Vytvoření systémů genetické transformace umožnilo vědcům transformovat cizí DNA do vláknitých hub a získat tak požadované kmeny pro průmyslové účely. Nyní můžeme plně využít vynikající sekreční schopnosti hub a jejich vynikající účinnosti při výrobě cenných metabolitů.

Transformace zprostředkovaná protoplasty (PMT)

PMT je nejčastěji používanou metodou transformace hub, která je založena na velkém počtu kompetentních houbových protoplastů. Princip spočívá v použití některých komerčně dostupných enzymů k odstranění složitých složek buněčné stěny hub pro generování protoplastů. Následně se použijí některá chemická činidla (např. PEG) na podporu fúze exogenních nukleových kyselin a protoplastů, jak je podrobněji popsáno níže. Složky buněčné stěny hub jsou u různých kmenů velmi variabilní. Dokonce i složky pláště výtrusů se výrazně liší od složek hyf téhož kmene . Proto neexistuje univerzální transformační metoda, kterou by bylo možné použít na různé houbové kmeny. Přípravu protoplastu lze jen stěží standardizovat. Část obtíží pramení z našich omezených znalostí hydroláz buněčné stěny. Vývoj optimalizované metody PMT pro houby stále vyžaduje značné úsilí.

PMT je rutinně používaná transformační metoda. Metoda se neustále zdokonaluje, aby se dosáhlo vyšší účinnosti genetické transformace a zacílení vhodných genových lokusů pomocí editace genů. Příprava protoplastů vyžaduje odstranění buněčné stěny, čehož se dosahuje především enzymatickou úpravou. Byly zaznamenány i neenzymové metody přípravy protoplastů, například fyzikální metody včetně rozmělňování a rázové nadzvukové vlny . Nejsou však široce používány z důvodu praktické nepohodlnosti a nízké výtěžnosti protoplastů. Souhrn protokolů transformace pomocí protoplastů pro různé druhy hub je uveden v tabulce 1.

Základní kroky metody PMT

PMT byla poprvé použita u Saccharomyces cerevisiae. Výzkumníci připravili protoplasty s komerční snailázou a ke konzervaci protoplastů použili sorbitol. Později byla tato metoda použita na vláknité houby, například Neurospora crassa , a A. nidulans . Přestože se transformační metody zdokonalily, základní kroky zůstávají v podstatě stejné. Základní kroky metody PMT jsou uvedeny na obr. 1.

Základní kroky transformace pomocí protoplastů

Příprava protoplastů

Prvním krokem přípravy protoplastů je odstranění buněčné stěny enzymatickým štěpením. Buněčná stěna hub se skládá z glukanu, mananu a chitinu. Struktura buněčné stěny hub je velmi dynamická a buněčná stěna se mění během buněčného dělení a růstu hub, stejně jako při klíčení spor, větvení hyf a tvorbě membrány. Složky buněčné stěny se také u různých druhů hub liší, proto je třeba používat různé enzymy v kombinaci. Uvádí se, že výběr vhodné směsi enzymů je klíčovým faktorem při přípravě protoplastů .

Obecně jsou hyfy citlivé na vhodný enzym, který hydrolyzuje jejich buněčnou stěnu během logaritmické fáze. Při postupu PMT u Neurospory se protoplasty připravují hydrolyzací nově narozených hyf (kultivace po dobu 4-6 h při 25-30 °C) . Podobně lze protoplasty připravit také z konidiospor. Například pro Aspergillus a Penicillium lze zvolit zárodečné spory nebo tály .

Protoplasty jsou citlivé na osmotický tlak, je třeba dbát na udržení stabilního osmotického tlaku, aby protoplasty zůstaly během enzymolýzy buněčných stěn neporušené. Proto by měly být do všech pufrů pro přípravu protoplastů zahrnuty osmotické stabilizátory (např. sorbitol, chlorid sodný a chlorid draselný), aby se zabránilo prasknutí buněk. Například roztok sorbitolu o koncentraci 0,8-1,2 M se používá při přípravě protoplastů N. crassa , Aspergillus sp. a Trichoderma sp. k udržení osmotické stability protoplastů. Souhrn parametrů přípravy protoplastů pro některé běžné druhy hub je uveden v tabulce 2.

Příjem exogenní DNA

Roztok používaný k suspenzi protoplastů obvykle obsahuje vápenaté ionty a osmotické stabilizátory. Předpokládá se, že vápník otevírá kanály v cytomembráně, což usnadňuje vstup exogenní DNA do buňky, zatímco osmotické stabilizátory jsou nezbytné pro udržení morfologie protoplastů. Obvykle se přidává určité množství polyethylenglykolu (PEG) spolu s purifikovanou DNA (což může být buď kruhová dvouřetězcová DNA, nebo linearizovaná DNA). PEG je běžně používaný promotor buněčné fúze. Může vytvářet molekulární most mezi buňkami nebo mezi cytomembránou a DNA, a tím podporuje adhezi. Kromě toho může také vyvolat neuspořádané náboje na povrchu cytomembrány, změnit propustnost membrány a usnadnit vstup exogenních nukleových kyselin do buněk .

PEG je zásadní činidlo zvyšující účinnost transformace. Nízkou účinnost transformace lze ve většině případů zlepšit přidáním většího množství PEG. Za normálních podmínek je účinnost nízkomolekulárního PEG (jako je PEG3000) lepší než účinnost vysokomolekulárního PEG (jako je PEG8000). To je však třeba optimalizovat pro různé druhy .

Účinnost transformace je také ovlivněna teplotou. Obecně platí, že směs DNA a protoplastů by měla být umístěna na 15-30 minut na led, aby DNA mohla přilnout k povrchu protoplastů .

Regenerace protoplastů

Aby se zaručila dobrá regenerace životaschopných protoplastů, nechají se protoplasty určitou dobu regenerovat na desce bez selekčního tlaku, než se přenesou na selekční desku. Součástí regenerační kultury by měl být osmotický stabilizátor. Stabilní osmotický tlak je klíčovým faktorem pro regeneraci buněčné stěny protoplastů. Na selektivním médiu mohou růst pouze protoplasty, které nesou exogenní nukleové kyseliny.

Komentář k metodě PMT

Metoda transformace protoplastů je jednoduchá a účinná a nevyžaduje drahé vybavení. Protokol však zahrnuje mnoho kroků a kritických činidel. Každý krok musí být optimalizován a kvalita činidel musí být kriticky testována. Je třeba pečlivě sledovat stav růstu transformovaných hub. Pro úspěšné zavedení této metody jsou rozhodující zkušenosti.

Agrobacterium -mediated transformation (AMT)

Agrobacterium je gramnegativní bakterie, která se běžně vyskytuje v půdě. Agrobacterium tumefaciens může infikovat poraněné rostliny. V rané fázi infekce bylo možné izolovat tumor-indukující plazmid > 200 kb, který je také označován jako Ti plazmid. Když A. tumefaciens infikuje rostlinu, pronikne do rostliny přes poranění a integruje část Ti plazmidu do genomu infikovaných rostlinných buněk. Integrovaný fragment DNA z Ti plazmidu se běžně označuje jako přenosová DNA nebo T-DNA. T-DNA se do genomu rostliny vkládá náhodně jako monoklon. T-DNA je lemována dvěma směrově nedokonalými repeticemi (tzv. levý a pravý okraj) a obsahuje geny, které kódují enzymy zodpovědné za tvorbu rostlinných hormonů, které způsobují růst nádoru . Byl navržen binární vektor s cílovým genem vloženým mezi levou a pravou hranici T-DNA a rekombinantní plazmid byl transformován do Agrobacterium tumefaciens. Pozitivní klon Agrobacterium byl použit jako nosič pro integraci cílového genu do genomu houby. Konkrétní kroky budou podrobně rozebrány níže.

Metoda AMT se ukázala být stabilnější a účinnější než konvenční transformační metody již od první práce, v níž bylo uvedeno, že tuto metodu lze použít k transformaci hub. Metoda AMT byla poprvé použita k transformaci S. cerevisiae . K transformaci Aspergillus awamori se běžně používá plazmid nesoucí gen rezistence k hygromycinu . Metoda AMT byla použita u mnoha Ascomycetes, včetně Aspergillus , a Monascus purpureus . Základní kroky metody AMT jsou uvedeny na obr. 2. Shrnutí protokolu transformace zprostředkované bakterií Agrobacterium pro různé druhy hub je uvedeno v tabulce 3.

Základní kroky transformace zprostředkované Agrobacteriem

Faktory ovlivňující účinnost AMT

Účinnost AMT ovlivňuje mnoho faktorů, včetně typu výchozího houbového materiálu (protoplast, spora, hyfa a tkáň plodnice), koncentrace acetosyringonu, poměru houby a Agrobacterium a podmínek pro společnou kultivaci.

1. Typ výchozího houbového materiálu Metoda AMT může jako příjemce použít protoplasty, spory, hyfy a tkáň plodnice hub. Pro různé kmeny je třeba zvolit vhodný výchozí materiál. Například metoda AMT funguje pouze pro protoplasty Rhizopus. oryzae a Mucor circinelloides, zatímco spory nebo zárodečné spory by nevytvořily transformanty .

2. Koncentrace acetosyringonu (AS) AS působí ve dvou fázích během procesu AMT. Jednou je proces indukce a druhou proces transformace. AS se obecně používá k indukci exprese virové domény T-DNA a gen ve virové doméně aktivuje přenos T-DNA. Četné studie prokázaly, že během transformačního procesu je nezbytné přiměřené množství AS. Přídavek AS však není nezbytně nutný ve fázi před kultivací Agrobacterium, což by mohlo u některých kmenů snížit účinnost transformace. Koncentrace AS je důležitým faktorem ovlivňujícím účinnost transformace během procesu společné kultivace hub a Agrobacterium v AMT Aspergillus awamori .

3. Poměr hub a Agrobacterium V určitých mezích dosáhne účinnost transformace maximální úrovně se zvýšením množství hub nebo Agrobacterium. Optimální poměr pro AMT pro různé houby musí být stanoven empiricky. Poměr houbových a bakteriálních buněk by měl být optimalizován pro různé transformační systémy houby a Agrobacterium.

4. Podmínky pro společnou kultivaci Podmínky pro společnou kultivaci jsou důležitým faktorem metody AMT. Patří sem doba kultivace, teplota, pH a výběr filtru. Teplota a čas pro spolukultivaci jsou klíčovými faktory mezi kroky AMT. Při transformaci houby a bakterie Agrobacterium je vhodnou podmínkou pro začátek teplota 20-28 °C a doba společné kultivace 16-96 h. Pro metodu AMT je obvykle výhodná nižší teplota (20-25 °C). Filtr, který je hydrofilní a slouží jako podpora pro ko-kultivaci hub a agrobakterií, usnadňuje přenos jednotlivých kolonií na screeningovou destičku. Jako filtr lze použít nitrocelulózovou membránu, nylonovou membránu, filtrační papír, celofán a polyvinylidenfluoridovou (PVDF) membránu .

Komentář k transformaci zprostředkované Agrobacteriem

Metoda AMT otevírá novou cestu pro ty houby, které jsou k transformaci běžnými metodami rekalcitabilní. Metoda AMT je zvláště vhodná pro generování knock-in mutací u hub, protože T-DNA se náhodně vkládá do genomu jako jediná kopie. Kromě toho lze metodou AMT dosáhnout vysoké účinnosti homologní rekombinace při různých experimentech s cílením genů.

Mezi hlavní výhody metody AMT patří: za prvé, diverzifikovaní příjemci transformace, včetně protoplastů, hyf a spor; za druhé, schopnost integrovat exogenní geny do genomu za účelem vytvoření stabilních transformantů; a za třetí, vysoká účinnost transformace vedoucí k velkému počtu transformantů.

Metoda AMT vyžaduje binární vektory, jejichž příprava je zdlouhavá. Při optimalizaci transformačního procesu je třeba vzít v úvahu více faktorů. To je hlavní omezení metody AMT .

Elektroporační transformace

Elektroporace je jednoduchá, rychlá a účinná metoda transformace vláknitých hub. Při elektroporaci se elektrické náboje ukládají do kondenzátoru, aby se vytvořilo vysoké napětí, vzorek je zasažen impulsním napětím a exogenní nukleová kyselina může být okamžitě přenesena do buněk. Obvykle se při transformaci hub používají čtvercové vlny nebo vlny s exponenciálním rozpadem . Impulsy s exponenciálním rozpadem se generují jednoduše nabíjením a vybíjením kondenzátoru. Elektrické pole klesá exponenciálně od maximální hodnoty. Čtvercová vlna je nesinusový periodický průběh (který lze znázornit jako nekonečný součet sinusových vln), v němž se amplituda střídá s ustálenou frekvencí mezi pevnými minimálními a maximálními hodnotami. Pro různé druhy se používají různé tvary vln elektroporace. Přehled tvarů vln používaných při elektroporaci pro různé druhy je uveden v tabulce 4.

Při vystavení buňky elektrickému poli dojde ke změně struktury cytomembrány pomocí napětí indukovaného mezi cytomembránou. V cytomembráně se po elektrickém šoku mohou vytvořit mikropóry. Indukovaná propustnost buněčné stěny je vratná v rámci prahových hodnot napětí a doby trvání, jinak způsobí nevratné poškození buněk. Proto se zdá, že mikropóry v cytomembráně mají po elektrickém šoku dva vzorce, reverzibilní a ireverzibilní. Molekuly lipidů a bílkovin v cytomembráně mohou při aplikaci vhodné intenzity pole obnovit původní strukturu, zatímco nevratný elektrický šok způsobí neopravitelnost nebo extrémně pomalou obnovu, což nakonec vede ke smrti buňky . Exogenní DNA lze přenést do bakterie , rostlinného protoplastu , živočišné buňky a vláknitých hub pomocí elektroporace. Tato metoda byla úspěšně použita u více hub. Ozeki a spol. zjistili, že zárodečné spory jsou k transformaci pomocí elektroporace přístupnější . V posledních letech se elektroporace stala spolehlivou metodou genové transformace některých běžných kmenů . Přehled transformačních protokolů zprostředkovaných elektroporací pro různé druhy hub je uveden v tabulce 5.

Faktory, které ovlivňují transformaci elektroporací

Parametry elektroporace

1. Intenzita elektrického pole Intenzita elektrického pole je nejdůležitějším faktorem, který ovlivňuje účinnost elektroporace. Když intenzita aplikovaného elektrického pole dosáhne velikosti kV/cm a šířky pulzu v rozsahu μs-ms, dojde ke změně cytomembrány a na buněčných stěnách se vytvoří mnoho mikropórů . Vysoká intenzita elektrického pole je spojena s vysokou mírou absorpce exogenních nukleových kyselin a nižší mírou přežití buněk. Různé typy buněk však vyžadují různou intenzitu elektrického pole v důsledku rozdílů ve složkách cytomembrány . Pokud intenzita elektrického pole nepřekročí požadovaný práh, vytvoří se jen málo mikropórů. Naopak nadměrná intenzita elektrického pole způsobí nevratné poškození cytomembrány, což vede ke smrti buněk .

2. Kapacita Během procesu elektroporace závisí změny elektrických nábojů a intenzita elektrického pole aplikovaného na buněčnou suspenzi na kapacitě a délce trvání pulzu. Intenzita a trvání impulsu jsou také ovlivněny kapacitou, proto má větší kapacita lepší transformační účinky .

3. Trvání a frekvence impulsu Trvání perforace na cytomembráně, které přímo souvisí s účinností elektroporace transformace, je ovlivněno trváním a frekvencí impulsu .

Prostředí pro elektroporaci a vnější faktory

1. Pufrovací roztok Pufrovací roztok poskytuje důležité prostředí pro elektroporaci buněk a hodnota pH pufrovacího roztoku pro elektrický šok má velký význam. Obvykle se používá pufr o pH 7,0. Při pH vyšším než 7,0 jsou buňky snadno propíchnuty a usmrceny .

2. Teplota Během procesu elektroporace vzniká velké množství tepla, které se uvolní do pufrovacího roztoku. Proto se pro lepší účinek doporučuje snížená teplota (0-4 °C) . Kromě toho může účinnost elektrošoku zlepšit také ledování směsi před elektrošoky.

3. Koncentrace exogenní nukleové kyseliny Celkově se účinnost elektroporace zvyšuje s koncentrací exogenní nukleové kyseliny. Kompaktní superhelikální DNA snadněji proniká do buněk přes cytomembránu. V roce 1995 jedna studie uváděla, že každý 1 μg plasmidové DNA může u A. niger vytvořit 100 transformantů .

Komentář k metodě elektroporace

Metoda elektroporace byla široce použita u mnoha typů buněk, včetně prokaryot a eukaryot. Tato technologie má potenciál stát se metodou volby pro transformaci neprozkoumaných druhů hub. V porovnání s metodou PMT, při níž se provádějí složité kroky, je elektroporace jednoduchá a pohodlnější. Mechanismus elektroporace však stále zůstává nejasný. Rychlost perforace cytomembrány závisí na mnoha parametrech elektrického pole. A také vyžaduje vhodné pufrovací podmínky, aby byla optimálně účinná.

Biolistická transformace

Biolistická transformace je také známá jako bombardování částicemi. Její princip spočívá v tom, že se cizí DNA adsorbuje na povrch wolframových nebo zlatých částic. Pod tlakem vysokého tlaku jsou částice vstřikovány do hostitelských buněk. Bombardování částicemi může realizovat stabilní i přechodnou transformaci.

Různé faktory ovlivňují účinnost bombardování ve vzorcích složitých interakcí . Důležitými proměnnými jsou biologické parametry (typ buněk, podmínky růstu a hustota buněk) a instrumentální nastavení (typ a velikost částic, úroveň vakua a tlaku, cílová vzdálenost) .

Bombardování částicemi je nejvýkonnější ze všech metod genetické transformace. Nepodléhá omezením typů buněk hostitele nebo druhů. U hub je bombardování částicemi dostatečně účinné pro ty organismy, které se obtížně kultivují nebo z nichž je obtížné připravit protoplasty. Bombardování částicemi je snadné a pohodlné. Přístroje a spotřební materiál pro bombardování částicemi jsou však drahé. Uvažuje se o něm pouze v případě, že jiné metody nefungují. V současné době se bombardování částicemi využívá k úspěšné transformaci A. nidulans a T. reesei , atd.

Transformace zprostředkovaná rázovou vlnou (SWMT)

SWMT využívá principu transformace a přenosu energie k vytvoření přechodné tlakové poruchy a kroutící síly napříč buňkami za vzniku přechodného kavitačního efektu . Tato metoda byla použita v lékařské léčbě, například v ortopedii a při drcení ledvinových kamenů . SWMT mění propustnost buněčných membrán prostřednictvím akustické kavitace, což vede k příjmu exogenní nukleové kyseliny do buněk. Metoda byla úspěšně použita při zavádění exogenní nukleové kyseliny do Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa a Salmonella typhimurium . V roce 2013 Denis Magaña-Ortíz a kol. poprvé informovali o použití SWMT pro houby, včetně A. niger, Fusarium oxysporum a Phanerochaete chrysosporium . V tomto článku byly uvedeny tři výhody metody SWMT. Za prvé, ve srovnání s konvenčními transformačními metodami je tato metoda schopna přímo působit na spory, ale nikoli na protoplasty. Za druhé, fyzikální parametry byly snadno kontrolovatelné, pouze počet spor, energie a rychlost rázové vlny musely být přesně řízeny. Za třetí, účinnost transformace byla vynikající. Výsledky Denise Magaña-Ortíze a kol. ukázaly, že ve srovnání s metodou transformace Agrobacterium mohla metoda SWMT zvýšit účinnost transformace A. niger 5400krát .

V této transformační metodě však byla patrná i některá omezení. Vzhledem k tomu, že při ošetření rázovou vlnou dochází k poškození velké části DNA, byla účinnost transformace stanovená podle poměru DNA k buňkám poměrně nízká . Pro počet zapojených buněk však byla účinnost transformace výrazně vyšší . Při hodnocení účinnosti je třeba vzít v úvahu dva aspekty: množství DNA a počet buněk. Například v experimentu, který provedli Magana-Ortiz et al. , se při transformaci protoplastů a elektroporaci obecně používá plazmidová DNA v množství přibližně 1-10 μg . Výroba tak obrovského množství plazmidu v laboratoři pro metodu SWMT je nákladná a nepohodlná. Zdroje rázové vlny a přístroje jsou navíc drahé, protože jsou primárně určeny pro lékařské účely. To se ukazuje jako hlavní překážka pro zavedení této metody v mikrobiologické laboratoři s omezenými zdroji

.