocorre ou não em níveis de iluminação mais altos, em uma escala de tempo mais longa, ou em espécies diferentes. Se isso acontecer, isso implicaria na existência de mecanismos bioquímicos adicionais e componentes moleculares que não estão incluídos no presente esquema de fototransdução. Em segundo lugar, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares que estão subjacentes à adaptação da luz em cones. Os cones são capazes de cobrir uma gama mais ampla do que as hastes e são virtualmente impossíveis de saturar com luz de fundo contínua. Estudos futuros devem ser direcionados para entender se toda a adaptação dos cones poderia ser contabilizada por mecanismos de adaptação talvez mais eficientes do tipo vara, ou se requer mecanismos adicionais únicos. Terceiro, num nível mais elevado do processamento visual, desconhece-se como a adaptação de fotorreceptores individuais contribui para a adaptação de todo o sistema visual. Resta determinar como qualquer um dos três componentes da adaptação da luz do fotorreceptor, dessensibilização celular, aceleração da resposta e extensão da faixa de sensibilidade, pode fazer com que nossa visão adaptada à luz funcione mais rapidamente, com melhor sensibilidade ao contraste e maior resolução espacial.