Diskrétní model

Růst mikrobiální kolonie, která spotřebovává difundující živinu, je znázorněn pomocí mřížkového modelu zavedeného Matsuurou23, jehož podrobnosti jsou uvedeny v části 3. Stručně řečeno, uvažujeme obdélníkovou mřížku s L x a L y místy ve směru x, resp. y. V tomto případě se jedná o mřížku s L x a L y místy. Počet obsazených buněk se označuje ν s odpovídající hustotou buněk ρ = ν/(L x L y ). Každý prvek obdélníkové mřížky může obsahovat nejvýše jednu buňku, ale může obsahovat libovolný nezáporný celočíselný počet živných částic bez ohledu na to, zda se v daném místě nachází také buňka. V každém časovém kroku mohou kvasinkové buňky absorbovat živnou částici umístěnou ve stejném místě a vytvořit jednu dceřinou buňku v sousedním místě v kardinálním směru, zatímco živné částice mohou udělat s kroků, opět v kardinálních směrech. Jako počáteční podmínka jsou buňky v mřížce rozmístěny v předepsaném vzorci, zatímco určitý počet živných částic je v doméně rozmístěn rovnoměrně a náhodně, aby se dosáhlo stanovené průměrné počáteční koncentrace c0. Hranice domény se považují za pevné stěny, což kopíruje experimentální chování v Petriho misce. Důležité je, že vzory vytvořené tímto modelem jsou výsledkem interakce mezi buňkami a samotnou živinou, takže veškeré nejednotné morfologie vytvořené modelem lze připsat výhradně DLG.

Charakteristické morfologie DLG

Matsushita & Fujikawa12 použil kolonii B. subtilis k ilustraci tří klíčových jevů, které vznikají v důsledku DLG: (I) „stínění“ kratších větví delšími, (II) odpuzování mezi sousedními koloniemi a (III) růst směřující ke zdroji živin (obr. 2). Již dříve bylo prokázáno, že tyto vlastnosti vznikají pouze v důsledku DLG, a to za použití mřížkového modelu růstu kolonií podobného tomu, který byl použit zde30. Nejprve potvrdíme, že výše popsaný diskrétní model může reprodukovat toto chování, a teprve poté tento model použijeme ke kvantifikaci vzniklých vzorců.

Experimentální výsledky podle Matsushita & Fujikawa12 (horní řádek) s odpovídajícími modelovými simulacemi (spodní řádek). Zobrazeny jsou (a) větší větve stínící menší větve od živin (jev I), (b) dvě kolonie vyseté blízko sebe, které se zdánlivě odpuzují (jev II), a (c) jediná kolonie rostoucí směrem ke zdroji živin na pravé straně Petriho misky (jev III). Simulace (d) stínících větví, (e) dvou kolonií v těsné blízkosti a (f) růstu s živnou půdou na pravé straně jsou vypočteny pomocí modelu založeného na mřížce. Semenné buňky jsou označeny červenou tečkou. Simulace byly vypočteny na mřížkách o rozměrech L x = L y = 200 s parametry s = 3 a c0 = 1, což vede k hodnotě Δ stejného řádu jako v experimentech. Obrázky 2(a), 2(b) a 2(c) jsou přetištěny z Physica A: Statistical Mechanics and its Applications, 168, Mitsugu Matsushita a Hiroshi Fujikawa, Diffusion-limited growth in bacterial colony formation, 498-506, 1990, se souhlasem Elsevier.

Interakci mezi buňkami a živinou lze obecně kvantifikovat porovnáním relativní rychlosti šíření těchto dvou veličin. Růst kolonie se měří výpočtem průměrné rychlosti změny plochy kolonie Δ m při pohledu shora, která má stejné jednotky jako difuzivita. Tuto veličinu lze snadno vypočítat z experimentálního snímku nebo ze simulovaných dat, jako jsou data vytvořená diskrétním modelem. Rozptyl živiny Δ n se považuje za difuzivitu glukózy, protože ta se běžně používá jako zdroj živin a mezi difuzivitou různých živin je malý rozdíl. Na základě experimentálních pozorování je známo, že difuzivita glukózy ve vodě je přibližně \({D}_{0}=4,03\krát {10}^{-2}\)mm2 min-136 . Pro glukosu v agarózovém gelu s nízkou hustotou je difuzivita dána vztahem

kde w je hmotnostní procento agaru37. Za předpokladu, že w = 0,3 %, je difuzivita 4,01×10-2 mm2 min-2 , což je hodnota použitá pro zbytek této studie. Difuzivita se s množstvím agaru mění jen málo, a proto má w na výsledky zanedbatelný vliv. Z těchto veličin vypočítáme poměr

který poskytuje bezrozměrnou míru relativní rychlosti šíření. Při malých hodnotách Δ se živiny šíří v rychlejším časovém měřítku než růst buněk, což znamená, že jakékoli lokální změny koncentrace živin se rozptýlí, aniž by ovlivnily morfologii kolonie. Hodnota Δ, která je 1 nebo vyšší, znamená, že růst buněk probíhá alespoň takovou rychlostí, jakou se šíří živina, a lokální změny koncentrace živiny mohou mít vliv na morfologii kolonie. Ze tří experimentálních snímků má pouze snímek usměrněného růstu dostatek informací o měřítku i čase potřebném k výpočtu Δ. Na základě tohoto snímku jsme zjistili, že Δ ≈ 0,23. Nastavení s = 3 a c0 = 1 v modelu dává řešení s hodnotami Δ mezi 0,3 a 0,5, což je řádově stejné jako experimentální výsledky, a poskytuje tak vhodné srovnání. Tyto hodnoty parametrů jsou použity ve zbytku této podkapitoly. Chování v každém ze tří případů je dále kvantifikováno pomocí prostorových indexů, které jsou popsány níže, podobně jako v přístupu Bindera a kol.38. Každá simulace používá mřížku o rozměrech L x = L y = 200, která je dostatečně velká na to, aby vytvořila rysy s dostatečným rozlišením a zároveň byla výpočetně efektivní.

Pro zkoumání stínění větví (jev I) je živina rovnoměrně náhodně naseta po celé doméně a do středu mřížky je umístěna jedna buňka. Simulace probíhá, dokud celková hustota buněk nedosáhne hodnoty 0,2, což ilustruje reprezentativní kolonie na obr. 2. Tato kolonie se vyznačuje velkými větvemi vycházejícími z místa počáteční centrální buňky a kratšími větvemi mezi nimi, které byly odstíněny od živin většími větvemi, a vykazuje značně nerovnoměrný růst. To odpovídá chování, které pozoroval Matsushita & Fujikawa12. Morfologii lze kvantifikovat tak, že se nejprve spočítají úhly ke každé buňce měřené proti směru hodinových ručiček od nějakého referenčního úhlu s počátkem umístěným ve středu hmoty. Počty se škálují podle očekávaných hodnot pro buňky rovnoměrně náhodně rozložené a úhlový index nerovnoměrného růstu I θ je definován jako směrodatná odchylka škálovaných počtů, takže větší hodnoty I θ znamenají větší míru nerovnoměrného růstu. Experimentální obraz má index 0,18, zatímco simulace má index 0,2, což naznačuje, že oba údaje jsou v těsné shodě.

Pro případ odpuzujících kolonií (jev II) je živina opět rozmístěna rovnoměrně náhodně po celé doméně. Dvě semenné buňky jsou umístěny vertikálně uprostřed domény, každá osminu šířky domény od středu horizontálně, takže buňky jsou od sebe vzdáleny jednu čtvrtinu celkové šířky domény. Simulace se počítá, dokud celková hustota buněk nedosáhne hodnoty 0,2. Typická simulace je znázorněna na obr. 2, kde je zobrazena mezera mezi dvěma koloniemi, kterou pozoroval Matsushita & Fujikawa12. Odpuzující kolonie lze kvantifikovat spočítáním celkového počtu buněk ν a počtu buněk ν c mezi dvěma semennými buňkami na konci simulace. Index odpuzování je pak definován jako I c = 1 – ν c /ν, který je blízký 0,5, když obě kolonie rostou rovnoměrně, menší než 0,5, když se vytvoří mezera, a větší než 0,5, když kolonie vykazují preferenci růstu směrem k sobě. Umístění semenných buněk pro každou kolonii na experimentálním snímku se aproximuje nakreslením čar podél větví a určením míst, kde se tyto čáry protínají. Experimentální snímek a simulace mají indexy 0,19, resp. 0,27, což naznačuje, že oba vytvářejí podobné vzorce růstu s výraznou mezerou mezi dvěma koloniemi.

Směrný růst (jev III) se simuluje tak, že se všechny živné buňky zpočátku umístí do nejpravějšího sloupce domény, přičemž jediná buňka se umístí do jejího středu. Simulace se pak počítá, dokud hustota buněk nedosáhne hodnoty 0,1. Typická kolonie je znázorněna na obr. 2, který se velmi podobá experimentálnímu výsledku Matsushity & Fujikawy12. Pro měření příklonu k jedné straně domény vypočítáme podíl I b buněk na pravé straně domény vzhledem k celkovému počtu buněk tak, že I b ∈ . Hodnoty indexu I b blízké 0,5 znamenají malé vychýlení, zatímco I b < 0,5 znamená vychýlení směrem k pravé straně a I b < 0,5 znamená vychýlení směrem k levé straně. Experimentální obraz má index 0,92, což přesně odpovídá simulačnímu indexu 0,93. V obou případech indexy naznačují velké vychýlení růstu směrem k počátečnímu umístění živin.

Jak zjistili Ginovart a spol.30 , dobré kvalitativní shody mezi experimentálními obrazy a simulacemi ukazují, že samotný DLG může vyvolat stínění, odpuzování a usměrněný růst kolonií B. subtilis. Toto srovnání jsme dále posílili použitím kvantitativního srovnání mezi experimenty a matematickým modelem. Očekáváme tedy, že tyto jevy budou přítomny, pokud DLG ovlivňuje morfologii, zatímco nepřítomnost těchto rysů naznačuje, že za vzor růstu jsou zodpovědné jiné mechanismy. Zásadní je, že shoda mezi diskrétním modelem a modelem navrženým Ginovartem et al. ukazuje, že zde použitý diskrétní model poskytuje uspokojivou reprezentaci DLG, a proto může být použit ke kvantifikaci tohoto chování.

Indukce DLG

Pokud jsme ukázali, že diskrétní model je schopen replikovat chování DLG, kvantifikujeme zde závislost těchto jevů na parametrech modelu, abychom mohli předpovědět, kdy se účinky DLG projeví. Kolonie jsou opět simulovány na mřížce o rozměrech L x = L y = 200 za použití stejných tří počátečních podmínek a kritérií zastavení jako v předchozí podkapitole. Simulace se opakují 50krát pro každou dvojici stupňů živin s = 1, 5, …, 37 a počáteční koncentrace c0 = 1, 2, …, 7. Pro každou dvojici parametrů vypočítáme příslušný průměrný index z 50 realizací.

Pro zkoumání screeningu větví (jev I) uvažujeme kolonie vyrostlé z jedné buňky v jednotném živném poli, přičemž odpovídající hodnoty průměrných indexů \({\bar{I}}_{\theta }\) z 50 realizací jsou uvedeny na obr. 3. Největší hodnoty \({\bar{I}}_{\theta }\) vznikají, když jsou s i c0 malé, což je způsobeno dvěma faktory. Zaprvé, protože difuzivita živin, efektivně s, je malá v poměru k rychlosti růstu buněk, dochází k výkyvům hladin živin v celé doméně. Za druhé, nízká počáteční koncentrace živin c0 znamená, že tyto výkyvy vytvářejí oblasti, ve kterých je hladina živin příliš nízká na to, aby podporovala růst buněk. Pokud je s nebo c0 větší, alespoň jedna z těchto podmínek nemůže nastat a hodnota \({\bar{I}}_{\theta }\) je menší, což znamená, že DLG již nemá na kolonii významný vliv. Tyto výsledky tedy naznačují, že k nerovnoměrným vzorcům může docházet pouze tehdy, když je difuzivita živin vzhledem k rychlosti růstu buněk i koncentrace živin malá.

Měření účinků DLG v simulovaných mikrobiálních koloniích. Všechny simulace jsou vypočteny pomocí modelu založeného na mřížce s použitím rozsahu kroků živin s a počátečních koncentrací živin c0. Zobrazeny jsou (a) průměrný index \({\bar{I}}_{\theta }\) pro stínění větví (jev I), (b) průměrný index \({\bar{I}}_{c}}) pro odpuzování kolonií (jev II) a (c) průměrný index \({\bar{I}}_{b}}) pro usměrněný růst (jev III).

Podobné chování je pozorováno pro odpuzující případ (jev II), jak je patrné z průměrného indexu \({\bar{I}}_{c}\) vyneseného na obr. 3. Největší hodnoty indexu se vyskytují při malých hodnotách s a c0, k čemuž dochází ze stejných důvodů jako u \({\bar{I}}_{\theta }\).

Chování pro směrovaný růst (jev III) je odlišné, jak je patrné z průměrného indexu \({\bar{I}}_{b}} zobrazeného na obr. 3. Při malých hodnotách s je index \({\bar{I}}_{b}\) velký a málo se mění s c0. S rostoucím s se \({\bar{I}}_{b}}) snižuje a vykazuje větší závislost na c0, přičemž při nižších c0 jsou hodnoty \({\bar{I}}_{b}} větší. Rozsah hodnot parametrů, v němž lze pozorovat usměrněný růst, je mnohem větší než u ostatních dvou jevů DLG. Pokud se tedy usměrněný růst nevyskytuje, pak se nevyskytují ani ostatní dvě vlastnosti, a proto usměrněný růst poskytuje užitečnou první kontrolu DLG, kterou lze jednoduše měřit. Tento rys bude používán k testování DLG v celém dalším průběhu této práce.

Kontinuální model

Vznik jevů DLG závisí jak na koncentraci živin, tak na difuzivitě obou druhů. Zatímco indexy měří závislost těchto jevů na počtu diskrétních kroků živin s a počáteční koncentraci živin c0, hodnotu Δ bylo možné pouze vypočítat ze simulovaných dat, nikoli zadat jako vstup do modelu. Při posuzování experimentálních údajů je však přirozené charakterizovat relativní rozšíření buněk a živin pomocí Δ, protože to lze snadno změřit z experimentálních snímků. Zde zavádíme deterministický systém reakčně-difúzních rovnic, který modeluje hustotu buněk a koncentraci živin a umožňuje specifikovat relativní difuzivitu každé veličiny, což je ekvivalentní nastavení Δ. Ačkoli tento model není vhodný pro zachycení jemných rysů pozorovaných na obr. 2, je schopen reprodukovat cílený růst směrem ke zdroji živin (jev III), který se objevil v největším rozsahu parametrů. Zaměříme se proto na tento aspekt DLG, který působí jako snadno měřitelný příznak toho, že k DLG dochází.

Uvažujeme jednorozměrnou oblast, která je dostatečná pro ilustraci obecného chování modelu29,32,39 . Při použití bezrozměrné polohy x, času t, hustoty buněk n(x,t) a koncentrace živin g(x, t), popsaných v části 3, se řídící rovnice redukují na

Parametr D = D m /D n je poměr difuzivity buňky D m k difuzivitě živiny D n . Jedná se o podobnou definici jako v případě Δ (2), kdy se místo naměřené rychlosti změny plochy kolonie používá buněčná difuzivita. První člen na pravé straně obou rovnic představuje příspěvek difuze, zatímco druhé členy představují spotřebu živiny a růst nových buněk, přičemž c je bezrozměrné množství živiny spotřebované na jednu novou buňku.

Jako počáteční podmínky jsou buňky umístěny ve středu domény se sklonem živin doprava podle

kde N lze interpretovat jako bezrozměrnou koncentraci živin. Pro ilustraci obecného chování jsou počáteční podmínky pro N = 1 uvedeny na obr. 4.

Výsledky z jednorozměrného reakčně-difuzního modelu. (a) Počáteční stav pro N = 1 ukazuje buňky soustředěné ve středu domény s živinami vpravo. (b) Maximální hodnoty I b do času t = 1, vynesené proti logaritmu D a N o základu 10, naznačují, že k DLG dochází pouze při určitých hodnotách parametrů. Dva reprezentativní příklady jsou vyznačeny. (c) Při největší hodnotě I b, kdy D = 10-6 a N = 1, jsou buňky stále téměř symetrické kolem x = 0, zatímco koncentrace živin se stala fakticky rovnoměrnou. (d) Při použití D = 10-0,5 a N = 105 dochází k výraznému vychýlení směrem k pravé straně, kde byla živina původně koncentrovaná.

Přijmeme-li typické hodnoty parametrů uvedené v oddíle 3 jako pevné, hodnota N se mění pouze v důsledku fyzikální koncentrace živin. Uvažujeme-li médium obsahující pouze živiny, které představují maximální koncentraci, zjistíme, že hodnota N nemůže být větší než přibližně 105. Uvažujeme-li médium obsahující pouze živiny, které představují maximální koncentraci, zjistíme, že hodnota N nemůže být větší než přibližně 105. Řešení se tedy počítá pro 1 ≤ N ≤ 105. Zatímco typická experimentální pozorování naznačují, že 10-3 ≤ D ≤10-1, uvažujeme hodnoty pro 10-6 ≤ D ≤103, abychom teoreticky posoudili, jak se chování mění s D. Pro různé hodnoty těchto parametrů vypočítáme maximální hodnotu I b pozorovanou do času t = 1. To odpovídá přibližně 119 dnům růstu, což je sice více než typické experimentální doby, ale zajišťuje to, že maximální hodnota I b je pozorována během simulace. Vypočtené indexy I b jsou vyneseny na obr. 4 s použitím logaritmického měřítka v základu 10 pro obě osy. Pro log(N) < 1 je zkreslení růstu buněk měřeného pomocí I b malé nebo žádné. Při větších hodnotách N závisí velikost pozorovaného vychýlení na hodnotě D, přičemž maximum nastává v blízkosti (D,N) = (1, 105). Tato hodnota D odpovídá stejným difuzním rychlostem buněk a živin a kolem této hodnoty je možné pozorovat zkreslení růstu pro hodnoty N již od 101,5 . Za typických experimentálních podmínek má N řádovou velikost 2, což naznačuje, že účinky DLG lze s největší pravděpodobností pozorovat, když se D blíží jednotce.

Rozsah chování je dále ilustrován zvážením rozdělení ze dvou kontrastních příkladů. V každém případě je zobrazeno řešení v čase odpovídajícím maximálnímu vychýlení buňky. V případě D = 10-6 a N = 1, znázorněném na obr. 4, se koncentrace živin stala účinně rovnoměrnou dříve, než hustota buněk mohla vyvinout zjevné vychýlení směrem k pravé straně, kde byly živiny původně koncentrovány. Naproti tomu při D = 10-0,5 a N = 105, což je rovněž znázorněno na obr. 4, buňky vykazují zjevnou preferenci směrem k pravé straně domény.

Analýza modelu kontinua naznačuje, že pokud \(D\ll 1\), pak se usměrněný růst, a tedy jakýkoli efekt DLG, projeví pouze při hodnotách N nejméně 103. Protože odhady ukazují, že N má řádově 2, naznačuje to, že DLG bude pozorován pouze tehdy, když se D bude blížit jednotce, jak je patrné z obr. 4. To lze také ilustrovat pomocí fyzikálních parametrů. Při použití hodnot parametrů uvedených v oddíle 3 by mikrobi s difuzivitou \({D}_{m}=3\times {10}^{-2}\)mm2 min-1 umístění v prostředí s maximální počáteční koncentrací živin \({N}_{0}\mathrm{=3,8}\times {10}^{-3}\)g mm-2 odpovídali přibližně bezrozměrným hodnotám D = 0,75 a N = 104. Z obr. 4 by se dalo očekávat, že tento druh poroste směrem ke zdroji živin, a bude tedy vykazovat DLG chování. Pokud by se stejní mikrobi dostali do prostředí s maximální koncentrací živin \({N}_{0}\mathrm{=3,8}\krát {10}^{-6}\)g mm-2, hodnota N by klesla na 10 a zaujatý růst by již nebyl pozorován. Výsledky tohoto oddílu tedy poskytují rámec pro určení, kdy se očekává DLG pouze na základě odhadů D a N.

Experimentální srovnání

Po prozkoumání modelových předpovědí je nyní použijeme k určení dominantního mechanismu růstu v mikrobiálních koloniích. Uvažujeme tři reprezentativní experimentální příklady uvedené na obr. 1: dvě kolonie bakterie B. subtilis a jednu kolonii S. cerevisiae. Protože neznáme vhodnou hodnotu difuzního poměru D, kterou vyžaduje reakčně-difuzní model, je růst místo toho charakterizován relativním šířením Δ (2). Tento parametr představuje poměr průměrné rychlosti změny plochy kolonie při pohledu shora k difuzivitě glukózy a lze jej měřit ze snímků. Vzhledem k tomu, že živina je rovnoměrně rozložena a roste pouze jedna kolonie, očekává se, že případná DLG se v těchto příkladech projeví jako nepravidelný růst s větvením (jev I).

Vypočtené hodnoty rychlosti růstu Δ m jsou uvedeny v tabulce 1 spolu s odpovídajícími relativními rychlostmi Δ. Tyto hodnoty ukazují, že kolonie B. subtilis rostou o dva řády rychleji než kolonie kvasinek a o jeden řád pomaleji než difuzivita glukózy. Použití typických hodnot počáteční koncentrace živin naznačuje, že experimenty odpovídají hodnotě N, která má řád 2. Srovnání tohoto odhadu a hodnot Δ s modelovými výsledky z obr. 4 naznačuje, že B. subtilis odpovídá režimu, ve kterém dojde k usměrněnému růstu v důsledku DLG. Vzhledem k tomu, že tento odhad byl proveden na základě měření rychlosti proliferace buněk p v kolonii S. cerevisiae, která je pravděpodobně menší než odpovídající hodnota pro bakterie, očekává se, že se jedná o podhodnocený odhad N a větší hodnota N zvyšuje pravděpodobnost pozorování DLG. Naproti tomu kolonie S. cerevisiae má Δ s řádovou hodnotou -3, což naznačuje, že živina difunduje v mnohem rychlejším časovém měřítku než růst buněk. V důsledku toho se očekává, že jakékoli lokální změny koncentrace živin se rozptýlí dříve, než ovlivní morfologii kolonie. To naznačuje, že morfologie není ovlivněna DLG. Navzdory velké podobnosti mezi tvary bakteriálních a kvasinkových kolonií v prostředí s nízkým obsahem živin jsou tedy tyto dvě morfologie způsobeny odlišnými jevy. Bakteriální kolonie rostou v dostatečně rychlém časovém měřítku, takže difúze živin může růst omezit, což vede k nepravidelnému vzoru. Mnohem pomalejší růst kolonií kvasinek znamená, že nemůže dojít k DLG a místo toho musí být nerovnoměrná morfologie kolonií vznikající v prostředí s nízkým obsahem živin způsobena pouze pseudohyfálním růstem.

Další potvrzení těchto výsledků jsme hledali testováním usměrněného růstu (jev III) v koloniích S. cerevisiae, napodobujícím uspořádání použité Matsushitou & Fujikawou12 a v simulacích40. Petriho miska byla naplněna syntetickou nízkoamonnou dextrózou (SLAD) s živinou umístěnou uprostřed Petriho misky. Kvasinkové buňky byly nasazeny v různých vzdálenostech od středu a po 16 dnech růstu byly vyfotografovány. Další podrobnosti o experimentu jsou uvedeny v oddíle 3. Jako omezená živina byla použita glukóza i síran amonný, přičemž reprezentativní snímky pro každou z nich jsou uvedeny na obr. 5. Snímky jsou orientovány tak, že střed Petriho misky, kam byla umístěna živina, je na pravé straně. Difuzivita amoniaku ve vodě je přibližně 9,84 × 10-2 mm2 min-1 41 . Jelikož se jedná o stejný řád jako difuzivita glukózy, očekává se, že každý zdroj živin bude mít za následek podobnou hodnotu Δ. Ani jedna z kolonií nevykazuje znatelnou odchylku v růstu v žádném směru a obě vytvářejí indexy odchylky I b téměř přesně rovné 0,5. Efektivní difuzivity Δ m a bezrozměrné difuzivity Δ pro každý pokus jsou uvedeny v tabulce 2. V obou případech má Δ řádovou hodnotu -3, což naznačuje, že usměrněný růst by neměl být pozorován, a souhlasí s výsledky předchozích pokusů.

Obrázky z pokusů s usměrněným růstem pomocí S. cerevisiae. Obrázky jsou orientovány tak, že příslušná živina je na pravé straně kolonie, jak je uvedeno ve svislém textu. Kolonie byly pěstovány na (a) SLAD-G s přídavkem glukózy vpravo a (b) SLAD-N s přídavkem síranu amonného vpravo. Měřítka představují 5 mm.

Další důkaz o způsobu růstu poskytuje chování při okraji kolonií. Jsou zde zřetelné známky nerovnoměrného růstu kolem hranice kolonie pěstované na SLAD-N, ale ne na kolonii pěstované na SLAD-G. Pokud by tento vzorec byl způsoben DLG, očekávali bychom podobné chování na obou médiích. Je však známo, že diploidní kvasinky, jako je kmen AWRI796 použitý v tomto experimentu, přecházejí při nedostatku dusíku2 , jako je SLAD-N, na pseudohyfální růst. To naznačuje, že nerovnoměrný růst pozorovaný u kolonií kvasinek, jak je znázorněno na obr. 1, je způsoben pseudohyfálním růstem, a nikoli DLG.

.