Osvětlení na zemském povrchu se během normálního cyklu den-noc mění o >10 řádů a zrakový systém obratlovců pokrývá celý tento rozsah intenzity světla pomocí dvou neuronálních subsystémů, které jsou závislé na činnosti dvou typů fotoreceptorů, tyčinek a čípků. Lidské tyčinkové vidění funguje přibližně v sedmi desetinných řádech osvětlení. Čípkový zrakový systém pracuje v ještě širším rozsahu (Rodieck 1998). Adaptace na světlo probíhá na všech úrovních zrakového systému, od fotoreceptorů až po centrální neurony. Přesto funkce celého zrakového systému závisí na schopnosti samotných fotoreceptorů přizpůsobit svou citlivost okolní světelné situaci. Fotoreceptory tedy musí generovat spolehlivé signály v noci, kdy jsou jednotlivé fotony zachyceny mezi dlouhými intervaly tmy, a musí také pokračovat v signalizaci při velmi vysokých intenzitách světla, s nimiž se setkáváme za slunečného dne. Světelná adaptace fotoreceptorů je pravděpodobně zprostředkována více a možná redundantními molekulárními mechanismy (Detwiler a Gray-Keller 1992; Lagnado a Baylor 1992; Bownds a Arshavsky 1995; Pugh et al. 1999). Nedávno Pugh et al. 1999 shrnuli devět jednotlivých molekulárních mechanismů, o nichž se předpokládá, že se podílejí na adaptaci, a diskutovali jejich relativní příspěvek k celému procesu adaptace. Studie stejných autorů, publikovaná na straně 795 (Nikonov et al. 2000, toto číslo), poskytuje experimentální podporu jejich poznatků a dále rozvíjí teoretický rámec, který ovlivní budoucí studie adaptace fotoreceptorů na světlo.
Molekulární mechanismy, které jsou základem světelné adaptace, lze diskutovat v kontextu reakcí řídících cGMP v cytoplazmě fotoreceptorů (Hodgkin a Nunn 1988):
Intracelulární koncentrace cGMP je určena rychlostí jeho syntézy guanylcyklázou a rychlostí jeho hydrolýzy fosfodiesterázou cGMP (PDE). Tuto koncentraci neustále monitorují kanály řízené cGMP, které se nacházejí v plazmatické membráně fotoreceptoru. Ve fotoreceptoru přizpůsobeném tmě se udržuje stálá koncentrace cGMP na úrovni několika mikromolárů. To udržuje část kationtových kanálů vnější plazmatické membrány řízených cGMP otevřenou a buňku depolarizovanou. Světlo způsobuje pokles cGMP aktivací PDE prostřednictvím enzymatické kaskády zahrnující fotoaktivovaný rodopsin, G-protein zvaný transducin a efektorový enzym PDE. Snížení koncentrace cGMP vede k uzavření kanálu a hyperpolarizaci fotoreceptoru. K obnovení světelné odpovědi dochází, když je excitační kaskáda inaktivována, hladina cGMP je obnovena guanylcyklázou a kanály se znovu otevřou. Během fotoreakce klesá také intracelulární koncentrace Ca2+, protože jeho vstup přes kanály řízené cGMP je blokován, zatímco je nadále vytlačován výměnnou molekulou Na2+/Ca2+-K+, která se nachází v plazmatické membráně. Právě tento pokles Ca2+ byl označen za hlavní faktor, který je základem adaptace na světlo, protože vede ke zpětnovazebné regulaci různých složek fototransdukční kaskády.
Pro ilustraci významu adaptace na světlo pro normální funkci fotoreceptoru uvažujme následující. Aby tyčinkové fotoreceptory registrovaly minimální světelné podněty, musí být v kaskádě rodopsin-transducin-PDE dosaženo vysokého stupně zesílení signálu. Například na vrcholu odpovědi tyčinek roupic na jediný foton, který nastává ∼1 s po absorpci fotonu, se uzavře ∼5 % otevřených kanálů citlivých na světlo. To znamená, že stálé osvětlení dodávající pouze ∼100 fotonů za sekundu by uzavřelo všechny kanály, čímž by buňka přestala reagovat na jakoukoli další světelnou stimulaci. Protože se však tyčinky na světlo adaptují, k tomuto nasycení nedochází, dokud okolní osvětlení nevytvoří rychlost zachycování fotonů ∼10 000 fotonů za sekundu. U čípků je účinek adaptace ještě hlubší: prakticky nikdy se nenasytí.
Přechod mezi stavy fotoreceptoru adaptovaného na tmu a světlo je doprovázen dvěma významnými změnami fyziologických vlastností fotoreceptorů. Za prvé, fotoreceptory adaptované na světlo jsou méně citlivé na světlo, což zabraňuje jejich oslepnutí při vysokých úrovních intenzity světla. Za druhé, světelně adaptované fotoreceptory produkují rychlejší fotoreakce, což zlepšuje časové rozlišení ve zrakovém systému. Právě pro tyto dvě vlastnosti se nejčastěji používá termín „adaptace na světlo“ a v literatuře převládá názor, že za oběma stojí systémy zpětné vazby Ca2+. Jedním z nesmírně důležitých příspěvků Nikonova et al. 2000 je zpochybnění tohoto názoru. Autoři zkoumali proces světelné adaptace ve fotoreceptorech tyčinek salamandra a poskytli experimentální důkaz, že jak desenzitizace fotoreceptorů, tak zrychlení odpovědi jsou do značné míry nezávislé na Ca2+ zpětné vazbě. Místo toho jsou důsledkem zvýšené aktivity PDE způsobené stálým osvětlením pozadí.
Jeden z účinků stálé aktivace PDE na absolutní citlivost odpovědi je poměrně přímočarý. Protože absolutní citlivost odpovědi je úměrná absolutnímu počtu kanálů otevřených před zábleskem, vede snížení počtu otevřených kanálů způsobené stálým osvětlením automaticky ke kompresi amplitudy odpovědi. Komprese odezvy je však relativně malou částí celkového účinku stálé aktivace PDE. Hlavním zdrojem snížení citlivosti záblesku je zrychlení obnovy signálu způsobené aktivací PDE. Formálně k tomuto zrychlení dochází proto, že časová konstanta reakce, kterou se řídí změna cGMP vyvolaná zábleskem, je nepřímo úměrná specifické aktivitě PDE na objem cytoplazmy. Tato časová konstanta je přesně stejná jako časová konstanta, která řídí obrat celého cytoplazmatického poolu cGMP za stejných podmínek osvětlení.
Tento druhý koncept není intuitivní a Nikonov a spol. 2000 v diskusi ke svému článku uvádějí pro ilustraci tohoto efektu analogii hydrodynamické „vany“. My uvádíme jinou analogii, která by mohla oslovit čtenáře obeznámeného s vlastnostmi elektrických obvodů. Uvažujme elektrický obvod sestávající z proměnného rezistoru, kondenzátoru a zdroje konstantního proudu. Napětí (V) na kondenzátoru představuje koncentraci cGMP. Proud (i), který nabíjí kondenzátor (C), představuje rychlost syntézy cGMP guanylcyklázou (α, podle Nikonova a kol. 2000), zatímco kondenzátor představuje objem buňky. Aktivita PDE je reprezentována proměnným odporem (R(I)), který je regulován světlem (I). Vodivost rezistoru, 1/R, představuje součet tmavé bazální aktivity PDE a světlem stimulované aktivity PDE. Napětí na kondenzátoru je určeno rovnováhou mezi přítokem proudu do obvodu a únikem přes rezistor. Rovnice, které popisují změny napětí v obvodu, jsou totožné s rovnicemi popisujícími dynamiku koncentrace cGMP v tyčince.
V této analogii je záblesková reakce reprezentována zavedením krátkého, přechodného poklesu R(I). To způsobí pokles napětí na určitou úroveň a poté se exponenciálně vrátí zpět na ustálenou úroveň s časovou konstantou τ = RC. Protože 1/RC odpovídá poměru aktivity PDE v ustáleném stavu k objemu cytoplazmy (β, podle Nikonova et al. 2000), představuje RC časovou konstantu výměny cytoplazmatického poolu cGMP. Pak je zřejmé, že vyšší ustálená aktivita PDE tuto časovou konstantu snižuje a vede k rychlejšímu obnovení cGMP na jeho výchozí úroveň. Nikonov et al. 2000 ukazují, že tento druhý kinetický efekt stálé aktivity PDE před zábleskem je hlavním faktorem zodpovědným za urychlení fotoodpovědi během světelné adaptace. Je důležité poznamenat, že vzhledem k tomu, že obvod je lineární, časový průběh obnovy „zábleskové“ odpovědi je nezávislý na ustálené hodnotě proudu i. Změny i jednoduše škálují amplitudu napěťové (cGMP) odpovědi, aniž by měnily její charakteristickou dobu obnovy. Úroveň ustálené aktivity cyklázy, i v této analogii, tedy nemá žádný vliv na rychlost zotavení fotoreakce.
Zrychlené zotavení znamená, že se záblesková reakce vyvíjí po kratší dobu, a to snižuje citlivost na záblesk překrytý ustáleným pozadím. Aktivace PDE v ustáleném stavu tedy snižuje citlivost fotoreceptoru kombinovaným účinkem snížení podílu otevřených kanálů a zkrácením fotoodpovědi. Elegantní experimenty umožnily Nikonovovi a spol. 2000 kvantifikovat stupeň aktivace PDE ustáleným světlem na pozadí. Ukázali, že z ∼100násobného snížení citlivosti záblesku pozorovaného při jejich nejjasnějších intenzitách pozadí (viz obr. 6 v Nikonov et al. 2000) je ∼5násobek způsoben kompresí odezvy a ∼15násobek kinetickým účinkem aktivace PDE, přičemž zbytek je pravděpodobně způsoben účinkem recoverinu působícího na dobu života aktivovaného rodopsinu.
Když jsme hlavní část snížení citlivosti fotoreceptorů a zrychlení fotoreakce přisoudili zvýšené aktivitě PDE před zábleskem, vyvstává otázka: jakou roli hraje zpětná vazba Ca2+ v adaptaci na světlo? Odpověď je jasná, když si uvědomíme, že stálá aktivita PDE vyvolaná světelným pozadím způsobuje podstatné zvýšení hydrolytické aktivity cGMP. Pokud by neexistovaly žádné kompenzační mechanismy, koncentrace cGMP by se dramaticky snížila i při mírném osvětlení pozadí a nakonec by nezůstaly žádné kanály otevřené pro registraci dalších světelných změn. Nejzásadnější úlohou Ca2+ v adaptaci na světlo je tedy bránit tomuto nasycení zapojením řady molekulárních mechanismů, které nakonec vedou k opětovnému otevření kanálů, a tedy k rozšíření rozsahu intenzity světla, v němž fotoreceptor pracuje (odkazy a podrobnou diskusi viz Pugh et al. 1999).
Hlavní účinek Ca2+ na rozšíření rozsahu je zprostředkován zpětnou vazbou na guanylylcyklázu prostřednictvím proteinů vážících Ca2+ zvaných proteiny aktivující guanylylcyklázu. Pokles Ca2+ závislý na světle způsobuje zvýšení rychlosti syntézy cGMP, které působí proti zvýšené stabilní aktivitě PDE během osvětlení pozadí. Tento účinek stálého osvětlení na pozadí by neměl být zaměňován s dynamickou zpětnou vazbou Ca2+ na guanylylcyklázu během zábleskové reakce, která urychluje obnovu zábleskové reakce. Nikonov a kol. 2000 tvrdí, že účinek dynamické aktivace cyklázy se málo mění v závislosti na světelných podmínkách pozadí, a proto by neměl být považován za důležitý faktor světelné adaptace.
Druhý účinek Ca2+ rozšiřující rozsah se zaměřuje přímo na kanály řízené cGMP. Pokles Ca2+ způsobuje, že kanály jsou citlivější na cGMP, takže fungují při nižší koncentraci cGMP. Tento účinek je pravděpodobně zprostředkován kalmodulinem nebo kalmodulinu podobnými proteiny a zdá se, že je významnější u čípků než u tyčinek (Rebrik et al. 2000). Oba tyto účinky vedou k opětovnému otevření kanálů řízených cGMP během ustáleného osvětlení, aniž by způsobily desenzibilizační účinky; místo toho fotoreceptor resenzibilizují.
Třetí zpětná vazba Ca2+ se od ostatních liší, protože způsobuje jak prodloužení dosahu, tak přispívá k desenzibilizaci buňky. Pokles Ca2+ zvyšuje fosforylaci rodopsinu prostřednictvím Ca2+ vážícího proteinu recoverinu, což vede ke snížení doby života aktivovaného rodopsinu. To vede k desenzitizaci, protože se snižuje počet molekul PDE aktivovaných každým rodopsinem. Rozsah činnosti se také prodlužuje, protože snížený počet aktivních PDE se promítá do snížené ustálené hydrolytické rychlosti cGMP. Jak Nikonov a spol. tak další recentní literatura, kterou autoři diskutují, ukazují, že v tyčinkách se tento mechanismus zdá být mnohem méně účinný než zpětná vazba na guanylcyklázu.
Dalším důležitým výsledkem uvedeným v jejich článku je, že neexistuje žádný náznak čtvrtého navrhovaného mechanismu zpětné vazby Ca2+, adaptivní regulace zisku v kaskádě mezi aktivací rhodopsinu a uzavřením kanálu. Lamb a Pugh 1992 vyvinuli metodu odhadu zisku ve fototransdukční kaskádě na základě analýzy počáteční vzestupné fáze zábleskových odpovědí. Později další výzkumy diskutované Nikonovem a spol. 2000 ukázaly, že tento sklon se snižuje u záblesků prezentovaných při osvětlení pozadí nebo při umělém snížení intracelulárního Ca2+ ve tmě, a dospěly k závěru, že to odráží systém zpětné vazby Ca2+, který snižuje zisk kaskády během adaptace na světlo. V současné práci Nikonov et al. 2000 ukazují, že pro intenzitu světla na pozadí, která uzavře až 80 % kanálů citlivých na světlo a vede k přibližně pětinásobnému snížení intracelulárního Ca2+, se samotná počáteční vzestupná fáze zábleskových odpovědí ve skutečnosti nemění. Došli k závěru, že zdánlivé snížení zesílení vyvolané světlem pozadí nebo sníženým intracelulárním Ca2+ popsané v literatuře je pravděpodobně způsobeno zvýšenou ustálenou úrovní aktivity PDE a zvýšenou rychlostí zhášení fotoexcitovaného rodopsinu, které způsobují, že se fotoodpověď odlepí od neměnné počáteční trajektorie ve velmi časných časech.
Nikonov a jeho kolegové nyní předkládají názor, že Ca2+ zpětná vazba při adaptaci na světlo slouží téměř výhradně ke zvýšení citlivosti fotoreceptorů, nikoli jako mechanismus jejich desenzitizace. Ačkoli to může znít paradoxně, senzitizující účinek prodloužení dosahu zprostředkovaného Ca2+ zpětnou vazbou byl zřejmý již od prvních publikací, které prokázaly význam poklesu Ca2+ vyvolaného světlem pro světelnou adaptaci (Matthews et al. 1988; Nakatani a Yau 1988). V těchto studiích inhibice Ca2+ zpětné vazby během stálého osvětlení pozadí způsobila katastrofální snížení citlivosti na záblesk. Ca2+ zpětná vazba do značné míry zabránila ztrátě citlivosti a rozšířila pracovní rozsah fotoreceptoru ∼100krát (viz obrázek 2 v Matthews et al. 1988). Elegance článku Nikonova a spol. z roku 2000 spočívá v tom, že našli jasný způsob, jak rozklíčovat roli jak desenzibilizačních, tak senzibilizačních mechanismů v celkovém procesu adaptace.
To nás přivádí zpět k definici světelné adaptace u fotoreceptorů. Jak jsme uvedli výše, adaptace je obvykle definována jako kombinace desenzitizace buněk a urychlení reakce. V logice Nikonova et al. 2000 naznačuje, že je nutné nově definovat adaptaci tak, aby zahrnovala tři vzájemně propojené jevy: desenzibilizaci buněk, zrychlení reakce a rozšíření operačního rozsahu. Jednotlivé molekulární mechanismy mohou přispívat k jednomu nebo více z těchto tří rysů. Jak nastínili Pugh a jeho spolupracovníci v roce 1999, desenzitizace u tyčinek zahrnuje zvýšení ustálené hydrolýzy cGMP, kompresi signálu a snížení doby života rodopsinu pomocí Ca2+/rekoverinu. Zrychlení odpovědi zahrnuje zvýšení ustálené hydrolýzy cGMP a snížení doby života rodopsinu. Prodloužení dosahu zahrnuje tři procesy závislé na Ca2+: zvýšení syntézy cGMP, zvýšení citlivosti kanálů na cGMP a zkrácení doby života fotoaktivovaného rodopsinu.
Nikonov a spol. 2000 poskytují podrobný matematický model fototransdukce a adaptace na světlo u tyčinek obratlovců založený na prakticky všech dobře zavedených biochemických mechanismech. Modelování tohoto druhu přirozeně zahrnuje mnoho parametrů, které ponechávají velký prostor pro nejednoznačnost při přizpůsobování odpovědí. Nikonov a jeho kolegové (Nikonov et al. 1998, Nikonov et al. 2000) však v tomto i v předchozím článku nezávisle na sobě experimentálně odhadli mnoho klíčových fyziologických a biochemických parametrů. To téměř zcela eliminuje libovolnou manipulaci s parametry a zvyšuje robustnost závěrů vyvozených z modelu.
Při kvantitativním popisu fototransdukce a světelné adaptace, který Nikonov a spol. poskytují, co zůstává neznámé? Uvádíme zde následující tři příklady. Za prvé, ačkoli Nikonov et al. nenašli za svých experimentálních podmínek žádný důkaz o regulaci zisku fototransdukce, zbývá zjistit, zda k regulaci zisku dochází při vyšších úrovních osvětlení, v delším časovém měřítku nebo u různých druhů. Pokud ano, znamenalo by to existenci dalších biochemických mechanismů a molekulárních složek, které nejsou zahrnuty v současném schématu fototransdukce. Za druhé, o molekulárních mechanismech, které jsou základem adaptace na světlo u čípků, je známo jen málo. Čípky jsou schopny pokrýt širší rozsah než tyčinky a je prakticky nemožné je nasytit nepřetržitým světlem na pozadí. Budoucí studie by měly směřovat k pochopení, zda by celá adaptace čípků mohla být vysvětlena možná účinnějšími adaptačními mechanismy podobnými tyčinkám, nebo zda vyžaduje další jedinečné mechanismy. Zatřetí, na vyšší úrovni zrakového zpracování není známo, jak adaptace jednotlivých fotoreceptorů přispívá k adaptaci celého zrakového systému. Zbývá určit, jak kterákoli ze tří složek adaptace fotoreceptorů na světlo, desenzitizace buněk, zrychlení reakce a rozšíření rozsahu citlivosti, může způsobit, že naše vidění přizpůsobené světlu funguje rychleji, s lepší kontrastní citlivostí a vyšším prostorovým rozlišením.