Výsledky a diskuse

Naše nová metoda AMHS je usnadněna anatomickou/funkční strukturou oběhového systému včel. Oběh je vynucen pulzační kontrakcí dorzální a ventrální bránice, které pumpují hemolymfu do srdce. Dále aorta dopravuje hemolymfu do hlavy (obr. 1F) , která zásobuje hemolymfou mozek a tykadla včely.

V porovnání s TCHS umožnila AMHS odběr 80-100 μl sterilní hemolymfy za kratší dobu a od menšího počtu jedinců, což minimalizuje riziko melanizace. Domníváme se, že při odběru hemolymfy je důležité minimalizovat dobu jejího kontaktu se vzduchem. Riziko melanizace se snižuje při kratší době odběru a rychlejším postupu ke kroku chlazení. Kromě zkrácení doby odběru je další podstatnou výhodou AMHS oproti TCHS omezení používání hmyzu. Výzkum včelovitých by měl být vždy koncipován tak, aby se minimalizoval počet včel, které musí být poškozeny. Použití AMHS ke snížení počtu včel potřebných ke sběru požadovaného objemu hemolymfy je v souladu s hlavními zásadami pro etičtější používání zvířat ve výzkumu .

Naše současné výsledky také ukázaly, že větší velikost hmyzu byla spojena se snadnějším a rychlejším odběrem vzorků hemolymfy a s větším objemem odebrané hemolymfy (tabulka 1). Odběr vzorků hemolymfy od dělnic Apis mellifera carnica a Apis cerana trval déle a vyžadoval více hmyzu než odběr vzorků hemolymfy od čmeláků, protože první druhy jsou podstatně menší a mají méně hemolymfy.

Hemolymfa se nejčastěji získává pomocí kapilár různými metodami, například propíchnutím srdce, dorzální nebo ventrální dutiny hrudníku nebo dorzální aorty . Každý z těchto postupů s sebou nese riziko, že bude propíchnut ventrikulus, což povede ke kontaminaci vzorku střevním obsahem. Taková kontaminace nejenže činí vzorek nepoužitelným, ale také vyžaduje, aby byla kapilára před dalším použitím vyměněna za novou nebo vyčištěna a vydezinfikována – tím se prodlužuje celková doba odběru hemolymfy. Sterilita hemolymfy může být také narušena propíchnutím membrány spojující břišní segmenty. Použití AMHS tyto problémy spojené s kapilárami eliminuje. Při sběru hemolymfy dekapitací může navíc dojít ke kontaminaci hemolymfy nektarem vytékajícím ze žaludku včely. Výsledkem naší nové AMHS jsou vzorky hemolymfy vysoké biologické kvality. V každém vzorku hemolymfy získaném pomocí AMHS byly jasně viditelné hemocity (obr. 1C). Analýza každého mikroskopického sklíčka ukázala, že vzorky hemolymfy získané pomocí AMHS byly čisté a průhledné, bez kontaminace (např. pylovými zrny).

Očekávali jsme, že při provádění AMHS zajistí dezinfekce etanolem a omezený kontakt mezi kapkou hemolymfy a tělem včely sterilitu vzorku. Toto očekávání bylo potvrzeno mikrobiologickými testy. Inkubace hemolymfy získané pomocí AMHS na MRS i Sabouraudově agarovém médiu potvrdila sterilitu hemolymfy. Na žádné ze 100 nanesených kapek hemolymfy nebyl pozorován růst mikroorganismů. Proto zde nejsou uvedeny žádné kvantitativní výsledky. Po ukončení inkubační doby jsme kolem každé kapky pozorovali pouze tmavě hnědé kruhy melanizované hemolymfy. K této melanizaci došlo během inkubační doby, nikoliv během odběru vzorků (obr. 1D a 1E). Je pozoruhodné, že pokud se odebraná hemolymfa nemá použít k mikrobiologickému testování, lze krok dezinfekce vynechat. Je možné, že etanol aplikovaný v oblasti tykadel může ovlivnit enzymové nebo hormonální aktivity.

Účinnost sběru hemolymfy mohou ovlivnit i jiné faktory než metodika. V našich předchozích studiích jsme pozorovali , že množství hemolymfy odebrané včele závisí nejen na kastě a věku včely, ale také na stupni její hydratace měřeném na základě objemu nektaru nebo cukrového sirupu spotřebovaného před odběrem vzorku hemolymfy. Ptaszyńska a kol. uvádějí, že odběr vzorků správného objemu hemolymfy je méně účinný u starších včel. Účinnost odběru vzorků navíc může záviset na laboratorních dovednostech výzkumníka. Tyto faktory ztěžují porovnání kvantitativních charakteristik různých protokolů odběru vzorků hemolymfy mezi studiemi prováděnými v různých laboratořích a za použití různých organismů. V našich předchozích výzkumech jsme odebrali vzorky hemolymfy od tisíců včel pomocí AMHS i jiných metod, včetně TCHS . Pracovníci naší laboratoře mají značné zkušenosti s odběrem hemolymfy od včel různého stáří a kast. Tyto zkušenosti nám pomohly porovnat různé metody odběru vzorků, protože naše zjištění nebyla ovlivněna chybami způsobenými proměnlivými dovednostmi laboratorních pracovníků. Naše současné výsledky ukázaly, že AMHS je účinná, čistá a vysoce přesná metoda (tabulka 1), která je méně časově náročná než TCHS .

Odběr vzorků hemolymfy pomocí jiných metod než AMHS obvykle vyžaduje další vybavení, například mikrokapilární zkumavky. Odběr hemolymfy z mikrokapilárních zkumavek navíc vyžaduje buď použití speciální pumpy, nebo rozdrcení zkumavek a jejich odstředění pomocí kuliček. Další výhodou AMHS je možnost použití pipetové stupnice k měření objemu hemolymfy odebrané od každé jednotlivé včely. To je zvláště užitečné při provádění biochemické analýzy mikrovzorků, např. pro stanovení enzymových aktivit . Stojí za zmínku, že při použití jiných metod než AMHS lze objem čisté hemolymfy vypočítat nepřímo, na základě objemu ředidla hemolymfy ve zkumavce před odběrem vzorku a naměřeného objemu ředidla hemolymfy po odběru vzorku. Taková metoda však může vést k další chybě; někteří výzkumníci proto používají Hamiltonovy stříkačky . Metoda AMHS se vyhýbá nákladům a dodatečné práci (např. odstraňování ucpávek ze stříkaček, dezinfekce atd.) spojené s používáním Hamiltonových stříkaček.

Mayackova a Naugova metoda (hemolymfa se získává otáčením včel s ustřiženými tykadly) je podobná metodě AMHS. Jejich metoda však vyžaduje jednak laboratorní odstředivku, jednak musely být části včelích úst zalepeny, aby se zabránilo případné kontaminaci. V jejich studii navíc před odstřeďováním včel provedli pitvu vnitřností včel, aby posoudili infekci Nosema ceranae. Bez tohoto kroku by vnitřnosti byly pravděpodobným zdrojem kontaminace. Jejich metoda zahrnovala umístění včel do odstředivek a jejich odstřeďování při 16 000 RCF po dobu 30 s, aby se získala hemolymfa. Tento postup by mohl rozvrstvit složky hemolymfy (např. bílkoviny a hemocyty) a nese s sebou zvýšené riziko mikrobiologické kontaminace a melanizace hemolymfy (viz diskuse výše). Zatímco pro analýzu hladiny cukru v hemolymfě u včelích krmítek s předem odstraněnými střevy (jako v jejich studii) může být ideální, pro mikrobiologické a genetické studie nebo výzkum enzymových aktivit není zcela vhodný. V tomto kontextu je naše nová metoda AMHS vhodnější pro obecné použití, protože je snadná a jednoduchá a pravděpodobně použitelná v široké škále různých typů studií.