ahol w az agar tömegszázalékos aránya37. Feltételezve, hogy w = 0,3%, a diffúziós képesség 4,01×10-2 mm2 min-2, amely a tanulmány további részében használt érték. A diffúziós képesség alig változik az agar mennyiségével, ezért a w elhanyagolható hatással van az eredményekre. Ezekből a mennyiségekből kiszámítjuk az arányt

amely a terjedés relatív sebességének dimenzió nélküli mértékét adja. Δ kis értékeinél a tápanyag gyorsabb időskálán diffundál, mint a sejtnövekedés, ami azt jelenti, hogy a tápanyagkoncentráció bármilyen helyi változása szétoszlik anélkül, hogy befolyásolná a kolónia morfológiáját. A Δ 1 vagy annál nagyobb értéke azt jelzi, hogy a sejtnövekedés legalább akkora sebességgel történik, mint a tápanyag diffúziója, és a tápanyagkoncentráció helyi változásai hatással lehetnek a kolónia morfológiájára. A három kísérleti kép közül csak az irányított növekedés képe rendelkezik elegendő információval a Δ kiszámításához szükséges skála és idő tekintetében is. Ebből a képből azt találjuk, hogy Δ ≈ 0,23. A modellben s = 3 és c0 = 1 beállítása 0,3 és 0,5 közötti Δ értékű megoldásokat eredményez, ami a kísérleti eredményekkel azonos nagyságrendű, és így megfelelő összehasonlítást biztosít. Az alfejezet további részében ezeket a paraméterértékeket használjuk. A viselkedést mindhárom esetben az alábbiakban ismertetett térbeli indexek segítségével tovább számszerűsítjük, hasonlóan Binder et al.38 megközelítéséhez. Mindegyik szimuláció egy L x = L y = 200 dimenziójú rácsot használ, amely elég nagy ahhoz, hogy megfelelő felbontású jellemzőket hozzon létre, ugyanakkor számítási szempontból hatékony legyen.

Az ágszűrés (I. jelenség) vizsgálatához a tápanyagot egyenletesen, véletlenszerűen vetjük el a tartományban, és egyetlen cellát helyezünk a rács közepére. A szimulációt addig futtatjuk, amíg a teljes sejtsűrűség el nem éri a 0,2 értéket, amit a 2. ábrán látható reprezentatív kolónia szemléltet. Ez a kolónia a kezdeti központi sejt helyéről kiinduló nagy ágakkal rendelkezik, amelyek között rövidebb ágak vannak, amelyeket a nagyobb ágak elzárnak a tápanyagtól, és jelentős nem egyenletes növekedést mutat. Ez megegyezik a Matsushita & Fujikawa12 által megfigyelt viselkedéssel. A morfológiát úgy lehet számszerűsíteni, hogy először megszámoljuk az egyes sejtekhez tartozó, az óramutató járásával ellentétes irányban mért szögeket valamilyen referenciaszögtől, amelynek origója a tömegközéppontban van. A számlálásokat az egyenletesen véletlenszerűen eloszló sejtek várható értékeivel skálázzuk, és a nem egyenletes növekedés I θ szögindexét úgy határozzuk meg, hogy az a skálázott számlálások szórása, így az I θ nagyobb értékei a nem egyenletes növekedés nagyobb mértékét jelzik. A kísérleti kép indexe 0,18, míg a szimulációé 0,2, ami azt jelzi, hogy a kettő közel egyezik.

A taszító telepek esetében (II. jelenség) a tápanyagot ismét egyenletesen, véletlenszerűen helyezzük el a tartományban. Két magcellát helyezünk el függőlegesen a tartományon belül középen, vízszintesen a tartomány szélességének egy-egy nyolcadával távolabb a középponttól úgy, hogy a cellákat a teljes tartomány szélességének egynegyede válassza el egymástól. A szimulációt addig számoljuk, amíg a teljes cellasűrűség el nem éri a 0,2 értéket. Egy tipikus szimuláció látható a 2. ábrán, amely a Matsushita & Fujikawa12 által megfigyelt két telep közötti távolságot mutatja. A taszító telepeket úgy lehet számszerűsíteni, hogy a szimuláció végén megszámoljuk a teljes ν sejtek számát és a két magsejt közötti ν c sejtek számát. A taszítás indexe ekkor I c = 1 – ν c /ν, amely közel 0,5, ha a két kolónia egyenletesen növekszik, kisebb, mint 0,5, ha rés alakul ki, és nagyobb, mint 0,5, ha a kolóniák előnyben részesítik az egymás felé történő növekedést. A kísérleti képen az egyes kolóniák magsejtjeinek helyét úgy közelítjük meg, hogy vonalakat húzunk az ágak mentén, és azonosítjuk, hogy ezek hol metszik egymást. A kísérleti kép és a szimuláció indexe 0,19, illetve 0,27, ami arra utal, hogy mindkettő hasonló növekedési mintázatot produkál a két kolónia közötti jelentős réssel.

Az irányított növekedést (III. jelenség) úgy szimuláljuk, hogy kezdetben minden tápanyagot a tartomány jobb szélső oszlopába helyezünk, egyetlen sejtet pedig a tartomány közepére. A szimulációt ezután addig számoljuk, amíg a sejtsűrűség el nem éri a 0,1-et. Egy tipikus kolónia látható a 2. ábrán, amely nagyon hasonlít Matsushita & Fujikawa12 kísérleti eredményéhez. A tartomány egyik oldala felé irányuló torzítás méréséhez kiszámítjuk a tartomány jobb oldalán lévő sejtek I b arányát az összes sejthez viszonyítva, úgy, hogy I b ∈ . Az I b index 0,5 közeli értékei kis torzítást jeleznek, míg az I b < 0,5 a jobb oldal felé való torzítást, az I b < 0,5 pedig a bal oldal felé való torzítást. A kísérleti kép indexe 0,92, ami nagyjából megfelel a 0,93-as szimulációs indexnek. Mindkét esetben az indexek nagy növekedési torzítást jeleznek a kezdeti tápanyaghely felé.

Amint azt Ginovart et al.30 is megállapította, a kísérleti képek és a szimulációk közötti jó minőségi egyezés azt mutatja, hogy a DLG önmagában képes a B. subtilis telepek szűrését, taszítását és irányított növekedését előidézni. Ezt az összehasonlítást tovább erősítettük a kísérletek és egy matematikai modell közötti kvantitatív összehasonlítással. Így azt várjuk, hogy ezek a jelenségek jelen vannak, ha a DLG befolyásolja a morfológiát, míg e jellemzők hiánya arra utal, hogy más mechanizmusok felelősek a növekedési mintázatért. Lényeges, hogy a diszkrét modell és a Ginovart et al. által javasolt modell közötti egyezés azt mutatja, hogy az itt alkalmazott diszkrét modell kielégítően reprezentálja a DLG-t, és így használható e viselkedés számszerűsítésére.

Inducing DLG

Miután megmutattuk, hogy a diszkrét modell képes reprodukálni a DLG viselkedését, itt számszerűsítjük e jelenségek függését a modell paramétereitől, hogy megjósoljuk, mikor lép fel DLG hatás. A kolóniákat ismét egy L x = L y = 200 méretű rácson szimuláljuk, ugyanazokat a három kezdeti feltételt és megállási kritériumokat alkalmazva, mint az előző alfejezetben. A szimulációkat 50-szer ismételjük meg minden egyes s = 1, 5, …, 37 tápanyaglépcsőpárra és c0 = 1, 2, …, 7 kezdeti koncentrációra. Minden paraméterpárra kiszámítjuk a vonatkozó átlagos indexet az 50 realizáláson keresztül.

Az elágazásszűrés (I. jelenség) vizsgálatához egyetlen sejtből, egységes tápanyagmezőben növesztett kolóniákat tekintünk, a megfelelő \({\bar{I}}}_{\theta }\) átlagos indexértékekkel a 3. ábrán látható 50 realizáláson keresztül. Az \({\bar{I}}}_{\theta }\) legnagyobb értékei akkor jelentkeznek, ha mind s, mind c0 kicsi, ami két tényezőnek köszönhető. Először is, mivel a tápanyag diffúziója, ténylegesen s, kicsi a sejtnövekedés sebességéhez képest, a tápanyagszintek ingadozása alakul ki a tartományban. Másodszor, az alacsony kezdeti c0 tápanyagkoncentráció azt jelenti, hogy ezek az ingadozások olyan területeket hoznak létre, ahol a tápanyagszint túl alacsony a sejtnövekedéshez. Ha s vagy c0 nagyobb, legalább az egyik feltétel nem fordulhat elő, és \({\bar{I}}}_{\theta }\) értéke kisebb lesz, ami azt jelzi, hogy a DLG már nincs jelentős hatással a kolóniára. Ezek az eredmények tehát azt mutatják, hogy a nem egyenletes mintázatok csak akkor fordulhatnak elő, ha mind a tápanyag diffúziója a sejtnövekedés sebességéhez képest, mind a tápanyagkoncentráció kicsi.

A DLG hatásának mérése szimulált mikrobiális kolóniákban. Minden szimulációt a rácsalapú modellel számoltunk, s tápanyaglépcsők és c0 kezdeti tápanyagkoncentrációk tartományával. Az ábrán (a) az \({\bar{I}}}_{\theta }\) átlagos index \({\bar{I}}}_{\theta }\) az ágszűrésre (I. jelenség), (b) az \({\bar{I}}}_{c}\) átlagos index \({\bar{I}}_{c}\) a kolóniák taszítására (II. jelenség), és (c) az \({\bar{I}}}_{b}\) átlagos index \({\bar{I}}_{b}\) az irányított növekedésre (III. jelenség).

Hasonló viselkedés figyelhető meg a taszító esetben (II. jelenség), amint az a 3. ábrán ábrázolt \({\bar{I}}}_{c}\) átlagos indexből látható. Az index legnagyobb értékeit s és c0 kis értékeinél találjuk, ami ugyanazokból az okokból következik be, mint az \({\bar{I}}}_{\theta }\) esetében.

Az irányított növekedés (III. jelenség) esetében más a viselkedés, amint az a 3. ábrán látható \({\bar{I}}}_{b}\) átlagos indexből látható. Kis s értékeknél az \({\bar{I}}}_{b}\) index nagy, és kevéssé változik a c0 értékkel. Az s növekedésével az \({\bar{I}}}_{b}\) csökken, és nagyobb függést mutat a c0 értéktől, kisebb c0 értéknél az \({\bar{I}}_{b}\) értékei nagyobbak. Az irányított növekedés megfigyelhető paraméterértékek tartománya sokkal nagyobb, mint a másik két DLG-jelenség esetében. Ezért, ha az irányított növekedés nem következik be, akkor a másik két jellemző sem fog, és így az irányított növekedés a DLG egy hasznos, egyszerűen mérhető első ellenőrzését biztosítja. Ezt a jellemzőt fogjuk használni a DLG tesztelésére a munka hátralévő részében.

Kontinuum modell

A DLG jelenségek megjelenése a két faj tápanyagkoncentrációjától és diffúziós képességétől egyaránt függ. Míg az indexek ezeknek a jelenségeknek a függését mérik a diszkrét tápanyaglépések s számától és a c0 kezdeti tápanyagkoncentrációtól, addig a Δ értékét csak a szimulált adatokból lehetett kiszámítani, nem pedig a modell bemeneteként megadni. Kísérleti adatokat figyelembe véve azonban természetes, hogy a sejtek és a tápanyag relatív terjedését Δ-vel jellemezzük, mivel ez könnyen mérhető a kísérleti képekből. Itt bevezetünk egy determinisztikus reakció-diffúziós egyenletrendszert, amely modellezi a sejtsűrűséget és a tápanyagkoncentrációt, és lehetővé teszi az egyes mennyiségek relatív diffúziójának megadását, ami egyenértékű a Δ beállításával. Bár ez a modell nem alkalmas a 2. ábrán megfigyelt finom vonások megragadására, képes reprodukálni a tápanyagforrás felé irányuló irányított növekedést (III. jelenség), amely a paraméterek legnagyobb tartományában jelentkezett. Ezért a DLG-nek erre az aspektusára összpontosítunk, amely könnyen mérhető jele annak, hogy DLG történik.

Egy egydimenziós tartományt tekintünk, amely elegendő a modell általános viselkedésének szemléltetéséhez29,32,39. A 3. szakaszban leírt dimenziótlan x pozíció, t idő, n(x,t) sejtsűrűség és g(x,t) tápanyagkoncentráció felhasználásával az irányadó egyenletek a következőre redukálódnak:

$$\frac{\partial m}{\partial t}=D\frac{{{\partial }^{2}m}{\partial {x}^{2}}}\,+mn,$$$

(3a)

$$$\frac{\partial n}{\partial t}=\frac{{\partial }^{2}n}{\partial {x}^{2}}}-\,cmn\mathrm{.}$$

(3b)

A D = D m /D n paraméter a sejt diffúziós képességének D m és a tápanyag diffúziós képességének D n aránya. Ez hasonló a Δ (2) definíciójához, a sejtdiffúziós képességet használva a kolónia területének mért változásának mértéke helyett. Mindkét egyenlet jobb oldalán az első kifejezés a diffúzió hozzájárulását jelenti, míg a második kifejezések a tápanyagfogyasztást, illetve az új sejtek növekedését, ahol c az új sejtenként elfogyasztott tápanyag dimenziótlan mennyisége.

Kezdeti feltételként a sejteket a tartomány közepén helyezzük el, a tápanyag pedig a

$$$m(x\mathrm{,0)}={e}^{-L{(x-0.5)}^{2}},$$

(4a)

$$$n(x\mathrm{,0)}=N{e}^{-L{(x-0.75)}^{2}}},$$

(4b)

ahol N értelmezhető dimenziótlan tápanyagkoncentrációként. Az általános viselkedés szemléltetésére a 4. ábrán az N = 1 kezdeti feltételek láthatóak.

Az egydimenziós reakció-diffúziós modell eredményei. (a) Az N = 1 kezdeti feltétel esetén a sejtek a tartomány közepén koncentrálódnak, a tápanyag pedig jobbra van. (b) Az I b maximális értékei a t = 1 időpontig a D és N 10-es bázisú logaritmusával szemben ábrázolva azt sugallják, hogy a DLG csak bizonyos paraméterértékek mellett fordul elő. Két reprezentatív példa van jelölve. (c) Az I b legnagyobb értékénél, amikor D = 10-6 és N = 1, a sejtek még mindig csaknem szimmetrikusak x = 0 körül, miközben a tápanyagkoncentráció gyakorlatilag egyenletessé vált. (d) D = 10-0,5 és N = 105 alkalmazása jelentős torzítást eredményez a jobb oldal felé, ahol a tápanyag eredetileg koncentrált volt.

A 3. szakaszban megadott tipikus paraméterértékeket fixnek véve az N értéke csak a fizikai tápanyagkoncentráció miatt változik. Ha csak tápanyagot tartalmazó, maximális koncentrációt képviselő közeget veszünk figyelembe, akkor azt találjuk, hogy az N értéke nem lehet nagyobb, mint kb. 105. A megoldásokat tehát 1 ≤ N ≤ 105-re számoljuk ki. Míg a tipikus kísérleti megfigyelések szerint 10-3 ≤ D ≤10-1, mi 10-6 ≤ D ≤103 értékeket veszünk figyelembe, hogy elméletileg megvizsgáljuk, hogyan változik a viselkedés a D-vel. E paraméterek különböző értékeire kiszámítjuk a t = 1 időpontig megfigyelt I b maximális értékét. Ez körülbelül 119 napos növekedésnek felel meg, ami, bár nagyobb, mint a tipikus kísérleti idők, biztosítja, hogy az I b maximális értéke a szimuláció során megfigyelhető legyen. A kiszámított I b indexeket a 4. ábrán ábrázoljuk, mindkét tengelyen 10-es bázisú logaritmikus skálát használva. Log(N) < 1 esetén a sejtek növekedése – az I b által mért értékek szerint – alig vagy egyáltalán nem torzul. Az N nagyobb értékeinél a megfigyelt torzítás mértéke a D értékétől függ, a maximum (D,N) = (1, 105) közelében jelentkezik. Ez a D-érték azonos nagyságú sejt- és tápanyagdiffúziónak felel meg, és ezen érték körül már 101,5 N értéknél is megfigyelhető torzítás a növekedésben. Tipikus kísérleti körülmények között az N nagyságrendje 2, ami azt jelzi, hogy a DLG-hatások leginkább akkor figyelhetők meg, ha a D közel van az egységhez.

A viselkedés tartományát tovább szemlélteti két ellentétes példa eloszlásainak vizsgálata. Mindkét esetben a megoldás a maximális cellahajlásnak megfelelő időpontban látható. A 4. ábrán látható D = 10-6 és N = 1 esetén a tápanyag-koncentráció ténylegesen egyenletessé vált, mielőtt a sejtsűrűség nyilvánvaló torzulás alakulhatna ki a jobb oldal felé, ahol a tápanyag kezdetben koncentrált volt. Ezzel szemben, ha D = 10-0,5 és N = 105, szintén a 4. ábrán ábrázolva, a sejtek nyilvánvaló preferenciát mutatnak a tartomány jobb oldala felé.

A kontinuum modell elemzése azt sugallja, hogy ha \(D\ll 1\), akkor az irányított növekedés, és így bármilyen DLG hatás csak legalább 103-nál nagyobb N értékeknél jelentkezik. Mivel a becslések szerint az N nagyságrendje 2, ez azt sugallja, hogy a DLG csak akkor figyelhető meg, ha a D közel van az egységhez, amint az a 4. ábrán látható. Ez fizikai paraméterekkel is szemléltethető. A 3. szakaszban megadott paraméterértékeket használva, az \({D}_{m}=3\times {10}^{-2}\)mm2 min-1 diffúziós képességű mikrobák egy olyan környezetben, ahol a maximális kezdeti tápanyagkoncentráció \({N}_{0}\mathrm{=3.8}\times {10}^{-3}\)g mm-2, körülbelül a D = 0.75 és N = 104 dimenziótlan értékeknek felelnek meg. A 4. ábra alapján várható, hogy ez a faj egy tápanyagforrás felé növekszik, és így DLG viselkedést mutat. Ha ugyanezeket a mikrobákat olyan környezetbe helyeznénk, ahol a maximális tápanyagkoncentráció \({N}_{0}\mathrm{=3.8}\times {10}^{-6}\)g mm-2, akkor az N értéke 10-re csökkenne, és már nem lenne megfigyelhető torz növekedés. E szakasz eredményei tehát keretet biztosítanak annak azonosítására, hogy mikor várható a DLG előfordulása pusztán a D és N becslései alapján.

Kísérleti összehasonlítások

A modelljóslatok vizsgálata után most ezeket felhasználjuk a mikrobiális kolóniákban uralkodó növekedési mechanizmus azonosítására. Az 1. ábrán látható három reprezentatív kísérleti példát tekintjük: a B. subtilis baktérium két kolóniáját és az S. cerevisiae egy kolóniáját. Mivel nem ismerjük a D diffúziós arány megfelelő értékét, amelyet a reakció-diffúziós modell megkövetel, a növekedést ehelyett a Δ (2) relatív terjedéssel jellemezzük. Ez a paraméter a kolónia területében felülről nézve bekövetkező átlagos változás sebességének és a glükóz diffúziós képességének arányát jelenti, és a képekből mérhető. Mivel a tápanyag egyenletesen van eloszlatva, és csak egyetlen kolónia növekszik, bármilyen DLG ezekben a példákban várhatóan szabálytalan növekedésként jelentkezik, ágszűréssel (I. jelenség).

A Δ m növekedési sebesség kiszámított értékeit az 1. táblázat tartalmazza, a megfelelő relatív Δ sebességgel együtt. Ezek az értékek azt mutatják, hogy a B. subtilis telepek két nagyságrenddel gyorsabban nőnek, mint az élesztő kolónia, és egy nagyságrenddel lassabban, mint a glükóz diffúziós képessége. A kezdeti tápanyagkoncentrációra vonatkozó tipikus értékek használata azt sugallja, hogy a kísérletek egy olyan N értéknek felelnek meg, amely nagyságrendileg 2-es nagyságrendű. Ennek a becslésnek és a Δ értékeknek a megfeleltetése a 4. ábra modelleredményeinek azt jelzi, hogy a B. subtilis egy olyan rezsimnek felel meg, amelyben a DLG miatt irányított növekedés következik be. Mivel ezt a becslést a S. cerevisiae kolónián belüli p sejtburjánzási sebesség mérésével végezték, amely valószínűleg kisebb, mint a baktériumokra vonatkozó megfelelő érték, ez várhatóan alulbecsüli az N értékét, és az N nagyobb értéke növeli a DLG megfigyelésének valószínűségét. Ezzel szemben a S. cerevisiae kolónia Δ értéke -3 nagyságrendű, ami azt jelzi, hogy a tápanyag sokkal gyorsabb időskálán diffundál, mint a sejtnövekedésé. Ennek következtében a tápanyagkoncentráció bármilyen helyi változása várhatóan eloszlik, mielőtt hatással lenne a kolónia morfológiájára. Ez azt jelzi, hogy a morfológiát nem befolyásolja a DLG. Így a baktérium- és élesztőtelepek alakja közötti erős hasonlóság ellenére alacsony tápanyagtartalmú környezetben a két morfológia különböző jelenségeknek köszönhető. A baktériumtelepek elég gyors időskálán növekednek ahhoz, hogy a tápanyagdiffúzió korlátozhatja a növekedést, ami szabálytalan mintázatot eredményez. Az élesztőtelepek sokkal lassabb növekedése azt jelenti, hogy a DLG nem fordulhat elő, és ehelyett az alacsony tápanyagtartalmú környezetben kialakuló nem egyenletes kolóniamorfológiáknak kizárólag az álhifák növekedésének kell következniük.

Eredményeink további megerősítésére törekedtünk az irányított növekedés (III. jelenség) vizsgálatával a S. cerevisiae kolóniáiban, a Matsushita & Fujikawa12 által és a szimulációkban használt elrendezést utánozva40. Egy Petri-csészét szintetikus, alacsony ammóniumtartalmú dextrózzal (SLAD) töltöttek meg, a tápanyagot a Petri-csésze közepére helyezve. Az élesztősejteket a középponttól különböző távolságokra vetettük, és 16 napos növekedés után lefényképeztük. A kísérlet további részleteit a 3. szakasz tartalmazza. A korlátozott tápanyagként glükózt és ammónium-szulfátot is használtunk, az 5. ábra reprezentatív képeket mutat. A képek úgy vannak tájolva, hogy a petri-csésze közepe, ahová a tápanyagot helyezték, a jobb oldalon van. Az ammónium diffúziós képessége vízben megközelítőleg 9,84×10-2 mm2 min-1 41 . Mivel ez ugyanolyan nagyságrendű, mint a glükóz diffúziós képessége, mindegyik tápanyagforrás várhatóan hasonló Δ értéket eredményez. Egyik kolónia sem mutat észrevehető torzítást a növekedésben egyik irányban sem, és mindkettő I b torzítási indexe majdnem pontosan 0,5 értékű. A Δ m effektív diffúzitást és a Δ dimenziótlan diffúzitást minden egyes kísérletre vonatkozóan a 2. táblázat tartalmazza. Mindkét esetben Δ nagyságrendje -3, ami azt jelzi, hogy irányított növekedés nem figyelhető meg, és megegyezik a korábbi kísérletek eredményeivel.

A S. cerevisiae-vel végzett irányított növekedési kísérletek képei. A képek úgy vannak tájolva, hogy a megfelelő tápanyag a telep jobb oldalán van, amint azt a függőleges szöveg jelzi. A kolóniákat a) SLAD-G-n (jobbra hozzáadott glükózzal) és b) SLAD-N-n (jobbra hozzáadott ammónium-szulfáttal) növesztettük. A méretarányos sávok 5 mm-t jelölnek.

A növekedési mód további bizonyítékát adja a telepek széléhez közeli viselkedés. A SLAD-N-en nevelt kolónia határa körül egyértelmű jelei vannak a nem egyenletes növekedésnek, de a SLAD-G-n nevelt kolónián nem. Ha ez a mintázat a DLG-nek köszönhető, akkor mindkét táptalajon hasonló viselkedést várnánk. Ismert azonban, hogy a diploid élesztők, mint például az ebben a kísérletben használt AWRI796 törzs, pszeudohifa növekedésre térnek át, ha megvonják tőlük a nitrogént2 , például a SLAD-N-t. Ez arra utal, hogy az 1. ábrán látható élesztőtelepeken megfigyelt nem egyenletes növekedés pszeudohifa növekedésnek és nem DLG-nek köszönhető.