John B. S. Haldane (1892-1964), notável geneticista, fisiologista e popularizador britânico da ciência, estabeleceu novos caminhos de pesquisa em genética populacional e evolução. Enfatizando a imensidão da Via Láctea no céu noturno e o fato de que havia 400.000 espécies de besouros, mas apenas 8.000 espécies de mamíferos, é relatado que ele disse: “Se se pudesse concluir quanto à natureza do Criador a partir do estudo de sua criação, pareceria que Deus tem um carinho especial por estrelas e besouros”. Numa linha de pensamento semelhante, a leitura dos números das revistas da Sociedade Americana de Microbiologia e outras publicadas nos últimos anos pode levar o leitor a concluir que os microbiologistas têm um carinho especial pelos lactobacilos. Cinquenta e duas publicações sobre lactobacilos (com “lactobacillus” ou “lactobacilli” aparecendo no título do artigo ou resumo) apareceram apenas em Microbiologia Aplicada e Ambiental durante 2003. Não é de admirar: estas são bactérias fascinantes e úteis.

Lactobacilos são membros das bactérias do ácido láctico, um grupo amplamente definido caracterizado pela formação do ácido láctico como único ou principal produto final do metabolismo dos carboidratos. Os lactobacilos são hastes gram-positivas, não formadoras de esporos ou coccobacilos com um teor de G+C geralmente abaixo de 50 mol% (22). Oitenta espécies de lactobacilos são reconhecidas no momento (55). Eles são estritamente fermentativos, aerotolerantes ou anaeróbicos, acidúricos ou acidófilos, e têm necessidades nutricionais complexas (carboidratos, aminoácidos, peptídeos, ésteres de ácidos graxos, sais, derivados de ácidos nucléicos, vitaminas). Usando glicose como fonte de carbono, os lactobacilos podem ser homofermentativos (produzindo mais de 85% dos produtos fermentativos como ácido láctico) ou heterofermentativos (produzindo ácido láctico, dióxido de carbono, etanol e/ou ácido acético em quantidades equimolares). As necessidades nutricionais dos lactobacilos são refletidas em seus habitats, que são ricos em substratos contendo carboidratos: eles são encontrados em plantas ou material de origem vegetal, em alimentos fermentados ou estragados, ou em associação com o corpo dos animais (22).

Lactobacilos são importantes na produção de alimentos que requerem fermentação com ácido láctico, nomeadamente produtos lácteos (iogurte e queijo), legumes fermentados (azeitonas, pickles e chucrute), carnes fermentadas (salame) e pão de forma. O uso de lactobacilos na indústria alimentar tem uma longa história, e as funções das bactérias no ambiente industrial foram bem estudadas (28). Os lactobacilos que habitam os corpos dos animais, no entanto, são muito menos conhecidos, apesar do interesse quase contínuo dos cientistas ao longo de cerca de 100 anos.

Elie Metchnikoff (1845-1916), vencedor de um Prémio Nobel pelas suas descrições pioneiras da fagocitose, estava interessado no processo de envelhecimento. Enquanto a investigação moderna sobre este tópico se concentra na manutenção de sequências de ADN não mutantes, Metchnikoff focou-se na microbiota intestinal como fonte de intoxicação a partir do interior (40, 41). De acordo com Metchnikoff, a comunidade bacteriana residente no intestino grosso dos humanos era uma fonte de substâncias tóxicas para o sistema nervoso e vascular do hospedeiro. Estas substâncias tóxicas, absorvidas do intestino e circulantes na corrente sanguínea, contribuíram para o processo de envelhecimento. As bactérias intestinais foram assim identificadas como os agentes causadores da “auto-intoxicação”. As bactérias infractoras eram capazes de degradar proteínas (putrefacção), libertando amónia, aminas e indole, as quais, em concentrações apropriadas, eram tóxicas para os tecidos humanos. Metchnikoff inferiu que baixas concentrações de produtos bacterianos tóxicos poderiam escapar à desintoxicação pelo fígado e entrar na circulação sistêmica. A sua solução para a prevenção da auto-intoxicação foi radical: a remoção cirúrgica do intestino grosso. Um remédio menos assustador e mais popular, porém, era tentar substituir ou diminuir o número de bactérias putrefactivas no intestino, enriquecendo a microbiota intestinal com populações bacterianas que fermentavam os hidratos de carbono e tinham pouca actividade proteolítica. A administração oral de culturas de bactérias fermentativas iria, foi proposto, “implantar” as bactérias “benéficas” no trato intestinal. As bactérias produtoras de láctico-ácido foram favorecidas como bactérias fermentativas para este fim, já que tinha sido observado que a fermentação natural do leite por estes micróbios impedia o crescimento de bactérias não tolerantes a ácido, incluindo espécies proteolíticas. Se a fermentação láctica impedisse a putrefação do leite, não teria o mesmo efeito no trato digestivo se fossem usadas bactérias apropriadas? Os europeus orientais, alguns dos quais aparentemente de longa duração, consumiram produtos lácteos fermentados como parte da sua dieta diária (40, 41). Isto foi tomado como prova de eficácia, e o leite fermentado com o “bacilo búlgaro” de Metchnikoff, posteriormente gozou de alguma voga na Europa Ocidental: o nascimento dos probióticos. Primeiro cunhado num contexto completamente diferente por Lilley e Stillwell (34) para descrever substâncias secretadas por um tipo de microorganismo que estimulavam o crescimento de outro (probiótico para contrastar com antibiótico), o termo “probiótico” foi posteriormente usado para descrever “organismos e substâncias que contribuem para o equilíbrio microbiano intestinal” (44). A definição de Fuller (13), “um suplemento alimentar microbiano vivo que afeta beneficamente o animal hospedeiro, melhorando seu equilíbrio intestinal”, tem sido amplamente utilizada. “Microrganismos vivos que ao serem ingeridos em certos números exercem benefícios à saúde além da nutrição geral inerente” (20), assim como a formulação “Probióticos contêm células microbianas que transitam pelo trato gastrointestinal e que, ao fazê-lo, beneficiam a saúde do consumidor” (63). Portanto, também tem o seguinte: “microorganismos vivos definidos, administrados em quantidades adequadas que conferem um efeito fisiológico benéfico ao hospedeiro” (49); “microorganismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, conferem um benefício à saúde do hospedeiro” (52); e “preparações de células microbianas ou componentes de células microbianas que têm um efeito benéfico à saúde e ao bem-estar do hospedeiro” (51).

Produtos microbianos, muitos dos quais contêm lactobacilos, são ativamente promovidos pelas indústrias de laticínios, alimentos e “autocuidados com a saúde” e têm sido aceitos de forma acrítica pelos cientistas alimentares, bem como pelo público em geral. Entretanto, as alegações da eficácia dos probióticos em relação aos benefícios à saúde humana não resultam de avaliações rigorosas e imparciais, como seria exigido pela Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos para produtos farmacêuticos (60). Em outras palavras, estas alegações não foram submetidas às quatro fases habituais de avaliação da eficácia (47).

A visão de Metchnikoff de que o consumo de células bacterianas em alimentos alteraria as proporções em que certas populações estavam presentes na microbiota intestinal ignorou uma das forças mais poderosas da natureza: a homeostase. Em termos simples, a homeostase é a força na natureza pela qual, embora tudo mude, tudo permanece igual (2). A homeostase das comunidades bacterianas é representada por um estado estável que é gerado pelos próprios organismos. A competição por nutrientes e espaço, a inibição de um grupo pelos produtos metabólicos de outro grupo, a predação e o parasitismo contribuem para a regulação das populações em determinadas proporções, uma para a outra. Como todos os nichos ecológicos são preenchidos em uma comunidade bacteriana regulada, é extremamente difícil para micróbios alóctones (formados em outro lugar), acidental ou intencionalmente introduzidos em um ecossistema, se estabelecerem. Este fenómeno é referido como “exclusão competitiva” (2). As bactérias recentemente introduzidas não têm forma de ganhar a vida no ecossistema, uma vez que todos os nichos possíveis já foram preenchidos. A composição da microbiota intestinal humana, como demonstrado pelo exame das amostras fecais, tem uma estabilidade notável (58, 69). A impressão digital genética (perfis eletroforéticos em gel de desnaturação) desta comunidade bacteriana permaneceu constante nas amostras coletadas durante estudos de longo prazo, mesmo de 18 meses de duração (63). Para muitos dos humanos que foram estudados, esta estabilidade estendeu-se para além dos géneros e espécies, até ao nível das estirpes bacterianas (30, 37). A exclusão competitiva é relevante para a introdução de bactérias probióticas no intestino. Estas células bacterianas são alóctones para a comunidade bacteriana do intestino, e como demonstrado em vários estudos, têm apenas uma existência transitória no ecossistema intestinal (1, 11, 54, 57, 63). Para tomar como exemplo um estudo, Lactobacillus rhamnosus DR20 foi administrado diariamente em leite a sujeitos humanos durante 6 meses (63). A estirpe probiótica foi detectada apenas enquanto o produto probiótico continuava a ser consumido. Uma vez cessado o consumo do produto probiótico, também cessou a excreção das bactérias nas fezes. Além disso, os níveis da cepa probiótica eram relativamente baixos (105 a 106 organismos por grama de fezes), e só foi detectada irregularmente em amostras coletadas de cerca de 40% dos indivíduos que tinham populações de Lactobacillus pré-existentes e estáveis residentes em suas entranhas. O resto dos sujeitos não tinham populações estáveis de Lactobacillus, e a cepa probiótica pôde ser detectada em todas as suas amostras fecais durante o período de consumo probiótico, porque as células probióticas não foram superadas pelas dos lactobacilos residentes.

Os lactobacilos loquótonos são comumente introduzidos no ecossistema intestinal porque são onipresentes na natureza. Eles são parte da microbiota de muitos alimentos, e estas espécies de Lactobacilus derivadas de alimentos podem ser detectadas transitória e imprevisivelmente nas fezes humanas (7, 66). Em contraste, como já foi dito, uma proporção de indivíduos humanos abriga lactobacilos autóctones (formados onde encontrados) (63). Primeiro postulado em relação ao ecossistema intestinal por Dubos e colegas (9), o conceito de autóctone foi posteriormente definido por Dwayne Savage: “Os micróbios autóctones são caracterizados como microorganismos indígenas que colonizam regiões particulares do trato no início da vida, multiplicam-se a níveis populacionais elevados logo após a colonização, e permanecem nesses níveis ao longo da vida de animais saudáveis e bem nutridos. Os microrganismos autóctones devem ser encontrados essencialmente em todos os indivíduos de uma determinada espécie animal, independentemente da sua localização geográfica” (56).

Como resultado de uma reflexão adicional sobre as observações feitas em estudos recentes da ecologia Lactobacillus, a seguinte definição concisa poderia ser proposta: “Uma espécie autóctone tem uma associação a longo prazo com uma determinada espécie hospedeira, formando uma população estável de tamanho característico numa determinada região do intestino, e tem uma função ecológica demonstrável”. Esta definição poderia ser considerada como uma hipótese de trabalho e uma base para discussão posterior.

Autochthonous Lactobacillus species can be clearly identified in the case of broiler chickens raised under commercial conditions (19, 31). Os Lactobacilli se estabelecem nas culturas das aves logo após a eclosão e persistem durante toda a vida do hospedeiro, apesar da administração comum de medicamentos antimicrobianos na ração das aves (associação a longo prazo com uma determinada espécie hospedeira). Pelo menos algumas estirpes de Lactobacillus aderem ao epitélio da cultura e proliferam para formar um biofilme. As atividades metabólicas dos lactobacilos que persistem desta forma influenciam o pH do digesta, o que, por sua vez, inibe a proliferação de enterobactérias (função ecológica demonstrável) (14). A partir deste local, as células Lactobacilus fornecem um inóculo do digesta, que é então rico em lactobacilos em todo o restante do intestino (populações estáveis de tamanho característico) (14, 31). Uma proporção importante da microbiota do conteúdo ileal, por exemplo, é composta por lactobacilos (35). Além disso, a sucessão de espécies é detectável dentro da população total de Lactobacillus do intestino de galinha. Enquanto os membros do grupo Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus reuteri são colonizadores precoces, Lactobacillus salivarius é detectado consistentemente apenas em aves mais velhas (19, 31). A regulação mecanicista desta sucessão seria fascinante de estudar, pois parece que o condicionamento prévio do habitat por outros lactobacilos, ou por mudanças na fisiologia ou composição alimentar das galinhas, é necessário para que L. salivarius se estabeleça e persista no intestino das aves. Uma sucessão semelhante de Lactobacillus ocorre no cultivo e no íleo, sugerindo que a colonização do cultivo determina a composição da microbiota da digesta ileal em relação à população de Lactobacillus.

L. reuteri é autóctone ao intestino do roedor, como evidenciado pelos fatos de ter sido detectado ali em vários estudos; adere ao epitélio não-secreto do forestomach, formando assim um biofilme; persiste em níveis populacionais constantes ao longo da vida nas entranhas de ratos anteriormente livres de Lactobacillus inoculados pela boca com uma cultura pura em uma única ocasião; e influencia a bioquímica intestinal pequena (23, 38, 42, 64, 67). L. reuteri e o ecossistema intestinal dos ratos fornecem, portanto, um excelente paradigma para o estudo da base molecular da autóctone. Na última década, as tecnologias de armadilhagem promotora foram desenvolvidas para superar a limitação dos modelos in vitro para o estudo das características que melhoram o desempenho ecológico em ecossistemas complexos. Por exemplo, a tecnologia de expressão in vivo (IVET) foi desenvolvida por Mahan e colegas de trabalho para estudar a expressão gênica por Salmonella enterica serovar Typhimurium durante a infecção de camundongos (36). A IVET também tem sido usada para identificar em genes induzidos pela vivo-indução (ivi) para vários outros patógenos, e mutações dentro de um subconjunto destes genes ivi resultaram em uma diminuição da virulência (46). O IVET identificou recentemente a linhagem L. reuteri 100-23 genes que foram especificamente induzidos no intestino murino (65). Um sistema baseado em plasmídeos foi construído contendo ′ermGT (que confere resistência à lincomicina) como o gene principal repórter para seleção de promotores ativos nas entranhas de camundongos tratados com lincomicina. Um segundo gene repórter, ′bglM (que codifica a beta-glucanase), permitiu a diferenciação entre promotores constitutivos e promotores vivo-inducíveis. A aplicação do sistema IVET usando L. reuteri e ratos anteriormente livres de Lactobacillus revelou três genes induzidos especificamente durante a colonização. Sequências mostrando homologias à xilose isomerase (xylA) e metionina sulfóxido redutase (msrB) foram detectadas. O terceiro locus mostrou homologia a uma proteína de função desconhecida. A xilose é um açúcar derivado de plantas comumente encontrado na palha e no farelo e é introduzido no intestino através dos alimentos. A xilose no intestino pode ser derivada da hidrólise de xilanos e pectinas por outros membros da microbiota intestinal. A expressão seletiva da xilose isomerase sugere que L. reuteri 100-23 satisfaz suas necessidades energéticas no intestino pelo menos parcialmente pela fermentação da xilose ou isoprimeverose (o componente principal dos xiloglucanos) (4). A metionina sulfóxido redutase é uma enzima reparadora que protege as bactérias contra danos oxidativos causados por azoto reactivo e intermediários de oxigénio. O óxido nítrico é produzido pelas células epiteliais do íleo e do cólon e possivelmente atua como uma barreira oxidativa, mantendo a homeostase intestinal, reduzindo a translocação bacteriana e fornecendo um meio de defesa contra patógenos (25, 50). Este estudo IVET pioneiro mostrou a utilidade da tecnologia na investigação da base molecular da autoctonia e identificou propriedades bacterianas que podem ser essenciais para a persistência de L. reuteri no intestino (65). De facto, existe agora um forte argumento a favor da realização de comparações genómicas entre L. reuteri 100-23 e uma estirpe da mesma espécie que não coloniza o intestino murino. A estirpe 100-23 tem claramente propriedades que lhe permitem formar um biofilme e persistir no epitélio forestomach dos ratos. Além disso, esta estirpe pode ser manipulada geneticamente e irá expressar genes heterólogos introduzidos in vitro (por electrotransformação) ou por transferência horizontal de genes para o ecossistema intestinal (24, 38). Comparações genômicas das cepas de L. reuteri em relação aos fenômenos ecológicos aos quais estão associados no intestino murino poderiam revelar as bases moleculares da autoctonia.

Foi a esperança de alguns microbiologistas que os lactobacilos pudessem ser geneticamente modificados para que suas células produzissem substâncias de valor biotecnológico, e talvez terapêutico. Em vez de utilizar estas bactérias recombinantes em fermentadores industriais, o objectivo tem sido o de utilizar as células bacterianas no intestino como fábricas in situ que entregariam uma substância bioactiva a uma determinada região do intestino (39). Este trabalho tem sido prejudicado pelo uso de espécies alóctones de lactobacilos, resultando em poucos progressos na realização do objetivo geral. O reconhecimento de espécies autóctones associadas a diferentes hospedeiros de animais torna mais provável que lactobacilos recombinantes que terão pelo menos alguma probabilidade de metabolizar, e talvez persistindo, no intestino possam ser produzidos. O trabalho de Lee e colegas, no qual lactobacilos vaginais recombinantes que sintetizaram e secretaram os dois primeiros domínios do CD4 humano foram desenvolvidos e mostrados in vitro para bloquear competitivamente a infecção de células-alvo pelo vírus da imunodeficiência humana, fornece um bom exemplo de abordagem racional para este tipo de pesquisa (5). Embora uma espécie de Lactobacillus autóctone tenha sido utilizada nestas experiências, se as bactérias recombinantes têm a capacidade de persistir após a instilação em vaginas permanece especulativa.

As interacções dos lactobacilos com os seus hospedeiros e o seu impacto nas características do hospedeiro continuam a fascinar os microbiologistas (59). Pistas sobre as influências das bactérias no hospedeiro do mamífero foram obtidas a partir de comparações das características bioquímicas e fisiológicas de ratos sem germes e convencionais, mas pesquisas comparativas deste tipo podem agora ser realizadas a um nível sofisticado devido ao advento do sequenciamento genômico de animais e a conseqüente fabricação de microarrays de DNA que apresentam sequências representativas de todo o genoma do animal. O potencial de obtenção de conhecimento excitante das influências mecanicistas da microbiota no hospedeiro por esta abordagem tem sido demonstrado pelo trabalho pioneiro de Hooper e colegas, que estudaram o impacto da colonização de ratos anteriormente sem germes por Bacteroides thetaiotaomicron (26). Mas as experiências de monoassociação com ratos anteriormente livres de germes não são representativas do que ocorre no ecossistema natural. Uma única estirpe bacteriana que coloniza o intestino de um gnotobiote geralmente atinge um nível populacional muito mais elevado do que num animal convencional, onde o micróbio é confrontado com uma intensa competição dos outros membros da microbiota. As diferenças fisiológicas entre animais livres de germes e animais convencionais também podem influenciar os padrões de colonização. O efeito de lavagem da motilidade do intestino delgado confina as bactérias ao íleo terminal mais estático ou ao intestino grosso dos animais convencionais, mas esta restrição desaparece no animal monoassociado devido ao peristaltismo mais lento característico do hospedeiro gnotobiótico (18). Além disso, no complexo ecossistema convencional, a regulação para cima ou para baixo da expressão do gene hospedeiro induzida pela presença de uma espécie bacteriana poderia ser negada pelo impacto de outra espécie (26). Assim, uma visão mais ecológica favoreceria o abandono da abordagem aditiva (animal livre de germes mais espécies bacterianas) e a adoção de uma abordagem subtrativa (animal convencional menos espécies bacterianas). Ratos que ainda não possuem lactobacilos são colonizados por uma microbiota complexa funcionalmente equivalente à dos ratos convencionais e parecem oferecer o modelo ideal para determinar o impacto dos lactobacilos alóctones e autóctones na regulação da expressão dos genes hospedeiros (61).

De um ponto de vista pragmático, o impacto do metabolismo de Lactobacillus na nutrição e fisiologia dos animais de criação é uma importante área de estudo. Embora os medicamentos antimicrobianos tenham sido adicionados aos alimentos dos animais de criação por várias décadas, desconhece-se o mecanismo preciso pelo qual a taxa de crescimento do animal é aumentada e a conversão alimentar é melhorada. Feighner e Dashkevicz relataram que a suplementação antimicrobiana dos alimentos de frangos de carne resultou na diminuição da atividade da hidrolase biliar no íleo das aves (12). Esta pode ter sido uma observação particularmente importante porque, pelo menos entre os membros da microbiota intestinal dos ratos, os lactobacilos são responsáveis por grande parte desta actividade enzimática (62, 64). As hidrolases de sal biliar catalisam a clivagem de um aminoácido do núcleo esteróide dos sais biliares conjugados. Não está claro porque é que os lactobacilos produzem uma enzima com esta propriedade, porque eles não ganhariam energeticamente do processo de desconjugação, mas pode ser uma propriedade essencial permitindo que as bactérias sobrevivam ao trânsito através do intestino delgado, no qual concentrações relativamente altas de ácidos biliares conjugados são libertadas (8). A actividade de desconjugação dos lactobacilos pode ser importante para o hospedeiro, porque os sais biliares desconjugados são menos eficazes na emulsificação dos lípidos dietéticos e na formação de micelas. Assim, a atividade de hidrolase de sal biliar dos lactobacilos no intestino delgado pode prejudicar a digestão e absorção dos lipídios pelo hospedeiro e pode ter implicações nas indústrias avícola e suína, onde o crescimento rápido e a conversão alimentar eficiente são necessários para a rentabilidade. Muita atenção tem sido dada recentemente à filogenia da microbiota intestinal, mas pouca tem sido dada à fisiologia microbiana de comunidades bacterianas complexas ou seus componentes individuais (16, 17, 32, 33, 35, 68). Chegou o momento de corrigir este desequilíbrio. Lactobacilos poderiam fornecer modelos de bactérias para tais estudos fisiológicos porque sua relação com o hospedeiro do animal de criação (galinhas, porcos) é muito melhor definida do que a de outros membros da microbiota (3, 14, 19).

Uma grande proporção das células imunológicas do corpo estão associadas ao intestino. No hospedeiro saudável, a presença da microbiota é tolerada pelo sistema imunológico, embora os mecanismos envolvidos não sejam conhecidos com precisão (10). No entanto, pode-se inferir que existe tolerância à microbiota, pois pacientes humanos com doenças inflamatórias intestinais e animais experimentais com sistemas imunológicos disfuncionais sofrem de inflamação crônica, imuno-mediada da mucosa intestinal (45, 53). Muitas evidências apontam para a presença da microbiota como o combustível para esta inflamação ardente. A relação do sistema imunitário microbiano autóctone em animais saudáveis deve, portanto, ser de tolerância e requer investigação mecanicista. A relação sistema micróbiota-imune alóctone é presumivelmente bastante diferente, pelo menos inicialmente, porque o sistema imunitário irá experimentar novos complexos antigénicos com cada encontro com uma estirpe bacteriana diferente. Encontros próximos contínuos com a mesma estirpe, seja ela serendípita (microbiota alimentar) ou intencional (probiótica), podem, supõe-se, eventualmente gerar tolerância. Os lactobacilos têm demonstrado invocar respostas de células imunes, mas muitas das pesquisas relatadas não conseguiram estabelecer uma consequência natural para o hospedeiro de tais respostas caso elas ocorram in vivo (6, 21, 27, 43). Especificamente, não temos medidas do impacto dos lactobacilos no sistema imunológico de humanos saudáveis na comunidade com respeito à resistência à doença, além de estudos preliminares sobre a prevalência de diarréia em grupos de alto risco (48). Embora os probióticos pareçam não ter um efeito importante na alteração da composição da microbiota intestinal, eles podem ter um papel na manipulação do sistema imunológico em relação a doenças específicas que têm uma etiologia imunológica, tais como doenças inflamatórias intestinais e alergias. Deve-se ressaltar que os relatos ticiosos que surgiram a esse respeito são relatos de pequenos estudos emanados de grupos únicos de pesquisa (15, 29). Quando estão envolvidos resultados médicos, há necessidade de grandes e abrangentes ensaios para provar a eficácia em grupos de pacientes muito bem definidos, em localizações geográficas variadas com diferentes misturas étnicas e valores culturais.

Lactobacilos oferecem claramente aos microbiologistas perspectivas de pesquisa estimulantes, tanto para aplicações biomédicas como para adquirir conhecimentos fundamentais sobre o funcionamento das células bacterianas no ecossistema intestinal. Como modelos de bactérias intestinais, eles podem fornecer lições sobre os mecanismos moleculares que definem a autoctonia, bem como na compreensão da fisiologia bacteriana em relação ao bem-estar do hospedeiro. Por estas razões, os lactobacilos são os preferidos de muitos microbiologistas.