Abstrakt

Odůvodnění. Pro snížení úmrtnosti pacientů je nutná včasná detekce grampozitivní bakteriémie a včasná vhodná antimikrobiální léčba. Účelem naší studie bylo zhodnotit výkonnost kultivačního testu na grampozitivní bakterie Verigene (BC-GP) ve dvou speciálních zdravotnických zařízeních a určit potenciální dopad rychlého kultivačního testu na grampozitivní bakterie v rámci japonského systému poskytování zdravotní péče. Studie dále zahrnovala simulované krevní kultury, které obsahovaly knihovnu dobře charakterizovaných izolátů Staphylococcus aureus rezistentních vůči meticilinu (MRSA) a enterokoků rezistentních vůči vankomycinu (VRE) odrážejících různé zeměpisné oblasti Japonska. Metody. Na klinických a simulovaných krevních kulturách bylo provedeno celkem 347 testů BC-GP. Výsledky BC-GP byly porovnány s výsledky získanými referenčními metodami pro rodovou/druhovou identifikaci a detekci genů rezistence pomocí molekulárních metod a metodiky MALDI-TOF MS. Výsledky. Pro identifikaci a detekci genů rezistence na dvou klinických pracovištích a simulovaných krevních kulturách byla celková shoda BC-GP s referenčními metodami 327/347 (94 %). Doba identifikace a detekce antimikrobiální rezistence pomocí BC-GP byla významně kratší ve srovnání s rutinním testováním zejména v kardiologické nemocnici, která o víkendech a svátcích nenabízí služby klinické mikrobiologie. Závěr. BC-GP umožnila přesnou identifikaci a detekci markerů rezistence ve srovnání s rutinními laboratorními metodami pro grampozitivní organismy ve specializovaných klinických zařízeních a poskytla rychlejší výsledky než současné rutinní testování.

1. Úvod

Gram-pozitivní bakterie jsou nejčastějšími mikroorganismy spojenými se sepsí ve zdravotnických zařízeních a nejčastější příčinou bakteriémie u pacientů po transplantaci krvetvorných kmenových buněk . Enterokoková bakteriémie je spojena se zvýšeným rizikem úmrtí u pacientů s transplantací krvetvorných kmenových buněk bez ohledu na citlivost na vankomycin . Na kardiologických odděleních jsou hlavními infekcemi infekční endokarditida, infekční aneurysma, infekce krevního řečiště související s katétrem nebo infekce v místě chirurgického výkonu po kardiochirurgických operacích, jejichž nejčastějšími původci jsou grampozitivní koky . Na obou zdravotnických pracovištích je včasná detekce grampozitivních a rezistentních markerů velmi důležitá pro řízení péče o pacienty, správu antibiotik a prevenci šíření rezistentních mikroorganismů.

Jelikož včasný zásah antimikrobiální terapií je spojen se zlepšením prognózy, přičemž každá hodina prodlení je spojena se zvýšenou úmrtností, je rychlá diagnostika kriticky důležitá . Verigene Gram-positive blood culture assay (BC-GP) (Nanosphere, Inc., Northbrook, IL) je systém mikročipů od vzorku k výsledku pro identifikaci běžných grampozitivních bakterií a hlavních markerů rezistence přímo z pozitivní krevní kultury. Ačkoli řada studií již dříve hodnotila BC-GP a uváděla výkonnost v rozmezí 92 až 99 % shody s konvenční metodikou , jedním z omezení předchozích zpráv bylo, že mnoho studií pocházelo ze Spojených států a také ze zemí mimo Japonsko, přičemž v Japonsku byla publikována pouze jedna zpráva s omezeným rozsahem .

Genetické rozdíly mezi bakteriálními liniemi kolujícími v různých zeměpisných oblastech světa mohou ovlivnit citlivost molekulárních testů založených na oligonukleotidových sondách pro detekci organismů nebo markerů rezistence. Studie v Hongkongu a Belgii uvádějí nižší účinnost BC-GP .

Účelem této studie bylo zjistit potenciální dopad BC-GP na léčbu pacientů a její výsledky ve specializovaných hospitalizačních zařízeních v prostředí japonské zdravotní péče, která čelí řadě problémů. Stále více stárnoucí populace a s ní spojená zátěž v podobě rostoucích celkových nákladů na zdravotní péči představují výzvu pro zdravotnickou infrastrukturu. Přestože methicilin-rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA) představuje v Japonsku více než 90 % nemocničních infekcí způsobených rezistentními bakteriemi , v mnoha zdravotnických zařízeních je v rámci snižování nákladů běžné outsourcování testování klinické mikrobiologie nebo nepokrytí víkendů. Tento článek představuje první komplexní hodnocení BC-GP v Japonsku s cílem ověřit jeho klinickou výkonnost. Studie simulovaných krevních kultur zahrnuje knihovnu dobře charakterizovaných kmenů MRSA spojených se zdravotní péčí (HA-MRSA), MRSA získaných v komunitě (CA-MRSA) a enterokoků rezistentních vůči vankomycinu (VRE), které cirkulují v Japonsku.

2. V rámci této studie byla provedena simulace kultivace krve. Metody

BC-GP byl hodnocen v nemocnici Toranomon (TH) a Sakakibara Heart Institute (SHI) v souladu s protokoly studie schválenými institucionální revizní komisí pro dané pracoviště v období od 26. června 2012 do 6. března 2013. TH je všeobecná fakultní nemocnice s 1168 lůžky a jednotkou hematologické péče pro transplantace krvetvorných buněk se 123 lůžky, která provádí 140 až 160 transplantací krvetvorných buněk ročně. Mikrobiologická laboratoř v nemocnici funguje denně v denních hodinách. SHI je fakultní nemocnice se 320 lůžky specializující se na kardiovaskulární onemocnění s počtem více než 1 500 operací na otevřeném srdci ročně. Mikrobiologickou laboratoř v nemocnici provozuje externí komerční referenční laboratoř. Mikrobiologická laboratoř pracuje během denní směny ve všední dny a o víkendech a svátcích je uzavřena.

Kultivace krve byly v SHI prováděny pomocí lahviček BacT/ALERT FA a monitorování pomocí BacT/ALERT 3D (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francie). V TH byly použity lahvičky BACTEC Plus a monitorování pomocí BACTEC 9240 a FX (Becton Dickinson, Franklin Lakes a NJ). Do studie byla zahrnuta pouze jedna pozitivní lahvička s krevní kulturou obsahující grampozitivní koky nebo bacily na jednoho pacienta. Dva ml pozitivního média pro kultivaci krve byly uchovávány při -85C pro opakované testování.

Běžná mikrobiologická identifikace a testování citlivosti izolátů byly prováděny pomocí konvenčních identifikačních testů, jako je rozpustnost ve žluči, citlivost na optochinový disk a systém MicroScan WalkAway (Beckman Coulter, Pasadena, CA) u TH a systém Vitek 2 (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francie) u SHI. Screening cefoxitinu na rezistenci k meticilinu byl proveden podle pokynů CLSI . Byl rovněž využit latexový aglutinační test pro detekci proteinu vázajícího penicilin PBP2a .

BC-GP testování bylo provedeno u pozitivních krevních kultur vykazujících grampozitivní organismy podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, dobře promíchaný vzorek 350 μl média krevní kultury byl pipetován do jamky pro vzorek v zásobníku pro extrakci nukleových látek BC-GP, umístěn na přístroj Verigene Processor SP ke zpracování a analýze přístrojem Verigene Reader.

Bylo provedeno hodnocení s cílem určit časový rozdíl mezi hlášením výsledků pomocí BC-GP a identifikací na základě kultivace a výsledků antimikrobiální citlivosti pro 139 pozitivních vývarů krevních kultur. U výsledků založených na kultivaci představovala doba potřebná do vygenerování konečného hlášení dobu mezi odečtením Gramova barvení a zadáním konečných výsledků identifikace a citlivosti do laboratorního informačního systému. Pro BC-GP byla dobou potřebnou k získání výsledku doba mezi odečtením Gramova barvení a zadáním výsledků BC-GP do laboratorního informačního systému.

Pro vyhodnocení BC-GP byla sestavena sada 208 simulovaných krevních kultur s použitím typů, referenčních kmenů a klinických kmenů z různých zeměpisných oblastí Japonska. Klinické kmeny zahrnovaly organismy, které představovaly výzvu pro komerční identifikační systémy v předchozích klinických studiích v TH a SHI. Kromě toho byla testována také knihovna dobře charakterizovaných kmenů HA-MRSA, CA-MRSA a VRE z Japonska. Studie simulovaných krevních kultur byly provedeny v lékařské laboratoři Miroku (město Saku, prefektura Nagano, Japonsko). Dvě stě osm kmenů bylo upraveno na zákal přibližně 100 CFU/ml ve sterilním fyziologickém roztoku. Tři sta μl bylo naočkováno do lahví BACTEC Plus Aerobic/F obsahujících 8 až 10 ml lidské plné krve (krevní skupina O, Tennessee Blood Services, Memphis, TN) pro konečné inokulum 30 CFU/lahvičku. Lahvička BACTEC Plus Anaerobic/F byla také naočkována pro S. pneumoniae a skupinu S. anginosus. Každá láhev byla inkubována v systému BACTEC, dokud se neobjevil pozitivní signál. Pokud BC-GP generoval negativní výsledky, bylo znovu testováno 11násobné ředění kultivačního média pomocí sterilní destilované vody.

Každý z pozitivních izolátů krevních kultur na obou pracovištích nemocnice byl uchováván v 10% odstředěném mléce (Difco) při -85C. Druhová identifikace byla potvrzena pomocí hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí s ionizací matrice v čase letu (MALDI-TOF MS) (Microflex LT s Biotyper ver. 3.0; Bruker Daltonik GmbH, Brémy, Německo) pro všechny kmeny. Pokud organismus nebyl identifikován na druhové úrovni pomocí MALDI-TOF MS (hodnota skóre < 2,0) nebo byl identifikován jako Micrococcus, Listeria, Staphylococcus jiný než S. aureus, Streptococcus jiný než S. pyogenes a S. agalactiae, bylo provedeno potvrzující testování pomocí PCR-přímého sekvenování 16S rDNA nebo sodA na Juntendo University nebo Tokyo Women’s Medical University . Byla provedena specifická PCR pro detekci mecA u všech stafylokoků a vanA, vanB u všech enterokoků . Metody použité pro SCCmec typizaci MRSA získaných v komunitě nebo ve zdravotnictví, které byly použity k charakterizaci kmenů, byly již dříve popsány .

Soulad byl stanoven ve srovnání s výsledky referenčních metod. Shoda existovala, pokud se cílová detekce BC-GP shodovala s referenční metodou na úrovni rodu nebo druhu. Devadesáti pětiprocentní intervaly spolehlivosti (95% CI) a párový -test byly stanoveny pomocí programu GraphPad StatMate (GraphPad Software Inc, San Diego, CA).

3. Výsledky

V této studii byla celková identifikační shoda mezi BC-GP a referenční metodou 327/347 (94 %) pro prospektivní krevní kultury na dvou klinických pracovištích a simulované krevní kultury. Kombinovaná shoda mezi PCR a BC-GP pro detekci mecA byla 71/73 (97 %) pro prospektivní krevní kultury a simulované krevní kultury.

Kombinovaná přesnost identifikace z obou nemocničních pracovišť byla 129/139 (93 %). U monomikrobiálních kultur byla přesnost identifikace 121/124 (98 %). Shoda mezi PCR a BC-GP pro pozitivitu mecA byla 51/53 (96 %). V tabulce 1 jsou uvedeny výsledky z TH. Celkem 96/104 (92 %) organismů bylo pomocí BC-GP správně identifikováno na druhové nebo rodové úrovni včetně detekce genů rezistence. Jak ukazuje tabulka 2, celková shoda BC-GP s referenční metodou u SHI byla 33/35 (94 %) organismů.

BC-GP uvádí přítomnost mecA pouze pro S. aureus a S. epidermidis. V této studii bylo ze 102 stafylokokových kmenů 72 buď S. aureus, nebo S. epidermidis. Nesouhlasné výsledky byly způsobeny nedetekovatelnými mecA organismy S. epidermidis v polymikrobiálních kulturách obsahujících jak mecA pozitivní, tak mecA negativní S. epidermidis. Z 30 stafylokoků jiných než S. epidermidis a S. aureus bylo 21 (70 %) pozitivních na mecA, včetně 2 S. lugdunensis, které nemohly být hlášeny jako mecA pozitivní pomocí BC-GP.

Tabulka 3 ukazuje časový rozdíl mezi vytvořením výsledků BC-GP a konečnou identifikací na základě kultivace a výsledky antimikrobiální citlivosti v obou nemocnicích. Výsledky BC-GP byly k dispozici v průměru 28,2 až 51,0 hodin před konečnou identifikací a výsledky citlivosti na základě kultivace v TH. V SHI byly výsledky BC-GP generovány v průměru o 34,5 až 196,6 hodin dříve. Při porovnání doby do získání konečných výsledků identifikace a citlivosti na základě kultivace v TH a SHI vyžadovaly s výjimkou S. aureus výsledky pro S. epidermidis a koaguláza-negativní stafylokoky jiné než S. epidermidis, enterokoky a streptokoky významně () delší dobu v SHI (83,3, 123,6, 159,1, resp. 199,1 hodin) ve srovnání s TH (40,8, 53,9, 36,1 a 53,5 hodin).

Při použití simulovaných grampozitivních krevních kultur BC-GP správně identifikoval 198/208 (95 %) organismů (tabulka 4). Šest streptokoků (3 %) bylo buď identifikováno nesprávně, nebo je BC-GP identifikoval pouze na úrovni rodu. Pokud jde o 4 falešně negativní lahvičky s krevní kulturou BC-GP, 1 S. pyogenes byl správně identifikován a 1 S. mitis vytvořil pozitivní signál rodu Streptococcus/S. pneumoniae po 11násobném zředění média krevní kultury. Gen mecA byl pomocí BC-GP detekován u 20/20 (100 %) organismů MRSA představujících kmeny získané v komunitě (SCCmec typu IIa, IV a V) a kmeny spojené se zdravotní péčí (SCCmec typu I, IIb, III a netypizovatelné). BC-GP detekoval 14/14 (100 %) genů vanA a 20/20 (100 %) genů vanB u dobře charakterizovaných kmenů VRE z předchozích studií v Japonsku.

4. Diskuse

Výkon BC-GP pozorovaný v naší studii byl podobný předchozím zprávám . Vzhledem k tomu, že služby klinické mikrobiologie jsou v mnoha nemocnicích v Japonsku outsourcovány nebo nefungují během pracovních dnů mimo směny a o víkendech a svátcích jsou zavřené, má rychlé diagnostické testování významný potenciál ovlivnit péči o pacienty tím, že výrazně zkracuje dobu do identifikace organismu a výsledků citlivosti na antimikrobiální látky.

BC-GP detekuje mecA u všech stafylokoků na základě měření intenzity signálu; hlášení je však omezeno na S. aureus a S. epidermidis na základě algoritmu, ve kterém je mecA hlášen pouze v případě, že je BC-GP detekován S. aureus nebo S. epidermidis. Budoucí verze BC-GP by měly zvážit úpravu algoritmu tak, aby umožňoval hlášení detekce mecA u jiných stafylokoků než S. aureus nebo S. epidermidis, protože 70 % z 30 kmenů jiných než S. aureus a S. epidermidis v naší studii bylo rezistentních vůči meticilinu. Ačkoli S. epidermidis je hlavním koaguláza-negativním stafylokokovým patogenem, jiné stafylokoky, jako S. lugdunensis a S. haemolyticus, jsou důležitými patogeny ve zdravotnickém prostředí .

Polymikrobiálně pozitivní krevní kultury generovaly většinu diskordance. Naproti tomu výkonnost BC-GP byla 121/124 (98 %) u monomikrobiálních klinických krevních kultur a 198/208 (95 %) u simulovaných krevních kultur. V této studii tvořily polymikrobiální krevní kultury 14/106 (13 %), resp. 3/33 (9 %) pozitivních krevních kultur u TH a SH. Dohromady představovaly polymikrobiální kultury 17/139 (12 %) prospektivních klinických krevních kultur, což je v souladu s předchozími studiemi uvádějícími 6 až 20 % všech infekcí krevního řečiště jako polymikrobiální . BC-GP správně identifikoval všechny organismy u 12/17 (70 %) polymikrobiálních kultur. V předchozích studiích BC-GP se míra správné identifikace u polymikrobiálních kultur pohybovala od 57 do 86 % . Vzhledem k tomu, že zavádějící informace mohou ovlivnit klinickou diagnózu a vést k nevhodnému výběru antimikrobiálních látek, je třeba porozumět omezením BC-GP.

Dalším problémem u polymikrobiálních kultur je klinická interpretace detekce mecA a stafylokoků. V našich 17-polymikrobiálních kulturách byly u 5 vzorků nalezeny 2 nebo 3 stafylokokové kmeny s nebo bez mecA. To může vést ke zbytečnému použití vankomycinu nebo podcenění infekce způsobené meticilin-rezistentními stafylokoky. Opakování BC-GP na další sadě krevních kultur může snížit riziko tohoto problému. U monomikrobiálních kultur nebo simulovaných kultur byly všechny nesrovnalosti pozorovány u streptokoků s výjimkou 1 kmene S. caprae. Nesprávná identifikace BC-GP u streptokoků zahrnovala 2 S. mitis identifikované jako S. pneumoniae, nezjištění 2 S. pneumoniae, 2 S. anginosus group a 2 S. pyogenes. Předchozí zprávy rovněž uváděly podobné výsledky pro S. mitis, S. oralis a S. pneumoniae . Vzhledem k tomu, že genetická příbuznost mezi S. mitis, S. oralis a S. pneumoniae je dobře známa na základě >99% homologie sekvencí genu 16S rRNA , výsledky BC-GP pro S. pneumoniae nebo Streptococcus s alfa-hemolýzou bez pozitivních druhově specifických signálů by měly být pečlivě interpretovány a potvrzeny konvenčními metodami, jako je citlivost na optochin nebo test rozpustnosti ve žluči. Zajímavé je, že jedenáctinásobné ředění původního média krevní kultury může vést k detekci signálu Streptococcus a druhového signálu (tabulka 4). Byl zaznamenán rozsah detekce v závislosti na organismu pomocí BC-GP .

Hlavní výhodou využití BC-GP je dřívější čas pro hlášení identifikace a determinantů rezistence z pozitivních krevních kultur, což umožňuje dřívější výběr vhodné antimikrobiální terapie a zavedení opatření pro kontrolu infekcí, jako je izolace a kontaktní prevence . To má potenciál významně ovlivnit japonský systém poskytování zdravotní péče. Časový rozdíl mezi výsledky BC-GP a konečnými výsledky identifikace a citlivosti na základě kultivace uvedený v tabulce 3 u TH je v souladu s předchozími zprávami . Na druhé straně dřívější výsledky 80,7 až 196,6 hodin pro jiné organismy než S. aureus při použití BC-GP v SHI odrážejí nedostupnost služeb klinické mikrobiologie během víkendů a svátků. Vzhledem k tomu, že služby klinické mikrobiologie jsou v mnoha nemocnicích v Japonsku outsourcovány nebo omezeny na jednu směnu během pracovních dnů nebo nejsou nabízeny během víkendů, jsou potenciální náklady a přínosy zachování služeb kultivace krve v nemocnicích významné. Školení laboratorního personálu ve všeobecné laboratoři v rozpoznávání grampozitivních koků a bacilů navíc umožní provádět vyšetření BC-GP o víkendu i ve večerních/nočních hodinách. BC-GP poskytuje nemocnicím možnost zachovat si vlastní velmi důležitou laboratorní službu.

Závěrem lze říci, že BC-GP poskytla přesnou identifikaci a detekci markerů rezistence ve srovnání s rutinními kultivačními laboratorními metodami pro grampozitivní organismy včetně kmenů CA-MRSA, HA-MRSA a VRE cirkulujících v Japonsku. Minimalizace času potřebného k optimalizaci antimikrobiální léčby pomocí BC-GP může přispět ke snížení nákladů a zlepšení péče o pacienty. V roce 2016 získal BC-GP v Japonsku regulační schválení a stal se tak prvním vícecílovým molekulárním testem pro pozitivní krevní kultury schváleným jako diagnostický prostředek in vitro na pomoc při diagnostice bakteriálních infekcí krevního řečiště. K ověření nákladové efektivity BC-GP v kontextu japonského systému poskytování zdravotní péče budou nutné další studie.

Etické schválení

Tato studie byla schválena interními revizními komisemi TH a SHI.

Konkurenční zájmy

Všichni autoři deklarují, že nemají žádné konkurenční zájmy.

Přínos autorů

Ken Kikuchi navrhl a provedl studii a vypracoval rukopis. Mari Matsuda, Shigekazu Iguchi, Tomonori Mizutani, Kaori Sansaka, Kenta Negishi, Kimie Shimada, Shigeyuki Notake, Hideji Yanagisawa a Reiko Yabusaki provedli laboratorní práce. Keiichi Hiramatsu, Michiru Tega-Ishii, Jun Umemura, Hiroshi Takahashi, Hideki Araoka a Akiko Yoneyama dohlíželi na sběr dat a koordinovali a podíleli se na přípravě studie.

Poděkování

Tato studie byla částečně podpořena grantem (S0991013) Ministerstva školství, kultury, sportu, vědy a technologie Japonska (MEXT) pro nadaci strategických výzkumných projektů na soukromých univerzitách.

.