Abstrakt

Infekce močových cest (UTI) jsou celosvětovým problémem. Většina výzkumu UTI se zaměřuje na gramnegativní etiologii. Bylo zjištěno, že nejčastější infekcí UTI jsou enterobakterie, které tvoří více než 80 % všech hlášených případů. Hlavními grampozitivními bakteriemi v případech UTI jsou Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae. Grampozitivní patogeny byly hlášeny ve více zemích jak u nekomplikované, tak u komplikované UTI. Antibiotická léčba grampozitivních bakterií je zcela odlišná od léčby gramnegativních původců UTI. Příznaky spojené s UTI způsobenou grampozitivními a gramnegativními bakteriemi jsou však velmi podobné. Bez správné diagnózy existuje vysoká pravděpodobnost stanovení nesprávné diagnózy a následné antibiotické terapie. Z hlediska Bangladéše je k dispozici velmi málo studií zaměřených na etiologii a jejich citlivost na antibiotika. Naším cílem bylo hledat v této oblasti výzkumu zaplnění mezery. Tato studie zjistila 8,2 % grampozitivních bakterií u pacientů s UTI. Tato prevalence ukazuje soulad s dříve publikovanými zprávami. Bylo zjištěno, že muži i ženy jsou stejně infikováni grampozitivními patogeny UTI. Většina dřívějších publikací ukazuje, že ženy jsou náchylnější ke gramnegativním bakteriím UTI. Je nepravděpodobné, že podle našich zjištění jsou muži ve srovnání se ženami stejně zranitelní grampozitivními bakteriemi. Další studie s větším počtem vzorků mohou předběžná zjištění potvrdit. Analýzy antibiogramů ukázaly, že nejúčinnějšími antibiotiky proti námi testovaným izolátům jsou amikacin a gentamicin. Naopak nitrofurantoin byl v této studii shledán jako nejneúčinnější lék. Zjištění této studie by mohla pomoci při předepisování antibiotik na základě této studie založené na důkazech.

Klíčová slova

uropatogen, UTI, antimikrobiální rezistence, empirická léčba, Bangladéš

Zkratky

API: Analytic Profile Index; CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute; CLED: MDR: Multi Drug Resistant; MHA: Muller Hinton Agar; PBS: Phosphate Buffered Saline; UTI: Urinary Tract Infection

Úvod

Infekce močových cest (UTI) je jedním z nejčastějších infekčních onemocnění. Hlavními původci UTI jsou Escherichia coli a další Enterobacteriaceae. Zbývající část je spojena s různými organismy, včetně grampozitivních bakterií Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae (streptokok skupiny B, GBS) a dalších méně často izolovaných organismů . Mezi nejrozšířenější grampozitivní uropatogenní bakterie patří Staphylococcus saprophyticus a Enterococcus facecalis . Grampozitivní uropatogeny byly hlášeny ve více zemích u nekomplikované i komplikované UTI . V bangladéšské populaci nebyly provedeny žádné takové exkluzivní studie, které by hledaly grampozitivní etiologii UTI. Bez správné diagnózy existuje vysoká pravděpodobnost získání nesprávných a nevhodných léků a následných nežádoucích vedlejších účinků související léčby. Grampozitivní bakterie se častěji vyskytují jako etiologičtí původci UTI u těhotných žen a starších osob . Dále se komplikované UTI často vyskytují v nemocničním a/nebo ústavním prostředí a tyto osoby jsou více ohroženy grampozitivní a polymikrobiální UTI . Představují velkou část spotřeby antibiotik, mají velký socioekonomický dopad a mohou přispívat ke vzniku bakteriální rezistence . Lékaři se často potýkají s problémy při výběru vhodného antibiotika pro empirickou léčbu při léčbě UTI . V Bangladéši přináší nerozlišující používání antibiotik pacientům s UTI mnoho nepříznivých klinických důsledků s rozšířenou ekonomickou zátěží . Cílem této studie bylo posoudit profil citlivosti grampozitivních uropatogenů vůči různým předepsaným antibiotikům. Naše studie zdůvodnila nutnost průběžného sledování pacientů s infekcí močových cest pro lepší pochopení jejich aktuální epidemiologie grampozitivními bakteriálními kmeny v bangladéšské populaci.

Metody a materiály

Sběr dat

Sociálně-demografické údaje pacientů, anamnéza léčby (zda byli pacienti léčeni antimikrobiální terapií) a veškeré relevantní klinické informace (ledvinové kameny, těhotenství, nedávné použití katétru) byly zaznamenány pomocí strukturovaného dotazníku.

Plán studie a odběr vzorků

V období od července 2018 do prosince 2018 byla provedena průřezová studie s cílem vyhledat grampozitivní bakteriální izolát od pacientů s infekcí močových cest. Tato studie byla navržena na základě laboratorních vyšetření vzorků moči odebraných od pacientů s UTI navštěvujících různé komunitní nemocnice v oblasti Savar. Pro aktualizaci plánování byli o účast v této studii požádáni pravděpodobní pacienti s UTI, kteří vyhledali lékařskou pomoc v nemocnici Gonosastha Hospital a Enam Medical College v Savaru v Dháce. Do studie byli zahrnuti pacienti se souhlasem, kteří měli klinické známky UTI s příznaky kratšími než sedm dní, kteří se dostavili na ambulantní oddělení nemocnic, a ti, kteří byli hospitalizováni po dobu kratší než 48 h.

Izolace a identifikace bakterií

K izolaci patogenu UTI byly odebrány vzorky čisté moči ze středního proudu do sterilních skleněných zkumavek a naočkovány na diferenciální kultivační médium, cystein-, laktosa-, and electrolyte-deficient (CLED) agar (Lyophilchem, Itálie). Pacientům byl předem vysvětlen standardní postup odběru vzorků z čistého středního proudu, aby se zabránilo kontaminaci komenzálními bakteriemi. Aby se předešlo falešně pozitivním výsledkům, byly vzorky moči naočkovány do 2 hodin po odběru. Použití CLED agaru poskytuje výhody podpory růstu většiny potenciálních uropatogenů včetně grampozitivních koků, jako jsou Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus a Enterococcus spp. Současně byl naočkován Mannitol Salt Agar (MSA) pro cílený růst grampozitivních UTI. Močové kultury byly inkubovány přes noc při teplotě 35 °C-37 °C na okolním vzduchu. Byly provedeny kvantitativní kultivace moči a počty kolonií 102 nebo 103 CFU/ml byly považovány za definici pravděpodobné infekce UTI u příslušných pacientů . Počty kolonií nižší než 102 CFU/ml byly považovány za potenciální kontaminaci. Přečištěné bakteriální kolonie byly identifikovány pomocí barvení podle Grama, konvenčních biochemických postupů a následně pomocí rychlé biochemicko-testovací soupravy (API 20E, BioMe´rieux, Durham, NC) sestávající ze sady chromogenních panelů, sacharidových baterií a enzymatických substrátů. Identifikace bakterií byla dále částečně ověřena genotypizací pomocí 16S rRNA izolátů.

Posouzení antimikrobiální citlivosti

Izoláty byly podrobeny testu citlivosti na antibiotika in vitro standardní Kirby-Bauerovou diskovou difuzní metodou a inhibiční zóny byly interpretovány podle doporučení CLSI (Clinical amp; Laboratory Standards Institute-2010). Na bakteriální trávník bylo umístěno šest disků s antibiotiky beta-laktamovými, nitrofurantoinovými a fluorochinolonovými, které byly inkubovány při 37 ºC za účelem stanovení vzorce citlivosti. Citlivé bakterie vytvořily kolem disku s antibiotikem zřetelnou zónu a průměr zóny byl změřen pro porovnání se standardem.

Detekce genů rezistentních k β-laktamáze a chinolonu

Izoláty, které fenotypově vykazovaly rezistenci, byly podrobeny PCR pro detekci blaTEM a qnrS genu. Celkem bylo připraveno šest bakteriálních lyzátů. PCR byla provedena ve zkumavce PCR obsahující bakteriální lyzát jako templát DNA (1 µl) s konečným objemem 12 µl obsahujícím DNA 2x premix (6 µl), 5 pmol každého primeru (1 µl) a deionizovanou vodu (4 µl). PCR byla provedena v termocykleru a podmínky cyklování pro bla TEM a qnrS byly: počáteční denaturace při 94 °C po dobu 5 min, následovaná 32 cykly amplifikace s denaturací při 94 °C po dobu 30 s, žíháním při 50 °C po dobu 30 s (blaTEM) a 55 °C po dobu 30 s (qnrS) a extenzí při 72 °C po dobu 1 min, zakončenou závěrečnou extenzí při 72 °C po dobu 7 min. Produkty PCR očekávané velikosti byly přečištěny a sekvenovány za použití stejných primerů, které byly použity k vytvoření produktů PCR.

Statistické analýzy

Jak bylo popsáno, pro sběr dat byla použita validovaná bangladéšská verze dotazníku. Vyplněné formuláře pro sběr dat byly překontrolovány supervizory sběru dat. Náhodně vybraných 10 % laboratorních analýz bylo provedeno dvakrát jinou výzkumnou osobou, aby byla zajištěna autenticita laboratorních údajů a aby bylo možné posoudit zkreslení mezi výzkumníky. Ověřené údaje byly zadány a následně analyzovány pomocí datového editoru IBM SPSS statistics (verze 21). Chybějící údaje byly z bivariační analýzy vyloučeny. Popisné statistiky byly uváděny jako četnosti, procenta a průměry, případně spolu se směrodatnou odchylkou. Antimikrobiální citlivost testovaných bakterií byla hodnocena pomocí třítypové kategoriální hodnotící škály jako citlivá (antibiotikum označeno jako plně účinné), středně citlivá (označeno jako částečně účinné) a rezistentní (označeno jako neúčinné). Pro testování asociací mezi kategoriálními údaji byl použit Pearsonův chí-kvadrát test a případně byla použita Yateova korekce na spojitost. Jako taková byla vypočtena expozice antimikrobiálním látkám pro získání genu rezistentního vůči antibiotikům. Pro ověření síly asociace byl vypočten korelační koeficient. Při porovnávání průměrů spojitých proměnných byly provedeny nezávislé výběrové t-testy. Dvouvýběrová p-hodnota menší než 0,05, byla považována za statisticky významnou.

Výsledky

Demografické údaje studijního souboru

Odpovídali jsme pacientům, kteří navštěvovali lékaře Gonosatha Medical College s komplikacemi spojenými s UTI. Do studie jsme zahrnuli 147 pacientů, kteří měli závažné klinické příznaky. Z nich bylo 36 (24,5 %) mužů a zbývajících 111 (75,5 %) žen. U pacientů s UTI byl tedy zjištěn téměř trojnásobný počet žen ve srovnání s opačným pohlavím (obrázek 1). Chí-kvadrát test ukázal, že ženské pohlaví souvisí s významně vyšším počtem příhod UTI (p = 0,04). Věkové rozložení případů naší studie leží v rozmezí od méně než jednoho roku do více než 70 let. Nejčastěji se však infekce UTI vyskytovala ve věkové skupině mezi 21-30 lety. Celkové rozložení případů podle věku bylo popsáno v tabulce 1. Celkem pět z 12 stafylokoků (42 %) bylo identifikováno ve věkové skupině 21-30 let. Nebyl pozorován žádný jiný trend ve věkovém rozložení infekce grampozitivní infekcí UTI.

Obrázek 1. Distribuce grampozitivních a gramnegativních bakterií u mužů a žen. Ženy měly významně vyšší počet UTI než muži, které byly způsobeny gramnegativními bakteriemi. V případě grampozitivní infekce močových cest vykazovali muži a ženy stejnou zranitelnost

Tabulka 1. Věk -rozdělení studovaných pacientů s UTI

Izolace a identifikace gram-pozitivních původců UTI

Vyšetřili jsme 147 vzorků moči od klinicky symptomatických pacientů. Kultivační médium CLED produkovalo různé barevné kolonie pro různé patogeny UTI. Grampozitivní Staphylococcus aureus zde vytváří žluté kolonie a Staphylococcus saprophyticus bílé až nažloutlé kolonie a Enterococcus spp vytváří bezbarvé až žluté kolonie. Gramnegativní bakterie produkují různé jiné barvy. Proto identifikace bakterií UTI na základě pozorování barev kolonií na CLED může být předpokládaná, ale obtížně uzavíratelná. Tyto pravděpodobné grampozitivní kolonie jsme z kultivačního média CLED subkultivovali na Mannitol Salt Agar (MSA) a inkubovali přes noc při 37 °C. Růst kolonií na MSA byl bílý až nažloutlý a růžový. Bakterie z MSA byly podrobeny barvení podle Grama a byla zjištěna grampozitivní povaha. Předběžně byly touto studií identifikovány grampozitivní bakterie UTI druhu Staphylococcus. K určení etiologie na druhovou úroveň lze provést analýzu analytického profilovacího indexu (API) a/nebo sekvenování 16sRNA DNA. Zjistili jsme 12 grampozitivních původců UTI, což bylo 8,2 % z celkové populace původců.

Vzorce antimikrobiální rezistence grampozitivních izolátů UTI

Diskový difuzní experiment vytvořil na Muller-Hintonově (MH) agaru zřetelné zóny bakteriálního trávníku, což svědčí o citlivosti příslušných antibiotik, která tam byla impregnována. Naproti tomu rezistentní izoláty nevytvořily jasné zóny ani v přítomnosti disku s antibiotikem. Při našem hodnocení byl pozorován smíšený trend citlivosti vůči testovaným antibiotikům. Nejvyšší rezistence byla zjištěna vůči nitrofurantoinu (91,7 %), následoval amoxicilin (83 %), ofloxacilin (50 %). Jako velmi účinné léky byly shledány gentamicin i amikacin, u nichž byla zjištěna rezistence pouze v 8,3 % (obr. 2).

Obr. 2. Antibiotika, která byla nalezena na trhu s antibiotiky. Prevalence rezistence k antibiotikům u grampozitivních bakterií UTI.
AMC: Amoxicilin; LOM: Lomefloxacin; OFX: OFX: Ofloxacin; CN: Gentamicin; AK: Amikacin; F: Nitrofurantoin. Amikacin a gentamicin se ukázaly jako nejúčinnější antibiotika proti grampozitivním bakteriím UTI. Nitrofurantoin byl mezi testovanými antibiotiky shledán nejméně účinným.

Geny rezistentní vůči antibiotikům u grampozitivních uropatogenů

Ze všech 12 grampozitivních izolátů jsme připravili vzorky DNA metodou tepelného varu. Buněčné stěny grampozitivních bakterií jsou obvykle mnohem pevnější než u gramnegativních bakterií, což může mít vliv na uvolnění DNA při metodách tepelného vaření. V současné analýze jsme zkoumali beta-laktamový kruh obsahující gen bla-TEM rezistentní vůči antibiotikům a zjistili jsme, že dva izoláty (2/6, 33 %) izolátů jsou pozitivní. Podobně jsme kontrolovali gen rezistentní k antibiotikům fluorochinolonové skupiny qnr-S a nalezli jsme tři izoláty pozitivní (3/6, 50 %).

Diskuse

Infekce močových cest představují jedno z nejčastějších onemocnění, s nimiž se setkáváme v lékařské praxi, způsobují významnou přidruženou morbiditu a vyskytují se od novorozenců až po seniory . Prevalence infekcí se může lišit podle věku, pohlaví a některých predispozičních faktorů. Většina hlášených infekcí UTI byla způsobena gramnegativními bakteriemi, především Enterobacteriaceae. Existovaly také silné důkazy proti grampozitivní infekci UTI . Snažili jsme se zjistit prevalenci grampozitivních původců UTI v bangladéšské populaci. Empirická léčba močových infekcí na základě kritérií závažnosti a klinických příznaků přináší velkou výzvu . Vzhledem k tomu, že antibiotická léčba grampozitivních bakterií je zcela odlišná od léčby gramnegativních původců UTI, existuje vysoká pravděpodobnost, že empirickým přístupem dojde k nesprávné léčbě. Proto je správná diagnóza s testováním citlivosti na specifická antibiotika nezbytně nutná pro stanovení jakéhokoli léčebného postupu. Vzhledem k tomu, že UTI je v Bangladéši běžným komunitním onemocněním , nakazí se tímto onemocněním každoročně významné procento populace. Cílem studie bylo ověřit antimikrobiální citlivost i grampozitivních původců UTI. Zjistili jsme přibližně 8,2 % grampozitivních etiologií UTI, zejména Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus a Enterococcus spp, které se připojily k dříve publikovaným zprávám .

Obvykle byla infekce UTI zaznamenána mnohem častěji u žen než u mužů . Nepravděpodobně jsme zjistili, že polovina grampozitivních infekcí byla hlášena u mužů. Předběžné výsledky ukázaly, že muži jsou ve srovnání s celkovou situací více ohroženi grampozitivní infekcí. Věkové rozložení našich studovaných případů leží v rozmezí od méně než jednoho roku do více než 70 let. Nejčastěji se však grampozitivní infekce UTI vyskytovala ve věkové skupině mezi 21-30 lety, jak je doloženo i jinde .

Antibiotická rezistence uropatogenů se v Bangladéši stala problémem veřejného zdraví. V této studii byly stanoveny profily citlivosti grampozitivních UTI patogenů na antibiotika se šesti různými antibiotickými disky a pomocí diskového difuzního testu. Nejvyšší procento rezistence bylo zjištěno vůči nitrofurantoinu, zatímco nejnižší procento rezistence bylo zjištěno vůči amikacinu a gentamicinu. Méně než 10 % grampozitivních uropatogenů se ukázalo být rezistentních vůči těmto dvěma antibiotikům aminoglykosidové skupiny. Výsledky podporují aminoglykosid jako lék volby pro grampozitivní patogeny UTI. Ze skupiny chinolonových antibiotik bylo nejvyšší procento rezistence zjištěno u lomefloxacinu 2. generace (75 %). Výsledky našeho antibiogramu ukázaly, že nitrofurantoin nebyl příliš účinným léčivem pro grampozitivní bakterie UTI. Staré beta-laktamové antibiotikum amoxicilin bylo slabě funkční proti grampozitivním původcům UTI. Fluorochinolonová antibiotika, ofloxacilin a lomefloxacin, byla shledána středně účinná.

Izoláty byly testovány na vybrané AMR geny pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) s použitím primerů specifických pro detekci bla-TEM a qnrS. Přibližně 33 % izolátů bylo pozitivních na bla-TEM a 50 % bylo pozitivních na qnrS. Byly detekovány geny rezistentní k antibiotikům a vykazovaly soulad s fenotypovým vzorcem citlivosti. Přestože se s maximální upřímností a nasazením zkoumalo provedení studie, nemohla překročit omezení, protože velikost vzorku nebyla dostatečně velká. I přes toto omezení snad toto zjištění studie pomůže klinickým lékařům rozhodujícím se o předepisování antibiotik na základě studie založené na důkazech. Lékař by měl před předepsáním empirické antibiotické léčby dbát na konkrétní diagnózu, zejména u mužských UTI.

Etické prohlášení

Tato studie byla schválena Etickou a výzkumnou komisí Jahangirnagarské univerzity, Fakulty biologických věd, a od pacientů s UTI a lékařů byl získán ústní souhlas.

Poděkování

Autoři by rádi poděkovali příslušným pacientům a lékařům za spolupráci. Autoři děkují za přispění pracovníkům všeobecné laboratoře, oddělení mikrobiologie, Jahangirnagar University.

Zveřejnění

Tato práce byla částečně podpořena grantem Grant for Advance Research (GARE), Ministry of Education a The Ministry of Science and Technology Research Grant, Bangladéš, Dr. Md. Salequl Islam.

1. Stamm WE, Norrby SR (2001) Urinary tract infections: disease panorama and challenges. J Infect Dis 183: S1-S4.
2. Hooton TM (2012): Klinická praxe. Nekomplikované infekce močových cest. J Infect Dis 366: 1028-1037. Epub 2012/03/16.
3. Piette A, Verschraegen G (2009) Role koaguláza-negativních stafylokoků v onemocnění člověka. Vet Microbiol 134: 45-54.
4. Edwards MS, Baker C (2005) Streptokokové infekce skupiny B. (Group B streptococcal infections). GROUP 12:c0060.
5. Matthews SJ, Lancaster JW (2011) Infekce močových cest u starší populace. Am J Geriatr Pharmacother 9: 286-309.
6. Kline KA, Lewis AL (2016) Grampozitivní uropatogeny, polymikrobiální infekce močových cest a nově vznikající mikrobiota močových cest. Microbiol Spectr 4: 2.
7. Clouse K, Shehabi A, Suleimat AM, Faouri S, Khuri-Bulos N, et al. (2019) High prevalence of Group B Streptococcus colonization among pregnant women in Amman, Jordan. BMC pregnancy and childbirth 19: 177.
8. de Sousa VS, da-Silva APS, Sorenson L, Paschoal RP, Rabello RF, et al. (2017) Staphylococcus saprophyticus Recovered from Humans, Food, and Recreational Waters in Rio de Janeiro, Brazil. Int J Microbiol 2017: 4287547
9. Lee DH, Klinkova O, Kim JW, Nanjappa S, Greene JN (2019) A Case Series of Staphylococcus lugdunensis Infection in Cancer Patients at an Academic Cancer Institute in the United States. Infect Chemo 51: 45-53.
10. Kunin CM (1994) Infekce močových cest u žen. Clin Infect Dis 18: 1-10.
11. Croxen MA, Finlay BB (2010) Molekulární mechanismy patogenity Escherichia coli. Nat Rev Microbiol 8: 26-38.
12. Grude N, Tveten Y, Kristiansen BE (2001) Infekce močových cest v Norsku: bakteriální etiologie a citlivost. Retrospektivní studie klinických izolátů. Clin Microbiol Infect 7: 543-547.
13. Falagas ME, Giannopoulou KP, Kokolakis GN, Rafailidis PI (2008) Fosfomycin: použití mimo infekce močových cest a gastrointestinální infekce. Clin Infect Dis 46: 1069-1077.
14. Stamm WE, Counts GW, Running KR, Fihn S, Turck M a další (1982) Diagnostika koliformní infekce u akutně dysurických žen. N Engl J Med 307: 463-468.
15. Detweiler K, Mayers D, Fletcher SG (2015) Bakterurie a infekce močových cest u starších osob. Urol Clin North Am 42: 561-568.
16. Arshad M, Seed PC (2015) Infekce močových cest u kojenců. Clin Perinatol 42: 17-28.
17. Tien BYQ, Goh HMS, Chong KKL, Bhaduri-Tagore S, Holec S, et al. (2017) Enterococcus faecalis Promotes Innate Immune Suppression and Polymicrobial Catheter-Associated Urinary Tract Infection. Infect Immun pii: e00378-17.
18. Vasquez V, Ampuero D, Padilla B (2017) Infekce močových cest u hospitalizovaných pacientů: tato výzva. Rev Esp Quimioter 30: S39-S41.
19. Hooton TM, Stamm WE (1997) Diagnostika a léčba nekomplikované infekce močových cest. Infect Dis Clin North Am 11: 551-581.
20. Medina M, Castillo-Pino E (2019) Úvod do epidemiologie a zátěže infekcí močových cest. Ther Adv Urol 11: 1756287219832172.
21. Wallmark G, Arremark I, Telander B (1978) Staphylococcus saprophyticus: častá příčina akutní infekce močových cest u ambulantních pacientek. J Infect Dis 138: 791-797.